La creazione di substrati Patterned bidimensionali per confinamento di proteine ​​e cellule

Bioengineering

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Summary

Monostrati auto-assemblati (SAM) formato da tioli alcani a catena lunga su oro fornire ben definito substrati per la formazione di pattern proteico delle cellule e di confino. Stampa microcontact di hexadecanethiol utilizzando un (PDMS) polidimetilsilossano timbro seguita da riempimento con un glicole-terminated alcano tiolo monomero produce un modello in cui proteine ​​e cellule di assorbire solo alla regione timbrato hexadecanethiol.

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Johnson, D. M., LaFranzo, N. A., Maurer, J. A. Creating Two-Dimensional Patterned Substrates for Protein and Cell Confinement. J. Vis. Exp. (55), e3164, doi:10.3791/3164 (2011).

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Abstract

Stampa microcontact fornisce un metodo rapido e altamente riproducibile per la creazione di ben definite substrati fantasia. 1 Durante la stampa microcontact può essere impiegato per stampare direttamente un gran numero di molecole, tra cui le proteine, DNA 2, 3 e silani, 4 la formazione del sé monostrati-assemblati (SAM) dal tioli alcani a catena lunga in oro fornisce un modo semplice per limitare le proteine ​​e le cellule di specifici modelli contenenti regioni adesivo e resistente. Questo confinamento può essere utilizzato per controllare la morfologia delle cellule ed è utile per l'esame di una serie di domande di proteine ​​e di biologia cellulare. Qui, descriviamo un metodo generale per la creazione di ben definiti i modelli per lo studio delle proteine ​​cellulari 5 Questo processo prevede tre fasi:. La produzione di un maestro di fantasia utilizzando fotolitografia, stampa la creazione di un francobollo PDMS, e microcontatto di un oro- substrato rivestito. Una volta modellato, questi substrati di coltura cellulare sono in grado di confinare le proteine ​​e / o cellule (cellule primarie o linee cellulari) per il modello.

L'uso di auto-assemblati chimica monostrato consente un controllo preciso sulla fantasia di proteine ​​/ cella regioni adesive e non adesive regioni; questo non può essere realizzato utilizzando stampaggio diretto delle proteine. Hexadecanethiol, la lunga catena tiolo alcano utilizzato nel passaggio stampa microcontact, produce una superficie idrofoba che assorbe facilmente le proteine ​​dalla soluzione. Il glicol-terminated tiolo, utilizzato per il riempimento non stampate regioni del substrato, crea un monostrato che è resistente a proteine ​​e quindi la crescita delle cellule. 6 Questi monomeri tiolo produrre monostrati strutturate che definire con precisione le regioni del substrato in grado di supportare proteine ​​e la crescita cellulare. Come risultato, questi supporti sono utili per una vasta gamma di applicazioni da studio del comportamento intercellulare 7 alla creazione della microelettronica 8.

Mentre altri tipi di chimica monostrato sono stati utilizzati per studi su colture cellulari, compreso il lavoro del nostro gruppo utilizzando trichlorosilanes per creare modelli direttamente su substrati di vetro, 9 monostrati fantasia formato da alcano tioli su oro sono straight-forward per la preparazione. Inoltre, i monomeri utilizzati per la preparazione monostrato sono disponibili in commercio, stabile, e non richiedono la conservazione o la manipolazione in atmosfera inerte. Substrati preparati con fantasia tioli alcano possono essere riciclati e riutilizzati più volte, mantenendo la reclusione cellula 10.

Protocol

1. Preparazione del Master Patterned (Figura 1)

  1. Centrare il wafer di silicio sulla spin-verniciatore e risciacquare il wafer con acetone durante la fase iniziale dei due cicli programma di centrifuga nella tabella 1. L'acetone evapora durante la seconda fase del programma di centrifuga lasciando un pulito, asciutto wafer.
  2. Applicare circa 1 ml AZ9245 photoresist / a (di diametro) al wafer e spin-coat con le condizioni descritte nella tabella 1.
  3. Soft-cuocere il photoresist rivestite di wafer a 110 ° C per 2 m con un alta uniforme cottura.
  4. Photopattern il substrato utilizzando una diretta-scrittura sistema di fotolitografia o di un sistema allineatore maschera e maschera appropriata. Le maschere possono essere acquistati da un certo numero di fonti commerciali. Inoltre, lucidi stampati con inchiostri UV assorbenti, nastro adesivo ad un piano ottico, possono essere utilizzati per la produzione di modelli con caratteristiche di grandi dimensioni.
  5. Sviluppare la fantasia in wafer 01:02 400K sviluppatore: semiconduttori acqua deionizzata di grado per 1 m 45 s e scuotendo con cautela. Sciacquare abbondantemente con semiconduttori acqua deionizzata di grado e asciugare con un flusso di azoto (N 2) di gas. Modello di sviluppo può essere controllato utilizzando un microscopio con un filtro UV. Se il modello non è pienamente sviluppato, il wafer possono essere restituiti alla soluzione di sviluppo per più tempo.

Nota: Per risultati ottimali, photopatterning deve essere effettuata in un ambiente di camera bianca.

2. Preparazione del PDMS Timbro (Figura 2)

  1. Preparare una 10:01 in resina peso: miscela indurente di Sylgard 182 (PDMS) e coprire completamente il master (wafer photopatterned) con la miscela in un piatto di Petri usa e getta.
  2. De-gas-PDMS coperto master in un essiccatore a vuoto fino a quando non bolle sono visibili e permettono il timbro di curare in un forno a 65 ° C per 1,5 h. Prima di curare, è importante assicurarsi che il master è alla base del piatto in quanto può salire in superficie durante la degassificazione passo.
  3. Tagliare il PDMS eliminare del maestro e tagliare alla dimensione appropriata. Conservare il timbro in un recipiente coperto (lato caratteristica verso l'alto) per proteggerlo dalla polvere e detriti.

3. Preparazione del substrato di oro Patterned (Figura 3)

  1. Preparare 25 millimetri no. 1 coprioggetto di vetro rotondo per la deposizione di metallo trattandoli con plasma di ossigeno per 10 m. Sciacquare due volte con 18,2 MΩ acqua deionizzata seguito da due volte con etanolo, asciugare con un flusso di N 2 gas tra un passo.
  2. Utilizzando un multi-pocket a fascio elettronico sistema di deposizione, deposito del 50 Å titanio seguita da 150 Å oro. Non sfogare l'evaporatore tra deposizione dello strato di titanio e strato d'oro. In alternativa, oro rivestite coprioggetto possono essere acquistati da una varietà di fornitori, però, è importante che gli strati di metallo sono preparati da evaporazione a fascio elettronico ed evaporazione non termica. Se acquistato da una fonte esterna, substrati d'oro può essere pulito per ossidazione del plasma o "Piranha" (07:03 Conc H 2 SO 4: 30%. H 2 O 2) 11 prima dell'uso.

Nota: "Piranha" La soluzione è esplosivo in presenza di composti organici.

  1. Preparare la soluzione di stampaggio, 10 hexadecanethiol mM in etanolo assoluto, e la soluzione di riempimento, 1 mM glicole terminata tiolo in etanolo assoluto.
  2. Sciacquare il timbro con etanolo e asciugare bene con N 2 gas. Applicare stampaggio soluzione al timbro PDMS goccia a goccia fino a completo rivestimento. Asciugare accuratamente con il timbro N 2 gas. Procedere alla 5a o 5b a seconda dei casi sulla base delle caratteristiche del francobollo PDMS.
    1. Premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e consentire il monostrato di formare per 15 s.
    2. Posizionare il substrato di oro in una scatola Petri contenente 18,2 MΩ acqua deionizzata, assicurando il substrato è sommerso. Premere delicatamente il timbro sul substrato d'oro e consentire il monostrato di formare per 15 s.
  3. Sciacquare il substrato timbrato due volte con etanolo, asciugare con N 2 gas dopo ogni lavaggio e collocare il substrato in una capsula di Petri.
  4. Coprire il substrato con soluzione di riempimento e sigillare il piatto con parafilm per evitare l'evaporazione.
  5. Lasciare che il monostrato di fondo per formare al buio per 12-14 h.
  6. Rimuovere il coprioggetto modellata dalla soluzione riempimento e lavare due volte con etanolo, asciugare con N 2 gas dopo ogni lavaggio.

4. L'applicazione di proteine ​​e cellule al substrato Patterned

  1. Posizionare il coprioggetto fantasia in una piccola scatola di Petri o cultura camera di cellulare e coprire con 500 microlitri di 1 ml di fosfato Dulbecco Buffered Saline (DPBS). Il DPBS deve avvolgere completamente il substrato durante l'incubazione delle proteine ​​per garantire la copertura anche delle proteine.
  2. Aggiungere una soluzione concentrata di proteine ​​al DPBS e mescolare la soluzione da tuboTing parecchie volte. Incubare la miscela proteica con il substrato a 37 ° C per 1 h. Concentrazioni finali per la laminina e fibronectina sono tipicamente 12 mg / ml e 20 mg / ml, rispettivamente. Proteine ​​possono essere etichettati con una ammina colorante fluorescente reattivi per consentire la visualizzazione schema facile. Tuttavia, le proteine ​​etichettate deve essere miscelato 1:1 con proteine ​​senza etichetta l'etichettatura proteina può interferire con l'attività biologica.
  3. Dopo l'incubazione, lavare abbondantemente con il substrato DPBS (4-5x) per rimuovere le proteine ​​non legato, avendo cura di non asciugare il substrato o portarlo in aria-acqua. Dopo i primi tre risciacqui, aggiungere circa 500 ml di mezzi di comunicazione completo crescita cellulare per mantenere un substrato umido.
  4. Sostituire i mezzi di crescita utilizzata per risciacquare il substrato con mezzi freschi.
  5. Dissociare e contare le cellule per la placcatura sul substrato. In entrambi i casi le cellule dissociate primari, come i neuroni dell'ippocampo, o linee cellulari immortali, come cellule CHO-K1, possono essere utilizzati.
  6. Piastra di cellule dissociate sul substrato. Tipicamente 30 a 200 cellule / mm 2 sono utilizzati.

5. Rappresentante dei risultati:

Figura 1
Figura 1. Schema generale per la preparazione di un maestro fotolitografia fantasia. In questo processo, un wafer di silicio viene pulito con acetone, rivestito con photoresist, esposti al modello di interesse, e il modello è sviluppato.

Figura 2
Figura 2. Generali schema per la preparazione timbro PDMS. In questo processo, il maestro fantasia è coperta da Sylgard (10:1 resina: indurente), degassati in un essiccatore a vuoto, curato in forno a 60 ° C, e tagliati su misura.

Figura 3
Figura 3. Schema generale per la patterning substrato. In questo processo, substrati di vetro sono rivestite di titanio (50 bis) e oro (150A) utilizzando un evaporatore a fascio di elettroni, modellata da hexadecanethiol microcontatto stampa con un timbro PDMS, riempito con glicole tioli terminato alcano, e ricoperto con le proteine ​​fluorescenza-etichettati.

Figura 4
Figura 4. Patterned master (A) e PDMS bollo (B), preparati con i metodi descritti. Barre di scala sono 100μm.

Figura 5
Figura 5. SAM Patterned visualizzati con AlexaFluor 647-etichettati fibronectina (A) e CHO-K1 confinamento delle cellule (B). Barre di scala sono 100 micron.

Figura 6
Figura 6. Patterned laminina seminato con E18 topo neuroni dell'ippocampo a 4 giorni in vitro. AlexaFluor 350-coniugato anti-laminina anticorpale è utilizzato per la visualizzazione schema (A) e la E18 topo neuroni dell'ippocampo sono colorati con MitoTracker Rosso 580 (B). Barre di scala sono 100 micron.

Figura 7
Figura 7. Potenziali insidie ​​per la preparazione del substrato fantasia visualizzati da AlexaFluor 647-coniugato fibronectina adsorbimento. (A) porta insufficiente miscelazione delle proteine ​​irregolari. (B) l'applicazione non uniforme della pressione durante stampaggio porta al trasferimento parziale Patten. (C) Una pressione eccessiva durante stampaggio può portare a timbro collasso. (D) Esposizione della superficie modellata all'interfaccia aria acqua durante il risciacquo può provocare delle proteine ​​sfondo. Barre di scala sono 100 micron.

Figura 8
Figura 8. Patterning sommersi in grado di produrre modelli con caratteristiche di piccole dimensioni che sono difficili da stampare stampa microcontact convenzionale in aria. Immagini (A) e (B) mostrano diverse regioni dello stesso modello, stampato con lo stesso timbro PDMS in aria (A) o acqua deionizzata (B). 10μm a livello di linee di sostegno che circondano il modello (aggiunto per aiutare a prevenire il collasso di bollo) si vedono in (A), tuttavia, le caratteristiche di punti inferiore come mostrato in (B) non si vedono. Questo dimostra che la stampa in aria funziona bene per le grandi caratteristiche, ma la stampa in acqua può essere necessario per i modelli con caratteristiche più piccoli. Barre di scala sono 20 micron.

Ciclo Tasso di accelerazione (giri / s) Velocità finale (rpm) Tempo (s)
1 500 1000 5
2 3800 3800 30

Tabella 1.Due cicli programma di centrifuga utilizzata per creare un rivestimento di 4,5 micron di spessore AZ9245 su un wafer di silicio.

Per preparare i francobolli PDMS per la formazione di fantasia substrati, un master in photoresist è il primo fabbricato (Figure 1 e 4A). Il master è l'inverso del timbro e viene creato utilizzando una diretta-scrittura o di un sistema di litografia allineatore maschera. Quando un photoresist positivo, come AZ9245, è utilizzato per la produzione di master, la resistenza rivestita wafer viene esposto alla luce con lo stesso modello che apparirà sul supporto finale. Mentre non è sempre possibile, è stato segnalato che il rapporto di aspetto ideale (dimensione caratteristica di resistere spessore) per i maestri timbro PDMS è di 1:2. 13 Abbiamo trovato che proporzioni di 1:40 sono possibili, a seconda della natura del pattern. AZ9245 wafer di silicio ricoperto nelle condizioni descritte qui dare photoresist con uno spessore nominale di 4,5 micron. Abbiamo scoperto che questo spessore di AZ9245 può essere utilizzata per produrre maestri PDMS con caratteristiche che vanno da> 100 micron a 2 micron.

Francobolli PDMS sono espressi da Sylgard 182 (o Sylgard 184) con il maestro fabbricato da photoresist (Figura 2). Maestri photoresist può essere utilizzato più volte per creare molte copie dello stesso stampo. Dopo l'indurimento il PDMS, francobolli vengono rimossi dal master utilizzando una lametta e il timbro risultante può essere visualizzato al microscopio mettendo caratteristica lato timbro su un vetrino di vetro (Figura 4B)

Una corretta risultati stampaggio in un forte, chiaro modello di proteine ​​che possono essere visualizzati mediante l'applicazione di proteina fluorescente (figure 3 e 5). In alternativa, immunoistochimica può essere utilizzato per visualizzare il modello di proteina dopo la fissazione delle cellule (Figura 6). La crescita delle cellule è ben limitato alla proteina modello per entrambe le linee cellulari immortalizzate e cellule primarie (figure 5 e 6).

Mentre questa tecnica è facilmente padronanza, molti problemi comuni possono sorgere. L'applicazione di proteine ​​senza mescolare sufficiente della soluzione proteica concentrata nel DPBS può portare a pattern proteico irregolare (Figura 7A). Stampaggio improprio può portare a trasferire modello di crollo parziale o timbro (Figura 7B-C). Inoltre, esponendo il substrato disegni contenenti proteine ​​adsorbite all'aria possono disturbare il monostrato che causano resistenza diminuita in background (Fig. 7D). Patterns comprende numerose caratteristiche molto piccolo (<5 micron) e proporzioni elevate richiedono spesso l'uso della stampa microcontatto sommerso. In questa procedura acqua (3.5b) è usato come barriera per impedire hexadecanethiol da depositare sul substrato al di fuori del modello (Figura 8) 14.

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Discussion

Un certo numero di problemi possono insorgere nella produzione litografica del master utilizzato per la creazione timbro PDMS. Sottoesposizione di resistere rivestite risultati wafer nei modelli confusa e indistinta e sovraesposizione del resistere rivestite risultati wafer di caratteristiche ingrandita o mancanti. In generale, i maestri con dimensioni caratteristiche di grandi dimensioni (> 10 micron) sono relativamente facili da sviluppare e modello, mentre i maestri con le più piccole caratteristiche possono richiedere l'ottimizzazione dei parametri di ampia photopatterning e sviluppo (oltre i parametri consigliati dal produttore photoresist). I maestri più difficile da produrre combinare entrambe le caratteristiche grandi e piccoli.

Realizzazione di un francobollo PDMS da un maestro è semplice utilizzando la procedura descritta nella sezione 2. Tuttavia, bisogna fare attenzione a mescolare completamente i due componenti di Sylgard 182. Il mancato raggiungimento completa miscelazione dei componenti si tradurrà in una incapacità di indurire il timbro e la probabile distruzione del maestro. Inoltre, il comandante può frantumarsi quando si separa dal timbro PDMS se la forza in eccesso viene utilizzato o torsione si verifica durante la separazione. Se il padrone si rompe nel processo di rimozione del bollo, può ancora essere possibile utilizzare il timbro dopo la pulizia con etanolo. Tuttavia, questo timbro può produrre modelli con siti difetto.

Durante la stampa microcontact di SAM con un timbro PDMS è versatile e può essere utile in molte applicazioni, una serie di passaggi fondamentali da seguire per ottenere successo e confinamento di proteine ​​cellulari. Per ottenere il bene e il confinamento delle proteine ​​cellulari, substrati d'oro deve essere preparato a fascio elettronico deposizione, dal momento che l'evaporazione termica porta a superfici ruvide oro che non supportano un'adeguata formazione monostrato. Inoltre, abbiamo scoperto che come substrato di vetro è pronto per la deposizione di titanio e oro pregiudica la qualità del substrato di oro e di stabilità monostrato. Mentre substrati di vetro può essere pulito per la deposizione utilizzando una grande varietà di tecniche, tra cui il metanolo bollente, "piranha", 11 e soluzione "poiana", 12 nelle nostre mani coprioggetto preparato per ossidazione del plasma sono di gran lunga superiori a lamelle puliti con altri metodi. Abbiamo osservato che i metodi di pulizia con solventi, acidi, e la base-based dare monostrati con diminuzione della stabilità temporale e un maggior numero di siti difetto.

La tecnica di stampaggio esatta richiesta per produrre proteine ​​ottimale e modelli di cellulare varia in base alle dimensioni e la forma delle caratteristiche per essere timbrato e le proporzioni del timbro. Tipicamente, la tecnica di stampaggio esatta per ogni nuovo francobollo deve essere ottimizzato e la tecnica di stampaggio migliora dopo diverse prove. Applicando una pressione eccessiva durante stampaggio porterà a timbro collasso, che è soggetta a verifica con francobolli contenenti proporzioni più grandi (Figura 7C). In alternativa, applicando i risultati pressione troppo poco nel trasferimento schema parziale (Figura 7B). E 'inoltre possibile usufruire della tecnica di stampaggio di modificare leggermente le caratteristiche del modello. Per esempio, abbiamo trovato che le caratteristiche possono essere leggermente aumentata nelle dimensioni, mediante stampaggio per lunghi periodi di tempo e altri hanno riferito che le dimensioni di alcune funzioni può essere ridotto utilizzando le tecniche di stampa microcontact sommerso. 15 Spesso diventano bolle d'aria intrappolate sotto il timbro quando eseguire stampaggio sommerso, ma questa tecnica può dare i migliori risultati quando piccole caratteristiche in collaborazione con proporzioni grandi sono voluti.

Ci sono molti vantaggi di utilizzare stampa microcontact in collaborazione con auto-assemblati chimica monostrato. Quando si stampano direttamente su substrati proteine, cambiamenti conformazionali hanno dimostrato di verificarsi attribuibile al passaggio in cui vengono essiccate le proteine ​​durante il processo di stampaggio 16. Questa fase di essiccazione è pensato per portare all'aggregazione delle proteine ​​e denaturazione, che a sua volta influenza la funzione delle proteine. Nel sistema SAM, assorbire le proteine ​​al substrato da una soluzione acquosa tamponata, identico a come substrati sono in genere preparati per colture cellulari. Inoltre, stampa microcontact di proteine ​​non raggiunge reclusione cella per lunghi periodi di tempo, a causa della mancanza di molecole proteiche fondo resistente. 17 Al contrario, l'uso di un monostrato di fondo glicole prevede la reclusione eccellente. 5 Nel caso in cui l'uso di un substrato di oro è o non è possibile o auspicabile, triclorosilano monomeri possono essere utilizzati invece per consentire la reclusione proteine ​​e cellule. 9 Mentre ci sono metodi per il confinamento di proteine ​​e cellule che non si basano su stampa microcontact, questi metodi tendono ad essere più alta intensità di lavoro e non sono suscettibili di produrre il gran numero di substrati identici tipicamente richiesto per ricerche biologiche. 18,19

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare tutto il gruppo Maurer presso la Washington University, il cui collettivo ha fatto la conoscenza di questo protocollo possibile. Il finanziamento per questo lavoro è fornito dal National Institute of Mental Health (1R01MH085495).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Silicon wafer Wafer Reclaim Services 2 inch
Spin coater/hot plate Brewer Science, Inc. Cee 200CB Spin-Bake System
AZ9245 Photoresist Mays Chemical Company 105880034-1160
Direct-write photolithography system Microtech s.r.l. LW325 LaserWriter System
Mask Aligner HTG 3HR
AZ 400K Developer Mays Chemical Company 105880018-1160
Sylgard 182 Silicone Elastomer Kit Dow Corning
25 mm no. 1 round glass coverslips VWR international 16004-310
Plasma Oxidizer Diener Femto
Titanium piecesKamis Incorporated 99.95% pure
Gold pellets Kamis Incorporated 99.999% pure
Electron-beam evaporator Kurt J. Lesker PVD 75 Thin Film Deposition System with electron-beam accessory
Hexadecanethiol Alfa Aesar A11362
1-mercaptoundec-11-yl)tetra(ethyleneglycol) Sigma-Aldrich 674508
Ethanol Pharmco-AAPER 111000200 200 proof, absolute
Parafilm VWR international 52858-000
DPBS VWR international 4500-434 Without calcium and magnesium
Mouse Laminin I VWR international 95036-762
Human Plasma Fibronectin Invitrogen 33016-015
AlexaFluor® 647 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-20006
MitoTracker Red 580 Invitrogen M22425
AlexaFluor® 350 carboxylic acid, succinimidyl ester Invitrogen A-10168
Anti-laminin antibody Fisher Scientific AB2034MI

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References

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