Fluorescens-basert Måling av Store-opererte Calcium Entry i levende celler: fra Helstøpt Cancer Cell til Skeletal Muscle Fiber

Biology
 

Summary

Omfanget av butikk-opererte Ca

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Pan, Z., Zhao, X., Brotto, M. Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber. J. Vis. Exp. (60), e3415, doi:10.3791/3415 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Oppbevares operert Ca 2 + oppføring (SOCE), tidligere kalt capacitative Ca 2 + oppføring, er en strengt regulert mekanisme for tilstrømningen av ekstracellulært Ca 2 + inn i cellene for å fylle utarmet endoplasmatiske retikulum (ER) eller sarcoplasmic retikulum (SR) Ca 2 + butikker 1,2. Siden Ca 2 + er en allestedsnærværende andre budbringer, er det ikke overraskende å se at SOCE spiller viktige roller i en rekke cellulære prosesser, herunder spredning, apoptose, gentranskripsjon og motilitet. På grunn av sitt store forekomst i nesten alle celletyper, inkludert epitelceller og skjelettmuskulatur, har denne veien fått stor interesse 3,4. Imidlertid er heterogene SOCE egenskaper i ulike celletyper og den fysiologiske funksjon ennå ikke klart 5-7.

De funksjonelle kanal egenskaper SOCE kan bli avslørt av patch-clamp studier, mens en stor mengde kunnskap om This veien har blitt vunnet av fluorescens-baserte intracellulære Ca 2 + målinger på grunn av sin bekvemmelighet og gjennomførbarheten for high-throughput screening. Formålet med denne rapporten er å oppsummere noen fluorescens-baserte metoder for å måle aktivering av SOCE i monolayer celler, hengende celler og muskelfibre 5,8-10. Den mest brukte av disse fluorescens metodene er å direkte overvåke dynamikken i intracellulær Ca 2 + ved hjelp av forholdet mellom F 340nm og F 380nm (510 nm for utslipp bølgelengde) av ratiometric Ca 2 + indikator Fura-2. For å isolere aktiviteten til enveis SOCE fra intracellulær Ca 2 + utgivelsen og Ca 2 + ekstrudering, er en Mn 2 + quenching assay hyppig brukt. Mn 2 + er kjent for å være i stand til å gjennomsyre inn i cellene via SOCE mens den er immun mot overflaten membran ekstrudering prosesser eller til ER opptak av Ca 2 +-pumper på grunn av sin svært høye affinitet viddh Fura-2. Som et resultat, representerer dempe Fura-2 fluorescens indusert av oppføring av ekstracellulære Mn 2 + inn i cellene en måling av aktivitet SOCE 9. Ratiometric måling og MN +2 slukke analyser kan utføres på en kyvette-basert spektrofluorometer i en celle befolkning modus eller i et mikroskop-basert system for å visualisere enkeltceller. Fordelen med encellete målinger er at individuelle celler utsatt for genet manipulasjoner kan velges ved hjelp av GFP eller RFP journalister, slik at studier i genmodifiserte eller muterte celler. De spatiotemporal egenskaper SOCE i strukturelt spesialiserte skjelettmuskulatur kan oppnås i skinned muskelfibrene ved samtidig å overvåke fluorescens av to lav affinitet Ca 2 + indikatorer målrettet mot bestemte avdelinger av muskel fiber, slik som Fluo-5N i SR og Rhod- 5N i tverrgående tubuli 9,11,12.

Protocol

1. Intracellulær Ca 2 + måling for individuelle celler

  1. KYSE-150, en menneskelig øsofageal plateepitelkarsinom (ECSS) cellelinje er dyrket på 5% CO 2 atmosfæren ved 37 ° C i mixed RPMI 1640/Ham 's F-12 medium (1:1) som inneholder 5% fosterets bovint serum.
  2. KYSE-150 celler blir tilført med plasmider enten inneholder shRNA spesifikt mot Orai1 eller en kryptert sekvens. Plasmidene også et gen koding rød fluorescerende protein (RFP) som reporter, som drives av en egen promoter.
  3. Cellene er dyrket i glassbunn retter (nr. 1,5 cover glass, Mattek, MA) i 48 timer.
  4. Fjern medium og skyll cellene med en balansert salt-løsning (BSS) (140 mM NaCl, 2,8 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2, 10 mm HEPES, pH 7,2).
  5. Tilsett 1 ml BSS løsning som inneholder 2 mM Fura-2 Acetoxymethyl ester (molekylære prober) i formen og pakk det hele fatet med folie til Protect mot lys.
  6. Inkuber cellene for 40 min ved 37 ° C og deretter la dem for en ekstra 15 min periode ved romtemperatur for å tillate ester hydrolyse å bli fullført. Vask cellene med BSS to ganger.
  7. Monter parabolen på scenen av Nikon TE200 invertert mikroskop, som er koblet til PTI spektrofluorometer, med eksitasjonsbølgelengdene ved 350 og 390 nm og utslipp på 510 nm. De eksakte eksitasjonsbølgelengdene som skal brukes kan lett variere avhengig av optikk av hver enkelt system. De to bølgelengdene med best forhold dynamisk bestemmes av eksitasjon spektrum skanning av Fura-2 salt i løsninger som inneholder Ca 2 + varierer fra 0 til 39,8 mM (eller høyere konsentrasjonen hvor Fura-2 fluorescens er mettet).
  8. Sett opp en tyngdekraft perfusjon system med 4 ulike løsninger i BSS: Ca 2 + (2 mm), EGTA (0,5 mm), EGTA-TG (thapsigargin, 5 mikrometer), Ca 2 +-2-APB (en SOCE hemmer, 75 mM). Datastyrt automatisert perfusipå systemer kan også brukes.
  9. Merk cellene uttrykker RFP i visualisering modus.
  10. Plasser åpningen tuppen av perfusjons systemet ved 10x forstørrelse inntil spissen er rett over regionen av interesse i en 45 graders vinkel.
  11. Samtidig registrerer fluorescens signaler F 350nm og F 390nm. Ratio (F 350nm / F 390nm) vises i tredje vinduet. Endre perfusjon løsningene i følgende rekkefølge: Ca 2 +, EGTA; Ca 2 +, EGTA-TG; Ca 2 +, Ca 2 +-2-APB.

Ovennevnte protokollen kan endres for måling av intracellulær Ca 2 + i cellen suspensjon system.

  1. Kultur KYSE-150 celler i en T25 kolbe med den samme kulturen tilstand som ovenfor.
  2. Når cellene når 90% samløpet, fjerner medium og skyll cellene med en BSS løsning.
  3. Legg 2,5 ml BSS løsning som inneholder 2 mM Fura-2 AM og inkubercellene for 40 min ved 37 ° C etterfulgt av deesterification.
  4. Fjern BSS, tilsett 2,5 ml trypsin i kolben og Inkuber ved 37 ° C til cellene løsner. Deretter legger 2,5 ml kultur medium for å stoppe trypsinization og høste cellene ved sentrifugering ved 800 rpm i 5 min.
  5. Vask cellene med kultur medium en gang ved sentrifugering og re-suspendere cellenes pellet inn i BSS løsning (uten tillegg av 2 mM CaCl 2, som inneholder mM utvalg Ca 2 +) og telle celler nummeret ved hjelp av en hematometer.
  6. Legg ~ 10 6 celler inn i en kvarts kyvette (10 mm, Starna Cells) og fyll volumet opp til 2 ml med BSS.
  7. Plasser kyvetten (omrøring med en magnetisk bar) i spektrofluorometer.
  8. Samtidig registrerer fluorescens signaler F 340nm og F 380nm med utslipp bølgelengde på 510 nm. Den kjører protokollen er: BSS, tillegg på 0,5 mL EGTA (0,25 M lager), tillegg av 1 mL thapsigargin(TG, 10 mm lager), tillegg av 4 mL Ca 2 + (1 M lager).

2. Mn quenching analysen i dyrkede celler

  1. Utfør eksitasjon bølgelengde skanning av Fura-2 i løsninger som inneholder forskjellige Ca 2 + konsentrasjonen varierer fra 0 til 39,8 mM å bestemme Ca konsentrasjon uavhengig bølgelengde som isosbestic punktet. Vanligvis er det isosbestic punktet på eller rundt 360 nm.
  2. KYSE-150 celler dyrkes i glassbunn retter og lastet med Fura-2 AM.
  3. Sett opp perfusjon system med fem forskjellige BSS løsninger: Ca 2 + (2 mm), EGTA / TG (0,5 mm og 5 mikrometer, henholdsvis), Mn 2 + (0,5 mm, uten tilsetning av EGTA eller Ca 2 +, som inneholder fri Ca 2 + i mM rekkevidde), Mn 2 + / 2-APB (75 mm), EGTA / Triton X-100 (0,1%).
  4. Monter parabolen på scenen av mikroskopet, og velg "Excitation Ratio"-modus med eksitasjonsbølgelengdene på 360 nm og 390 nm og utslipp på 510nm.
  5. Samtidig registrerer fluorescens signaler F 360nm og F 390nm med Ratio (F 360nm / F 390nm) vises i den tredje vinduet. Den kjører protokollen er: Ca 2 + i 1 min å stabilisere fluorescens, Mn 2 + i 30 sek, EGTA / TG for 10 min, Mn 2 + i 2 min, EGTA-Triton X-100 (0,1%) i 1 min å få bakgrunnen lesing. Mn 2 + / 2-APB løsning kan brukes i stedet for Mn 2 + å undersøke avskaffet fluorescens leskende, noe som indikerer at Mn 2 + oppføringen er gjennom SOCE veien.

3. Mn quenching analysen i muskelcellene

  1. C2C12, en mus myogenic cellelinje, er dyrket på glassbunn retter i 5% CO 2 atmosfæren ved 37 ° C i DMEM medium som inneholder 10% fosterets bovint serum, 10% hest serum.
  2. Etter at cellene nå samløpet, er kulturen medium endret til differensiering medium (fjerne fosteret storfe serum og reduksjone hest serum til 2,5%). De C2C12 myoblasts vil differensiere i myotubes etter 4 dager.
  3. Load C2C12 myotubes med en endelig konsentrasjon av 5 mikrometer Fura-2 er som beskrevet i 1.4 til 1.6.
  4. Legg til en endelig konsentrasjon på 20 mM N-benzyl-p-toluene sulfonamid (BTS) til å hemme muskelsammentrekninger og bevegelsesartefakter forårsaket av dem og la 15 min før du starter eksperimentet.
  5. Monter parabolen på scenen av mikroskop koblet til PTI enheten og laste følgende BSS løsninger i perfusjon system: 2 Ca 2 + (2 mm), 0 Ca 2 +, Mn 2 + (0,5 mm), Mn 2 + / TG (0,5 mm, 20 mikrometer, henholdsvis).
  6. Sett opp perfusjon systemet som beskrevet ovenfor.
  7. Samtidig registrerer fluorescens signaler F 360nm og F 390nm med Ratio (F 360nm / F 390nm) vises i den tredje vinduet. Den kjører protokollen er: 2 Ca 2 + i 1 min, 0 Ca 2 + i 1 min til flUSH bort Ca 2 +, Mn 2 + for 0,5 min, Mn 2 + / TG for 10 min, og Mn 2 + / EGTA-Triton X-100 (0,1%).

4. Romlig og timelig løst SOCE i skinned muskelfibre

  1. Forbered følgende løsninger.
    Isoton Tyrode buffer: 140 mm NaCl, 5 mm KCl, 10 mm HEPES, 2 mM MgCl 2, 2,5 mM CaCl 2, 7,2 pH, 290 mOsm
    Kultur medium: DMEM med 2% hest serum og 1% penicillin og streptomycin
    Vask løsning # 1: 109,6 mM K-glutamat, 2 mm EGTA-KOH, 6,7 mm 2 MgCl, 2 mM ATP, 6 mm kreatinfosfat (CP), 20 mm N, N-bis (2-hydroxyethyl)-2-aminoethanesulfonic syre (BES)-KOH, pH 7,0
    Vask løsning # 2: 140 mm K-glutamat, 5 mm EGTA-KOH, 6,5 mM MgCl 2, 2 mM ATP, 6 mm CP, 20 mm BES-KOH, pH 7,0
    Skinning løsning: 140 mm K-glutamat, 6,5 mM MgCl 2, 2 mM ATP, 6 mm CP, 20 mm BES-KOH, pH 7,0
    TT-loadingLøsningen: 90,6 mM K-glutamat, 18 mM Na-glutamat, 0,55 mm CaCl 2, 2 mm EGTA-KOH, 6,7 mM MgCl 2, 5,4 mM ATP, 15 mm CP, 0,0025 mg / ml kreatinkinase (CK), 20 mm BES-KOH, 5 mikrometer carbonyl cyanid p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP), pH 7,0, PCA 7.0
    SR lasting løsning: 107,8 mM K-glutamat, 0,98 mm 2 CaCl, 2 mm EGTA-KOH, 6,6 mM MgCl 2, 5,4 mM ATP, 15 mm CP, 0,0025 mg / ml CK, 20 mm BES-KOH, 5 mikrometer FCCP, pH 7,0, 6,6 PCA
    SR tappe løsning: 100 mM K-glutamat, 40 mM Na-glutamat, 10 mM EGTA-KOH, 10 mm 1,2-bis (o-aminophenoxy) etan-N, N, N ', N'-tetraacetic syre (BAPTA ), 0,35 mm 2 MgCl, 0,5 mM ATP, 1 mm CP, 20 mm BES-KOH, 5 mikrometer FCCP, pH 7,0. 25 mm caffeine/20 mM thapsigargin (TG) er lagt før eksperimenter.
  2. Til å dissekere extensor digitorum longus (EDL) muskel, første fastsette musene og ordne beinet i sideleie, fjern skinnet fra ankelen området opp til kneet, klippeoverfladiske muskel lag av vev for å avdekke EDL, og kutte både øvre og nedre sener å frigjøre intakt EDL muskler, det er viktig å holde sener så lenge som mulig. EDL er overført til en Tyrode løsning som inneholder 0 Ca 2 + og 0,1 mM EGTA å forhindre sammentrekninger.
  3. Under en stereomikroskop, bruke to pinsett til å holde lavere innsetting sener og dele EDL muskelen i to bunter. Gjenta prosessen for å få 4 og deretter 8 bunter. Det er viktig at sener forblir for hver av de 8 bunter på slutten av prosessen. Hvis de er forsvunnet fra enkelte bunter, kast dem.
  4. Under en stereomikroskop, blir hver EDL bunt stripe griped både sener og forsiktig strakte fram 3 ~ 4 separerte enslige muskelfibre er intakt med sene på begge sider.
  5. Sett en dråpe av Ca 2 + gratis tyrode buffer i midten av glass-bunn parabolen, fastsette EDL strimler rett på fatet, raskt fjerne så mye som mulig avløsning, da tape ned både sener med vanntett teip, og sørg for at kassetten er stramt. Vask fiber først med 0 Ca 2 +-løsning, og deretter med en 2,5 mm Ca 2 + Løsning 2 ganger. Hvis fiber hyper-kontrakter og skader oppdages, forkaste fiber.
  6. Ved behov, kan fiber dyrkes i inntil 96 timer, noe som åpner for genetiske manipulasjoner. Vask fiber 3 ganger med komplett kultur medium og tilsett 2 ml medium i formen, legg i 5% CO 2 og 37 ° C inkubator. Før hvert forsøk, undersøke muskelfibre og forkaste dem uten klar striation eller med tegn på forurensning, eller med tegn på skader som kontraktur av sarcolemmal membranen. Gode ​​fibre svare på KCl, elektrisk stimulering, og koffein stimulering.
  7. Enkle muskelfibre er vasket 3 ganger med vaskeløsningen # 1 og badet i intracellulær-lignende skinning løsning med 500 mM Rhod-5N og 0,5 mm Ca 2 + i 5 min.
  8. <li> Bruke en Tungsten nål festet til en pinne holder, mekanisk hud fiber under et stereomikroskop, slik at tverrgående tubuli (TT) til automatisk reseal og å felle Rhod-5N konjugert med Ca 2 + i TT, vaske hud fibrene to ganger med vask løsning 2. Den mekaniske skinning prosessen er optimal når mindre enn 25% av cellebredden fjernes under skinning prosessen.
  9. For å laste SR, blir skinned fibre inkubert med skinning løsning som inneholder 20 mM Fluo-5N AM i 1 time ved romtemperatur, fulgt av omfattende vask med vask løsning nr. 2, og inkuber for en ekstra 30 min å tillate full de-esterification av fargestoff.
  10. Etter 30 min, skinned fibre er visualisert i henhold 60X formål confocal mikroskop. Fluorescens bildene er ervervet på bølgelengder av de tilsvarende fargestoffer (eksitasjon ved 543 nm og utslipp lenger enn 570 nm for Rhod-5N, eksitasjon ved 488 nm og utslipp på 530-560 nm for Fluo-5N). Regions av interesse (Rois) er valgt for hver fargestoff lastede områder.
  11. Forsøksprotokollen er som følgende: TT-loading løsning for 120 s, SR-loading løsning for 120 s, SR-uttømming løsning for 400-750 s til utarme SR Ca 2 + butikken. Under denne prosessen, er endringer i Rhod-5N intensitet (TT Ca 2 +) og Fluo-5N intensitet (SR Ca 2 +) registrert, og skaper en tid kurs bestemmelse av relative fluorescens endringer i TT og SR. Middelverdier av fluorescensintensiteten fra flere fibre er nærmere analysert. Den maksimale lasting intensitet på slutten av TT / SR-loading er normalisert til 100%.

5. Representative Resultater

Vi undersøkte SOCE aktivitet i KYSE-150 celler ved hjelp av intracellulær Ca 2 + måling (Fig. 2.). Bruke RFP som reporter, kunne vi velge de enkelte cellene transfekterte med plasmid som inneholder bestemt shRNA mot orai1, et gen som koder for SOCE channel. Sammenlignet med celler transfekterte med plasmider som inneholder rykke shRNA (svart spor), det å slå ned på Orai1 protein resulterer i redusert SOCE aktivitet (rød spor).

SOCE i KYSE-150 celler ble også bekreftet med Mn 2 + quenching analysen (fig 3).. Eksitasjon bølgelengde på 360 nm rapporterer isosbestic poenget med Fura-2, hvor fluorescens er uavhengig av Ca 2 + konsentrasjon. Etter TG helt utladet ER Ca 2 + butikker, perfusjon av Mn 2 + resulterte i en betydelig fluorescens nedgang. Den samlede SOCE aktivitet kan måles ved reduksjon frekvensen av Fura-2 fluorescensintensiteten med en brattere skråning som indikerer en mer aktiv SOCE, mens en grunnere skråning mening en mindre aktiv SOCE. Skråningen av fluorescens reduksjon i to-APB behandlet cellene viste seg å være mye grunnere, noe som indikerte at SOCE aktivitet ble blokkert av denne forbindelsen. Den Mn2 + slukke priser ble bestemt fra plata av de første 10 sekunder, hvor quenching var fortsatt i lineær rekkevidde uten metning.

En lignende Mn 2 + quenching analysen ble utført i muskelen (Fig. 4.). I dette tilfellet Mn 2 + ble brukt sammen med TG. Mens TG ble tappe SR Ca 2 + butikker, fluorescens quenching skråningen gradvis endret til den nådde sin maksimale hastighet. Den sigmoidal kurven indikerer gradert aktivering av SOCE under disse eksperimentelle forhold.

Friske intakte single muskelfibrene i kultur viste tydelig og enhetlig striation, ingen tegn til forurensing, og ingen tegn til sammentrekning-indusert skade. Disse fibrene var i stand til å trekke seg som svar på elektrisk stimulering eller depolariserende løsninger. Under confocal bildebehandling, viste flådd fiber fangst av Rhod-5N fargestoff i TT kupé den karakteristiske pattedyr doublet mønster (visueltalized i den røde kanalen). Etter lasting av SR med Fluo-5N AM, var det typisk krydres SR mønster synlig (i grønn kanal). Ved perfusjon av flådd fiber med TT / SR lasting løsning, økt fluorescens intensitet både Rhod-5N og Fluo-5N, ved perfusjon med SR uttømming løsning, fluorescens nivåer i SR kupé og TT kupé begynte å avta, noe som indikerer stram kobling mellom SR Ca 2 + butikken uttynning og SOCE aktivering, henholdsvis (fig 5)..

Figur 1
Figur 1. Aktivering av butikk-opererte Ca 2 + oppføringen (SOCE). Orai1, er en kanal pore forming enhet, plassert på plasmamembranen (PM) og STIM1, en ​​Ca 2 +-sensoren, ligger på det endoplasmatiske eller sarcoplasmic retikulum (ER / SR) membraner. Når ER / SR Ca 2 + butikker er redusert enten på grunn av blokkering av ER / SR Ca 2 + pumpe (SERCA) eller Ca 2 + utgivelsen gjennom IP 3 reseptor eller ryanodine reseptoren, er STIM1 aktivert. Aktiverte STIM1 molekyler danner flekker og indusere aggregering av Orai1, noe som ytterligere fører aktivering av SOCE.

Figur 2
Figur 2. Måling av intracellulær Ca 2 + i KYSE-150 celler. Utveksling av ekstracellulær løsning fra 0 Ca 2 + (0,5 mM EGTA) til 2 mm Ca 2 + ikke induserer noen endring i intracellulær Ca 2 +. 5 mikrometer TG i 0 Ca 2 + bad løsning indusert passiv ER Ca 2 + utgivelsen. Etter ER Ca 2 + minket (> 10 min), tillegg av ekstracellulært Ca 2 + (2 mm) aktiveres en vedvarende intracellulær Ca 2 + heving gjennom SOCE, som kan bli blokkert av SOCE hemmere, f.eks SKF-96365 og 2 - APB (data ikke vise). Celler transfekterte med plasmider som inneholder shRNA spesielt motorai1 (rød) viste signifikant redusert SOCE enn celler transfekterte med scramble sekvens (svart).

Figur 3
Figur 3. Mn 2 + quenching analysen av SOCE i KYSE-150 celler. Den dempe Fura-2 fluorescens ved Mn 2 + (0,5 mm) ble målt ved Ca 2 +-uavhengig eksitasjon bølgelengde av Fura-2 (360 nm). Celler ble behandlet med 5 mikrometer TG for 10 min til helt utarme ER Ca 2 + butikker. Den forfall hellingen Fura-2 fluorescens ved Mn 2 + tillegg (dash linjer, innenfor de 10 første sek) representerte aktivering av SOCE, som ble uttrykt som prosent reduksjon i fluorescens per tidsenhet (den opprinnelige verdien som 100%). Den maksimalt seigherdet Fluorescens signal ble etablert på slutten av eksperimentet ved Lysing cellene med 0,1% Triton X-100 (som 0%). Celler behandlet med 2-APB (75 mm) viste en mye grunnereskråning, noe som tyder SOCE er blokkert av denne forbindelsen i KYSE-150 celler.

Figur 4
Figur 4. Gradert aktivering av SOCE i muskelceller avslørt av Mn 2 + quenching analysen. Aktivering av SOCE kunne registreres mens TG ble tappe SR Ca 2 + butikker. Samtidig anvendelse av Mn 2 + (0,5 mm) og TG (20 mm) induserte en gradert-og sigmoidal reduksjon av intracellulær Fura-2 fluorescens (cyan strek linje for å vise den raskeste quenching punkt), som var forskjellig fra innledende Mn 2 + quenching rate (blå strek linje). Mn 2 + quenching skråning vært omtrent den samme som basal nivå i cellene behandlet to-APB (75 mm), noe som tyder på at SOCE ble hemmet.

Figur 5
Figur 5. Romlig og timelig løst SOCE i flådd muskel fiber. (A) RhOD-5N salt ble lastet inn TT og Fluo-5N AM ble lastet inn SR. (B) Etter at Ca 2 + utarming løsning, redusert fluorescens i både TT og SR seksjonene. Tapet av Fluo-5N fluorescens indikerte raskt løslatt SR Ca 2 +-innhold og tap av Rhod-5N fluorescens foreslått aktivering av SOCE.

Discussion

Selv om eksitasjonsbølgelengdene for Ca 2 +-binding og Ca 2 + gratis Fura-2 er 340 nm og 380 nm, henholdsvis den beste forholdet dynamisk spekter av Fura-2 for Ca 2 + konsentrasjon måling kan forekomme ved andre bølgelengder i en bestemt mikroskop system. Slike skift i bølgelengde er vanligvis skyldes endringer i den optiske banen med tillegg av ulike optiske komponenter. I denne studien ble eksitasjonsbølgelengdene for Fura-2 bestemmes som 350 nm og 390 nm ved å utføre spektralanalyse av Fura-2 fluorescens.

Den intracellulære Ca 2 +-nivå i cytosol resultatene fra en balanse av flere kilder, inkludert intracellulær Ca 2 + utgivelsen, ekstracellulær Ca 2 + oppføring, samt Ca 2 + uttrekksmekanismen på akuttmottaket og plasma membran. For å isolere enveis SOC-mediert Ca 2 + innstrømning fra intracellulær Ca 2 + utgivelsen og Ca 2 +, trinnusion kan Mn 2 + quenching analysen brukes. Mn 2 + er kjent for å være i stand til å gjennomsyre inn i cellene via SOCE men er ugjennomtrengelig for overflate membran ekstrudering eller ER opptak av Ca 2 +-pumper. Derfor representerer fluorescens slukke en måling av enveis Mn 2 + flux inn i cellene som estimerer graden av aktivering av SOCE. Mn 2 + quenching analysen er utført ved isosbestic punkt, slik bølgelengde Fura-2 fluorescensintensiteten er uavhengig av Ca 2 + konsentrasjon. Det isosbestic poeng for hvert system bør bestemmes av spektrum skanning. Alternativt kan Mn 2 + quenching bli registrert av justerte fluorescens på eventuelle to bølgelengder på en slik måte at den endelige verdien er uavhengig av Ca 2 + konsentrasjonen 13.

For å få den romlige og tidsmessige informasjon om aktivitet av SOCE i skjelettmuskulatur, brukte vi en dual-dye-metoden, som tillater samtidig measurement av SOCE aktivitet og SR Ca 2 +-innhold i skinned voksne pattedyr EDL muskelfibre. Korrelasjonen mellom endringer i SR Ca 2 +-innhold og SOCE aktivitet kan plottes å angi terskelen og følsomhet SOCE aktivering til utarming av SR Ca 2 +-lagring. Den TT-loading løsning er optimalisert for å i tillegg laste T-tubuli med Ca 2 + og for grunning av T-tubuli og SR-lasting løsning er utformet for å fremme maksimal SR Ca 2 + lasting og å i tillegg laste T-tubuli med ~~~HEAD=NNS 500 mM Ca 2 +. FCCP er inkludert i TT / SR-loading løsning og SR-Depleting løsning for å eliminere effektene fra mitokondriene.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Noah Weisleder for lesing og redigering av dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av forskningsmidler UMDNJ Foundation 62-09 til ZP, American Heart Association SDG2630086 til XZ, 0535555N til MB, og National Institutes of Health RC2AR058962-01 til MB.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Mediatech 10-040-CV
Ham's F-12 Mediatech 10-080-CV
DMEM Mediatech 10-013-CV
Glass Bottom Dish MatTek P35G-1.5-14-C
Fura-2 AM Invitrogen (Molecular Probes) F1221 -20 °C, seal tight, protected from light, dissolved into DMSO
Fluo-5N AM Invitrogen (Molecular Probes) F14204 -20 °C, seal tight, protected from light
Rhod-5N Invitrogen (Molecular Probes) R14207 -20 °C, seal tight, protected from light
Quartz Cuvette Starna Cells 3-Q-10
thapsigargin Tocris 1138
2-Amin–thoxydiphenylborane (2-APB) Tocris 1224
N-benzyl-p-toluene sulphonamide (BTS) Sigma-Aldrich 435600
Collagenase Type I Sigma C0130

Equipment:

  1. A spectrofluorometer (Photon Technology International, NJ): xenon arc lamp, computer-controlled high-speed random access monochromator, cuvette-based emission monochromator, Nikon TE-200 inverted fluorescence microscope, S Fluor 40x/1.30 oil objective, PMT detectors.
  2. Laser Scanning Confocal Microscope (BioRad Radiance2100): argon laser 453/477/488/514, HeNe laser 543nm, Nikon TE2000 inverted microscope, 60X objective (N.A. 1.4, oil).
  3. A stereomicroscope with a magnification power > 100 (Zeiss Stemi SV11 Apo).

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Parekh, A. B., Putney, J. W. Jr Store-operated calcium channels. Physiol. Rev. 85, 757-810 (2005).
  2. Ma, J., Pan, Z. Retrograde activation of store-operated calcium channel. Cell Calcium. 33, 375-384 (2003).
  3. Feske, S. ORAI1 and STIM1 deficiency in human and mice: roles of store-operated Ca2+ entry in the immune system and beyond. Immunol. Rev. 231, 189-209 (2009).
  4. Parekh, A. B. Store-operated CRAC channels: function in health and disease. Nat. Rev. Drug Discov. 9, 399-410 (2010).
  5. Pan, Z. Dysfunction of store-operated calcium channel in muscle cells lacking mg29. Nat. Cell Biol. 4, 379-383 (2002).
  6. Shin, D. W. A retrograde signal from calsequestrin for the regulation of store-operated Ca2+ entry in skeletal muscle. J. Biol. Chem. 278, 3286-3292 (2003).
  7. Ma, J., Pan, Z. Junctional membrane structure and store operated calcium entry in muscle cells. Front Biosci. 8, d242-d255 (2003).
  8. Pan, Z., Damron, D., Nieminen, A. L., Bhat, M. B., Ma, J. Depletion of intracellular Ca2+ by caffeine and ryanodine induces apoptosis of chinese hamster ovary cells transfected with ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 275, 19978-19984 (2000).
  9. Hirata, Y. Uncoupling store-operated Ca2+ entry and altered Ca2+ release from sarcoplasmic reticulum through silencing of junctophilin genes. Biophys. J. 90, 4418-4427 (2006).
  10. Zhao, X. Enhanced resistance to fatigue and altered calcium handling properties of sarcalumenin knockout mice. Physiol. Genomics. 23, 72-78 (2005).
  11. Zhao, X. Azumolene inhibits a component of store-operated calcium entry coupled to the skeletal muscle ryanodine receptor. J. Biol. Chem. 281, 33477-33486 (2006).
  12. Launikonis, B. S., Barnes, M., Stephenson, D. G. Identification of the coupling between skeletal muscle store-operated Ca2+ entry and the inositol trisphosphate receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 2941-2944 (2003).
  13. Shuttleworth, T. J. Temporal relationships between Ca2+ store mobilization and Ca2+ entry in an exocrine cell. Cell. Calcium. 15, 457-466 (1994).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics