श्लेष द्रव में एक संवर्धन मानव जोड़ chondrocytes के लिए 3 डी सिस्टम

Biology

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Summary

श्लेष तरल पदार्थ के उच्च स्तर में मानव जोड़ chondrocytes संवर्धन का एक 3D प्रणाली में वर्णित है. श्लेष द्रव जोड़ कार्टिलेज के लिए सबसे अधिक प्राकृतिक microenvironment को दर्शाता है, और आसानी से प्राप्त किया जा सकता है और संग्रहीत. इस प्रणाली को इस तरह उपास्थि उत्थान अध्ययन के लिए और गठिया के इलाज के लिए स्क्रीनिंग चिकित्सा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Brand, J. A., McAlindon, T. E., Zeng, L. A 3D System for Culturing Human Articular Chondrocytes in Synovial Fluid. J. Vis. Exp. (59), e3587, doi:10.3791/3587 (2012).

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Abstract

Protocol

श्लेष तरल पदार्थ में एक संवर्धन मानव जोड़ chondrocytes के लिए 3 डी प्रणाली

इस काम में, हम alginate मोती में एक संशोधित निर्माण - सुझाव दिया encapsulation प्रोटोकॉल (Lonza, और 31) का उपयोग मानव जोड़ chondrocytes समझाया . इन 3D constructs का प्रयोग, हम एक संस्कृति मानव श्लेष तरल पदार्थ के विभिन्न प्रतिशत से युक्त मध्यम में संवर्धन कोशिकाओं के लिए एक प्रणाली विकसित की है और उपास्थि जीन की अभिव्यक्ति के लिए इन 3 डी constructs का मूल्यांकन.

1. Encapsulation के तीन आयामी (3 डी) के लिए मानव जोड़ chondrocytes (HAC) की तैयारी

  1. मानव जोड़ (HAC) chondrocytes (Lonza) (पारित 2) (1 मिलीलीटर) की एक शीशी 1 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में पहले गला लें.
  2. उपास्थिकोशिका विकास (Lonza) मीडिया और 3-5 मिनट के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा के लिए 3000 rpm पर अपकेंद्रित्र 1ml के साथ मिक्स. सतह पर तैरनेवाला त्यागें.
  3. उपास्थिकोशिका विकास मीडिया में Resuspend सेल गोली (Lonza).
  4. एक 10 सेमी के ऊतकों में कोशिकाओं प्लेटसंस्कृति (बी बायोसाइंसेज), थाली, और उपास्थिकोशिका विकास मीडिया (Lonza) में संस्कृति जब तक कोशिकाओं सहधारा हैं. HACs एक मार्ग संख्या कोई अधिक 3 या 4 (P3 या P4) में इस्तेमाल किया जाना चाहिए.
  5. थाली पर HACs 155mM के बजाय NaCl मानक Pbs, trypsinzation द्वारा पीछा alginate मनका encapsulation के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करने के साथ धोएं. एक बार कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं, नीचे 3000rpm पर 5min के लिए कोशिकाओं स्पिन. कोशिकाओं को अब कर रहे हैं 3D encapsulation के लिए तैयार है.

2. 3D मोती में समाहित HACs

5 कोशिकाओं / एमएल 8x10 के घनत्व में 1.2% alginate समाधान (सिग्मा) में HACs Resuspend. सेल संख्या encapsulation के लिए पहले निर्धारित किया गया है, एक मानक सेल काउंटर का उपयोग कर. कोशिकाओं के मनकों में भी वितरण सुनिश्चित करने के लिए मिश्रण अच्छी तरह से यह बहुत महत्वपूर्ण है.

  1. एक 12 मिलीलीटर सिरिंज एक 22 गेज सुई (Tyco स्वास्थ्य, इंक) से जुड़ी में पिपेट / HAC Alginate समाधान मिश्रण.
  2. इस बीच, 102 मीटर के साथ एक 50 एमएल बीकर तैयारएम मात्रा में 2 CaCl 5 बार HAC / aginate समाधान की है कि. बीकर अंदर हलचल बार प्लेस और 102 मिमी CaCl 2 समाधान धीरे हलचल (लगभग 150 rpm पर).
  3. CaCl 2 समाधान की सतह के ऊपर के बारे में 6 इंच सिरिंज टिप पकड़ो और CaCl 2 समाधान dropwise में मिश्रण / HAC alginate जोड़ने. सामान्य में, जिसके परिणामस्वरूप alginate मोती लगभग 10 4 कोशिकाओं / मनका के एक encapsulation के घनत्व के साथ व्यास में 2mm हैं. नोट: CaCl 2 समाधान अधिक सिरिंज की ऊंचाई महत्वपूर्ण है. कम दूरी के गोलाकार आकार के मनकों की बजाय आकार आंसू बूंद में परिणाम असमान यांत्रिक अखंडता और सेल encapsulation के कारण होगा.
  4. चलो मोती CaCl 2 समाधान में 20-25 मिनट के लिए हलचल. जबकि अन्य alginate encapsulation प्रोटोकॉल एक बहुत कम 10min के ऊष्मायन समय से संकेत मिलता है, हमने पाया है कि अब CaCl 2 समाधान के साथ ऊष्मायन समय हो की अखंडता को बढ़ायाविज्ञापन.
  5. CaCl 2 समाधान निकालें, NaCl की 2-3 मात्रा में 2-3 बार मोती धो, और फिर एक बार उपास्थिकोशिका भेदभाव मध्यम (Lonza) में . जबकि अन्य alginate मनका encapsulation प्रोटोकॉल ऊपर धोने प्रक्रियाओं के लिए एक फिल्टर का उपयोग शामिल है, हमने पाया है कि alginate मोती अक्सर फिल्टर और सूखी बाहर में फंस हो, इस प्रकार encapsulation की दक्षता को कम करने. हम यह सबसे कुशल मोती discarding पहले बीकर के नीचे करने के लिए समाधान व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देने के लिए मिला.
  6. एक मानक रंग का उपयोग करने के लिए संस्कृति बर्तन में मोती हस्तांतरण. हम आम तौर पर उपास्थिकोशिका मध्यम विकास में 2 दिनों के लिए अच्छी तरह से 3 सेमी प्रति 12 मोती संस्कृति chondrocytes माध्यम से वे पहले श्लेष तरल पदार्थ के साथ उपास्थिकोशिका भेदभाव मध्यम (Lonza) करने के लिए स्विचन में बड़े हो रहे थे में encapsulation प्रक्रिया को समायोजित करने के लिए अनुमति.

3. श्लेष तरल पदार्थ संस्कृति माध्यम में संस्कृति chondrocytes

  1. ताजा श्लेष तरल पदार्थ एक ओ से प्राप्त किया जा सकता है हैutpatient क्लिनिक (हम Tufts मेडिकल सेंटर से श्लेष तरल पदार्थ प्राप्त). श्लेष तरल पदार्थ 15ml बाज़ ट्यूबों में प्रयोगशाला के लिए हस्तांतरित किया जा सकता है, और तुरंत 15min के लिए 3000 rpm पर centrifuged सेल मलबे को हटाने के. अशेष भाजक सेल मुक्त 1.5 एमएल microcentrifuge ट्यूबों में श्लेष तरल पदार्थ, दोहराया फ्रीज विगलन से बचने. सतह पर तैरनेवाला ° -80 में उपयोग करें जब तक सी संग्रहीत किया जा सकता है.
  2. संवर्धन के लिए पहले, बड़ा अनुपात अलग उपास्थिकोशिका भेदभाव मध्यम के साथ श्लेष तरल पदार्थ (सीडीएम, Lonza), 100mm ascorbic एसिड की एक निरंतर एकाग्रता और 9 मिमी 2 CaCl (2 CaCl के इस ट्रेस राशि alginate की अखंडता को सुनिश्चित करना है के साथ मिश्रण ) मोती.
  3. एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में एक कमाल मंच पर थाली रखें (कमाल की आवृत्ति: के बारे में 75 बार / मिनट) alginate मोती के भीतर पोषक तत्व वितरण में मदद, और मोतियों की clumping को कम. यह समय की एक विस्तारित अवधि (4 सप्ताह) के लिए हम इन chondrocytes संस्कृति के रूप में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है. नोटजबकि उपास्थिकोशिका विकास और भेदभाव मीडिया (Lonza) दो आमतौर पर इस्तेमाल एंटीबायोटिक दवाओं gentamycin और amphotericin होते हैं, हम किसी भी एंटीबायोटिक दवाओं के पूरक नहीं, जब हम उपास्थिकोशिका संवर्धन के लिए श्लेष तरल पदार्थ के विभिन्न प्रतिशत इस्तेमाल किया था. कोई संदूषण कभी मनाया गया.
  4. मीडिया मिश्रण बदलें हर 2-3 दिन. श्लेष तरल पदार्थ का चिपचिपापन संवर्धन दीर्घकालिक संस्कृतियों के दौरान alginate मोतियों की माला में समझाया chondrocytes में एक बड़ी बाधा है. हम यह सबसे प्रभावी 102mM CaCl 2 (50% वी / वी), जो भी alginate मोतियों की अखंडता को मजबूत के साथ श्लेष तरल पदार्थ पूरक मध्यम पतला पाया. इस तरह, मध्यम धीरे धीरे एक pipet के साथ हटाया जा सकता है मनकों को नुकसान पहुँचाए बिना हो.

4. Alginate मोती में जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए हार्वेस्ट HACs

विशेष देखभाल जब जीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए alginate मोतियों से HACs कटाई लिया जाना चाहिए.

  1. Alginate मोती ती 3 धोसंदेश के बारे में 5 मिनट प्रत्येक समय के लिए 102 मिमी 2 CaCl में .
  2. मोतियों की 4-5 बार है कि एक मात्रा पर 55 मिमी NaCitrate जोड़कर chondrocytes पुनर्प्राप्त करें. यह महत्वपूर्ण है कि alginate मोती NaCitrate समाधान में पूरी तरह डूब रहे हैं. 20-30 मिनट के लिए शेक या रॉक.
  3. नीचे कोशिकाओं घुमाओ और सतह पर तैरनेवाला त्यागने.
  4. RT-पीसीआर विश्लेषण के लिए, resuspend सेल lysis बफर में सेल गोली (Qiagen आरएनए अलगाव किट), और शाही सेना शुद्धि के साथ आगे बढ़ना.

5. Histological विश्लेषण के लिए फिक्स alginate मोती में HACs

विशेष देखभाल करने के लिए histological विश्लेषण के लिए 3 डी मोतियों से HACs फसल के लिए लिया जाना है.

  1. Alginate मोती 5 मिनट के बारे में प्रत्येक समय के लिए 102 मिमी 2 CaCl में 3 बार धो. पूरी तरह से दूर चिपचिपा श्लेष तरल पदार्थ धोने के लिए, हम यह सबसे उपास्थिकोशिका भेदभाव मध्यम (Lonza) के साथ रात भर धोने प्रभावी पाया गया है, एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर (कमाल की आवृत्ति में कमाल: के बारे में 75 समयs / मिनट). उपास्थिकोशिका मध्यम विकास के लिए लंबे समय तक धोने में उपास्थिकोशिका अस्तित्व को सुनिश्चित करने और फिक्सिंग एजेंट की अधिकतम पैठ की अनुमति के लिए इस्तेमाल किया गया था.
  2. 70% इथेनॉल में मोती रातोंरात फिक्स, और histological विश्लेषण के साथ आगे बढ़ना. Dapi धुंधला करने के लिए, Dapi समाधान (500ng/ml) के साथ 1hr कोमल कमाल के तहत के लिए alginate मोती, सेते हैं और 102mM 15 मिनट के लिए 2 हर समय CaCl के साथ 3 बार के लिए धोने. Dapi चित्र तो एक फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे देखा जा सकता है है. मोती भी alcian नीले और एच एंड ई धुंधला के लिए sectioned किया जा सकता है है.

6. प्रतिनिधि परिणाम

हमारे श्लेष तरल पदार्थ के उच्च प्रतिशत में मानव chondrocytes के लिए 3 डी संवर्धन विधि Fig.1 में दिखाया गया है योजनाबद्ध आरेख में दिखाया गया है. बाद मानव chondrocytes alginate मोती में थे समझाया, वे श्लेष तरल पदार्थ के अनुपात के साथ अलग पूरक माध्यम बढ़ने की अनुमति दी गई. श्लेष तरल पदार्थ का चिपचिपापन की वजह से, यह करने के लिए आवश्यक हैसंस्कृति chondrocytes लगातार कमाल की शर्तों के तहत उपास्थि constructs की clumping को रोकने के लिए और पोषक तत्वों का भी वितरण सुनिश्चित. यह भी जरूरी है alginate मोती chondrocytes को पुन: प्राप्त करने से पहले बड़े पैमाने पर, धोने इतना है कि फिक्सिंग या lysis बफर मोती घुसना कर सकते हैं (Fig.1). Alginate मोती में chondrocytes के उज्ज्वल क्षेत्र छवियों (BF) Fig.2 में दिखाए जाते हैं. Dapi धुंधला मोती के भीतर कोशिकाओं के usniform वितरण (छवि 2) की पुष्टि प्रदर्शन किया था. संस्कृति 21 दिन की अवधि के अंत में, जीन अभिव्यक्ति विश्लेषण QRT-पीसीआर द्वारा प्रदर्शन किया गया था. संदर्भ जीन GAPDH सभी PCRs के लिए सामान्य के लिए इस्तेमाल किया गया था, के रूप में यह 32 chondrocytes पर qPCR विश्लेषण के लिए सबसे विश्वसनीय संदर्भ जीनों के एक निर्धारित किया गया था. एक उदाहरण छवि में दिखाया गया है. 3, जहां हम मानव जोड़ श्लेष पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के साथ छह रोगियों में से जमा तरल पदार्थ में सभ्य chondrocytes से परिणामों का विश्लेषण किया. तथ्य के साथ अनुरूप है कि से chondrocytesLonza 2D संस्कृतियों, जो अनिवार्य रूप से 33 डी - भेदभाव के लिए नेतृत्व करेंगे में विस्तारित किया गया है, हमने पाया है कि दिन 0 chondrocytes उपास्थि मैट्रिक्स जीन के न्यूनतम स्तर (छवि 3 ) व्यक्त की. उपास्थिकोशिका भेदभाव (Lonza) मध्यम या मध्यम श्लेष तरल पदार्थ के साथ पूरक के साथ chondrocytes के 3 डी संवर्धन काफी उपास्थि कोलेजन aggrecan, और MMP13, जो 21 दिन (Fig.3) 34 के द्वारा फिर से भेदभाव उपास्थिकोशिका इंगित करता है जीन अभिव्यक्ति में वृद्धि हुई. मीडिया में श्लेष तरल पदार्थ का प्रतिशत बढ़ाने उपास्थि मैट्रिक्स मार्करों कोलेजन द्वितीय और aggrecan mRNA अभिव्यक्ति (Fig.3A और 3B) के तुलनीय स्तर में हुई. इसके अलावा, 100% श्लेष तरल पदार्थ में सुसंस्कृत chondrocytes भी उपास्थि अपमानजनक एंजाइम MMP13 mRNA अभिव्यक्ति में एक कमी का प्रदर्शन के रूप में मध्यम अकेले (Fig.3C) में सभ्य उन के साथ तुलना में. दिलचस्प है, कोशिका मृत्यु सूचक कस्पासे 3 की अभिव्यक्ति के स्तर श्लेष तरल पदार्थ की बढ़ती अनुपात के साथ धीरे - धीरे कमी आई है, सुझाव है किynovial द्रव संवर्धन कमी आई apoptosis (छवि 3 डी) के स्तर के लिए नेतृत्व किया गया है. इसलिए, हमारे परिणाम बताते हैं कि एक 3 डी सेटिंग में श्लेष तरल पदार्थ के उच्च स्तर में मानव जोड़ chondrocytes संवर्धन एक व्यवहार्य तकनीक है.

टेबल्स और आंकड़े

चित्रा 1.
चित्रा 1 3D alginate मोतियों की माला में श्लेष तरल पदार्थ के उच्च प्रतिशत में संस्कृति मानव जोड़ chondrocytes विधि का योजनाबद्ध आरेख. सबसे पहले, chondrocytes और alginate समाधान मिश्रित कर रहे हैं. जब CaCl 2 समाधान के लिए ड्रॉप - वार लागू, chondrocytes Crosslinked CA-alginate hydrogel मोती के भीतर immobilized कर रहे हैं. इन 3D constructs तो मानव श्लेष तरल पदार्थ के अनुपात के साथ अलग कर रहे हैं उपास्थिकोशिका भेदभाव मध्यम (Lonza) में सभ्य. एक कमाल की शर्त के तहत संवर्धन के 21 दिनों के बाद, alginate कोशिकाओं से युक्त मोती बड़े पैमाने पर धो रहे हैं जिसके बाद कोशिकाओं के जीन के लिए प्राप्तअभिव्यक्ति विश्लेषण.

चित्रा 2.
चित्रा 2 ब्राइट (बीएफ) क्षेत्र और मानव जोड़ chondrocytes के Dapi छवियों 0%, 30%, 50%, 70% और 100% श्लेष तरल पदार्थ के साथ संस्कृतियों समझाया . Chondrocytes संस्कृति के सभी परिस्थितियों में आकार में गोलाकार थे. उज्ज्वल (बीएफ) क्षेत्र और Dapi की छवियाँ करने के लिए स्थान और chondrocytes के वितरण की पुष्टि करने के लिए मढ़ा गया. Insets, बढ़ाया छवियों. Arrowheads, बीएफ और Dapi धुंधला छवियों में chondrocytes के colocalization.

चित्रा 3.
चित्रा 3. QRT दिन में पीसीआर समझाया मानव जोड़ chondrocytes के विश्लेषण 0 (D0) श्लेष तरल पदार्थ (एस एफ) (0%, 30%, 50%, 70 के अलग अनुपात के साथ पूरक मध्यम में संवर्धन (D21) के 21 दिनों के बाद % और 100%). चार स्वतंत्र नमूने के परिणाम यहाँ दिखाए जाते हैं. GAPDH सभी PCRs के लिए आंतरिक संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया गया था. बी. Aggrecan mRNA अभिव्यक्ति सी. MMP13 mRNA अभिव्यक्ति. डी. कस्पासे 3 mRNA अभिव्यक्ति. सांख्यिकीय महत्व दिवस के लिए 0 नमूनों और 0% के दिवस 21 नमूने और 100% श्लेष तरल पदार्थ (एस एफ) संवर्धन, INSTAT सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया था. * अर्थ पी <0.05.

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Discussion

इस रिपोर्ट में, हम एक तरीका है कि मध्यम में एक 3 डी वातावरण है कि मानव श्लेष तरल पदार्थ के उच्च सांद्रता शामिल में मानव जोड़ chondrocytes की संस्कृति के लिए अनुमति देता है विकसित की है. श्लेष तरल पदार्थ एक प्रमुख घटक है कि संयुक्त गुहा, जहां जोड़ chondrocytes रहते प्राकृतिक वातावरण का गठन है. हालांकि, श्लेष तरल पदार्थ का चिपचिपापन तीन आयामी chondrocytes के लंबी अवधि के संवर्धन के लिए एक बड़ी चुनौती किया गया है. भी एक चिपचिपा वातावरण में निर्माण को रोकने के लिए एक 3 डी एकत्रीकरण में पोषक तत्व वितरण को बनाए रखने की चुनौती पर काबू पाने के लिए, हम कोमल कमाल के साथ लगातार आंदोलन के तहत उपास्थि constructs रखा. उपास्थि constructs के संरचनात्मक अखंडता को बढ़ाने के लिए, हम एक मनका गठन और प्रक्रिया 31 मीडिया बदलने के लिए समय की लंबाई का अनुकूलन सहित alginate hydrogel में chondrocytes बोने की पारंपरिक प्रक्रिया को संशोधित. ऐसी प्रक्रियाओं के लिए आवश्यक हैं, जबउपास्थि constructs चिपचिपा श्लेष तरल पदार्थ में दीर्घकालिक संस्कृतियों के दौरान नियंत्रित किया जाता है.

हमें विश्वास है कि इस विधि हमें अपने प्राकृतिक milleu, श्लेष तरल पदार्थ में मानव जोड़ chondrocytes के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए अनुमति देगा. एक संभावित चिंता का विषय है कि अभिकर्मक प्रसार alginate मोती में समझाया और एक चिपचिपा वातावरण में हो chondrocytes के लिए आदर्श नहीं हो सकता. इस प्रकार इंजीनियर उपास्थि पर कुछ अभिकर्मकों के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए, बेहतर प्रसार alginate मोती के आकार को कम करने के द्वारा, और छिड़काव प्रणाली का उपयोग कर श्लेष तरल पदार्थ में अभिकर्मक वितरण की सुविधा कर प्राप्त किया जा सकता है. जबकि हमारे प्रतिनिधि परिणाम संवर्धन श्लेष पुराने ऑस्टियोआर्थराइटिस के साथ रोगियों से प्राप्त द्रव में सामान्य मानव chondrocytes से प्राप्त किया गया था, हमें विश्वास है कि इस विधि के लिए एक अन्यथा स्वस्थ व्यक्ति या अन्य स्वस्थ हड्डीवाला जानवरों से श्लेष तरल पदार्थ का उपयोग करने के लिए extrapolated किया जा सकता है. क्योंकि श्लेष तरल पदार्थ गतिविधि मिश्रित गतिविधियों के लिए सहसंबद्ध किया जा सकता हैकई जैव रासायनिक द्रव में मौजूद कारकों के संबंधों, हमारी प्रणाली में उपास्थिकोशिका जीन अभिव्यक्ति पर श्लेष तरल पदार्थ का शुद्ध प्रभाव रोग की गंभीरता के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है और अंततः हमें पहले और उपचार के बाद intraarticular परिवेश को समझने के लिए मदद मिलेगी. इसके अलावा, हमारे विधि भी संवर्धन ऑटोलॉगस chondrocytes के लिए एक मरीज की अपनी ही श्लेष तरल पदार्थ का उपयोग करने के लिए जोड़ कार्टिलेज है कि व्यक्तिगत रूप से सिलवाया है पुनर्जन्म की संभावना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. यह अंत करने के लिए, इस प्रणाली biomechanical बलों इंजीनियर उपास्थि पर श्लेष तरल पदार्थ के माध्यम से 35 में अच्छी तरह के रूप में अभिनय का अध्ययन में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

हम श्लेष तरल पदार्थ का भंडारण और centrifugation के साथ मदद प्रदान करने के लिए रॉबिन Nye (Tufts मेडिकल सेंटर), Tomoya Uchimura और दाना केर्न्स (Tufts विश्वविद्यालय) धन्यवाद देना चाहूंगा. इस काम के लिए NIH LZ (1R01AR059106 01A1) द्वारा वित्त पोषित किया गया था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Table of specific reagents and equipment:
Name of the Reagent Company Catalogue Number Comments
Alginate (Alginic Acid sodium salt) Sigma-Aldrich A2158-250G 2.4% solution stored at 40°C
Calcium Chloride Dihydrate, Granular JT Baker A19339
Chondrogenic Growth media Lonza Inc. CC-3156 (base media)
CC-4409 (supplement)
Chondrogenic Differentiation Media Lonza Inc. CC-3226 (base media)
CC-4408 (supplement)
Human articular chondrocytes Lonza Inc. CC-2550
Dapi (4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride) Sigma-Aldrich D9542
RNeasy mini kit (for RNA extraction) Qiagen 74104
PCR reagents: SYBR-green Quanta Biosciences 95053-500
12 ml syringe Tyco Healthcare, Covidien 512852
22-Gague Hypodermic Needle Tyco Healthcare, Covidien 8881
Microscope Olympus Corporation IX71
Platform rocker Thermo Fisher Scientific, Inc. Vari-mix
Collagen IIa-forward 5’-TTC ATC CCA CCC TCT CAC AGT-3’
Collagen IIa-reverse 5’-CCTCTGCCTTGACCCGAA-3’
MMP13-forward 5’-TGT GCC CTT CTT CAC ACA GAC ACT-3’
MMP13-reverse 5’-GAG AGC AGA CTT TGA GTC ATT GCC-3’
Caspase 3-forward 5’-TCA TTA TTC AGG CCT GCC GTG GTA-3’
Caspase 3-reverse 5’-TGG ATG AAC CAG GAG CCA TCC TTT -3’

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References

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