Determinando a atividade citotóxica Optimal específicos de células CD8 Her2neu Humanos T, comparando a Cr51 Ensaio de Libertação do Sistema xCELLigence

Immunology and Infection
 

Summary

O ensaio de libertação de crómio, um ensaio comum para a detecção da actividade de células T citotóxicas, tem várias limitações. Usando células T CD8 específicos de antígenos ea linha de tumor de câncer de mama humano, SKBR3, no presente artigo, uma abordagem baseada em impedância foi examinado para a capacidade de detecção de morte celular.

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Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System. J. Vis. Exp. (66), e3683, doi:10.3791/3683 (2012).

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Abstract

As células T citotóxicas CD8 constituem um subgrupo de células T que são capazes de induzir a morte das células hospedeiras infectadas ou malignas 1. Estas células expressam um receptor especializado, chamado o receptor de células T (TCR), que reconhece um péptido antigénico específico ligado a moléculas de HLA de classe I 2. Acoplamento de células infectadas ou células tumorais, através das suas molécula de HLA de classe I resulta na produção de moléculas líticas, tais como perforina e granzimas, resultando na morte de células alvo. Embora seja útil para determinar a frequência de células específicas para o antigénio T CD8 + utilizando ensaios tais como o ELISPOT ou citometria de fluxo, também é útil para determinar a força de respostas de células T CD8 + utilizando ensaios de citotoxicidade 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o ensaio de libertação de crómio (PCR), que é considerado um ensaio padrão 4. A PCR tem várias limitações, incluindo a exposição de células a radiação gama, lack de reprodutibilidade, e um requisito para um grande número de células. Ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para superar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT atividade esterase 5 e expressão de superfície de CD107 6. O ensaio à base de impedância, utilizando o sistema de xCELLigence Roche, foi examinada no presente documento, para o seu potencial como uma alternativa para a PCR. Impedância ou oposição a uma corrente eléctrica ocorre quando as células tumorais aderentes ligam a placas de eléctrodos. As células tumorais separar após abate e impedância eléctrica é reduzida, o que pode ser medido pelo sistema xCELLigence. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância para avaliar a morte mediada por células, baseia-se na observação de que as células T não aderem bem à maioria das superfícies e que não parecem ter grande impacto na impedância diminuindo assim qualquer preocupação de interferência directa das células T coma medição. Os resultados mostram que o ensaio à base de impedância pode detectar alterações nos níveis de células T citotóxicas CD8 + específicas para o antigénio, com sensibilidade aumentada em relação ao padrão de PCR. Com base nesses resultados, as abordagens baseadas em impedância podem ser boas alternativas para CRAs ou outras abordagens que visam medir a funcionalidade das células T CD8 citotóxico.

Protocol

1. Geração de curto prazo específicos Antígeno-humana de células T CD8 Linhas 7

  1. Separe as células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue de dadores positivos para o HLA-A2 saudáveis ​​normais, utilizando Ficoll-Paque Plus.
  2. Adicionar 2 ml / poço de PBMC a placas de 6 poços a 2 x 10 6 células / ml.
  3. Adicionar o HLA-A2 de ligação HER-2/neu péptido P369-377 (amino KIFGSLAFL sequência de ácido) ou gripe péptido p58-66 (GILGFVFTL) directamente aos poços a uma concentração final de 10 ug / ml e local de HLA-A2-binding numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  4. Para ajudar a estimular e expandir as células T, adicionar a cada 2 dias, mídia 250 ul / poço fresco suplementado com IL-2 recombinante humana (estoque: 50 unidades / ul) para obter uma concentração final de 50 unidades / mL em meio de cultura.
  5. Re-estimular as células de cultura com 2 x 10 6 células / ml PBMC irradiados autólogos pulsados ​​durante 2 horas com 10 ug / ml de usar os mesmos péptidosd na etapa 1.3 e adicionar estas células para culturas em 1 ml / poço de uma semana após o primeiro estímulo de péptidos.
  6. Adicionar IL-2 e fresco meios recombinantes humanas, conforme descrito no Passo 1.4, para as culturas existentes a cada 2 dias.
  7. Re-estimular as células com PBMC autólogas irradiadas e peptídicos, conforme descrito no Passo 1.5, uma semana após a segunda estimulação de péptidos.
  8. Prepare-se para usar as células seis dias após a última re-estimulação, no mínimo.

2. Preparação das células do cancro da mama

  1. Coloque a estação de medição de impedância xCELLigence (estação xCELLigence) em uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  2. Colheita de células tumorais humanas (SKBR3, BT20, MCF7 ou HCC1419) que são 75% confluentes usando 0,25% de tripsina e centrifugação (1000 rpm durante 5 minutos).
  3. Contar as células tumorais utilizando um hemocitómetro e reconstitui-las em meio RPMI tumorais (suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 500 unidades / mlIFN-gama), a uma concentração de 7,5 x 10 3 de tumor células/100 ul.
  4. Programe o software xCELLigence através da criação do layout de página para determinar bem o layout e criando a página de agenda para fazer leituras de impedância a cada 5 minutos por um período de 40 horas. Para as primeiras 18 horas, o sistema levará xCELLigence leituras de impedância de apenas as células tumorais.
  5. Adicionar 100 ul de meios RPMI tumorais ao xCELLigence E-chapas e realizar uma leitura de fundo através da medição da impedância, na ausência de células.
  6. Adicionar células tumorais para o e-placas a 100 l por bem e coloque na estação xCELLigence.
  7. Pressione o botão de arranque do software xCELLigence para começar a fazer leituras de impedância das células tumorais, o que imediatamente começam a aderir ao e-pratos.

3. Co-cultura de tumor com células T CD8

  1. Uma vez que as células tumorais têm atribuído, duplicando a 1,5 x 4 10 células tumorais por poço (aproximadamente 18 horas depois de inicialmente ser banhado), as células T colheita preparado na Seção 1, por raspagem suave e agitação
  2. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 minutos e contagem de células T usando um hemocitómetro e reconstitui-las em meio RPMI com FBS a 10% a várias razões, a partir de uma proporção máxima de uma célula de tumor de 40 células T e dilua duas vezes até que uma razão de uma célula de tumor para 1,25 células T é atingido. Por exemplo, existem 1,5 x 4 10 células tumorais por poço. Para alcançar uma proporção de 1:40, adicionar 6 x 10 5 células T por poço e diluir as células T de 2 vezes até uma proporção de 1,5 x 4 10 células tumorais a 1,875 x 10 4 células T por poço (razão 1:1,25) seja alcançado.
  3. Pausa da estação xCELLigence e remova o E-plate.
  4. Remover os meios das cavidades com uma pipeta e adiciona-se 200 ul de meio por si só ou a proporção adequada de células T aos poços.
  5. Coloque a parte de trás E-chapa na estação xCELLigence e continuar o pro software xCELLigencegram assim leituras de impedância são tomadas a cada 5 minutos durante cerca de 20 horas após a adição das células T.
  6. Normalizar os resultados no final do ensaio.

4. Chromium Lançamento Assay (CRA) 7

  1. Siga os procedimentos institucionais de segurança de radiação ao trabalhar com 51 Cr e 51 células-alvo Cr-marcadas. Use sempre proteção adequada para reduzir a exposição à radiação.
  2. Células tumorais de pulso durante 2 horas a 1 x 10 6 / ml, as células tumorais com 10 ul / ml de fresco de 51Cr (0.005 Ci / ml).
  3. Lave as células de tumor em 10 ml de meio RPMI com FBS a 10% e centrifuga-se a 1.000 rpm durante 5 minutos. Adicionar as células tumorais a uma placa de 96 poços de fundo redondo, a 1 x 10 5 células tumorais em 100 ul / poço.
  4. Adicionar células T em várias proporções, a partir de uma célula de tumor de 40 células T e dilua duas vezes até que uma razão de uma célula de tumor para 1,25 células T é obtida. Por exemplo, existem 1 x 10 5 células tumorais por poço. Para alcançar uma proporção de 1:40, adicionar 4 x 10 6 células T por poço e diluir as células T de 2 vezes até uma proporção de 5 x 10 células de um tumor para 1,25 x 10 5 células T por poço (razão 1:1,25) seja alcançado.
  5. Adicionar controlos de células tumorais espontâneas e máxima à placa. A fim de calcular a libertação espontânea de 51Cr a partir das células de tumor, adicionar seis poços contendo cada um 1 x 10 5 células tumorais em 100 ul a 100 ul de meio RPMI com 10% de FBS. Para calcular a libertação máxima de 51Cr a partir das células de tumor, adicionar seis poços, cada uma contendo 5 x 10 células de tumor em 1 100 uL a 100 uL de 0,1% de Triton X-100 em PBS, que lisa todas as células.
  6. Incubar as placas durante 5 horas a 37 ° C com 5% de CO 2.
  7. Após a incubação, remove 50 ul do sobrenadante de cada poço e adicioná-lo a uma chapa de Luma.
  8. Secam-se as placas durante a noite e medir CPM usando um contador gama.
le "Lise Cálculo> 5. Percent

  1. Ensaio de impedância: Tome a leitura de impedância, informou que o índice de células (CI), em vários momentos e usar a seguinte fórmula para determinar a percentagem de lise: (tumor CI só - (células tumorais + T IC)) / (apenas tumor CI) * 100.
  2. CRA: Use a seguinte fórmula para determinar a percentagem de lise: (CPM experimental - CPM espontânea) / (CPM máximo - CPM espontânea) * 100.

6. Os resultados representativos

Células T por si só não aumentar impedância

As células T, em geral, não aderem à maioria das superfícies sólidas e não necessitam de adesão para a activação e proliferação. Portanto, se a hipótese de que as células T não deve contribuir para a impedância no xCELLigence E-chapas. Para testar isso, os poços foram carregados com tanto SKBR3 células humanas de câncer de mama ou de células T CD8 recém purificadas. A impedância foi medida ao longo de 40 horas e um exemplo representativo demonstClassificação essencialmente pouco efeito das células T é mostrado na Figura 1A. Em contraste, pode-se argumentar que as células T podem diminuir a impedância do fundo, embora apenas ligeiramente. Apesar disso, a co-cultura revelou que o processo de adição de células T em 18 horas após o início das medições de impedância resultou numa ruptura de impedância (Figura 1B). Outros estudos revelaram que as rupturas eram devidos, em parte, uma vez que a manipulação do sinal de diminuição em poderia ser reduzida, assegurando que a temperatura da solução de t-contendo células foi o mesmo que o interior da incubadora.

Reduções na impedância mediada por células T é dependente da dose.

A utilidade de um ensaio à base de impedância para comparar as amostras para a actividade de células T citotóxicas requer a capacidade de distinguir entre as diferentes concentrações de células T específicas do antigénio. Para testar se é possível, as células SKBR3 foram co-cultivados com concentrações variandoções de células T derivadas de um HER-2/neu P369 específico da linha de células-T. Como mostrado na Figura 2A, as reduções foram de impedância dependente da dose de células T. Figura 2B mostra que os índices de células em 10 horas seguir uma simples polinomial de segunda ordem em relação ao intervalo de células T. Assim, a estação xCELLigence monitora a morte mediada por células T CD8 de células de tumores SKBR3 em tempo real, como uma queda no índice de células.

O ensaio baseado em impedância detecta as células T específicas do antigénio

Para determinar se as reduções na impedância de SKBR3, o que é uma linha de células do cancro de HER-2/neu e HLA-A2 positiva do tumor da mama, por HER-2/neu P369 células T específicas de antigénio foram poços específicos, separadas contendo SKBR3 foram também incubadas com células T derivadas de um vírus influenza (FLU)-específica da linha de células-T. As células T específicas de GRIPE serviu como controlo não específico, sendo o HLA-A2 positivos, mas não ter qualquer capacidade para reconhecer HER-2/neu. Como se mostra na Figura 3, há uma diferença significativa entre a actividade lítica de células T P369 HER-2/neu específicos, em comparação com as células T específicas do Flu (p <0,0001). Em alguns casos, as células T não específicas para tumor (estimulada por exemplo FLU-específica ou anti-CD3/anti-CD28), demonstrou um baixo nível de actividade lítica (Figuras 3A-B). Células T pode matar em uma das duas maneiras, ou não especificamente através Fas: interações ligante Fas ou antígenos especificamente através da liberação de granzimas e perforinas. Para corroborar ainda mais a noção de que as células T HER-2/neu-specific estavam matando de forma antígeno-específica, que incorporou um anticorpo bloqueador de Fas ligante. Tal como mostrado na Figura 3B, o anticorpo, não reduziu a actividade lítica de células T a HER-2/neu P369 específicas. O anticorpo pode inibir as interacções entre Fas e ligando Fas, tal como demonstrado com as células T que foram activadas de forma não específica com anti-CD3/CD28 grânulos. Estes resultados sugerem que, quandocélulas T específicas do tumor são testados com células T não-tumorais específicos, ligando Fas bloqueio pode ser necessário para reduzir o não-TCR interacções mediadas para um mínimo. Alternativamente, quando se utiliza a curto prazo em cultura linhas de células T, em que apenas uma fracção das células T são específicos para o antigénio utilizado para a geração ex vivo, a possibilidade de activação da célula T mediada por MHC de incompatibilidade pode ocorrer levando a lise não específica. Neste caso, a adição de anticorpos que bloqueiam as HLAs irrelevantes podem ser garantidos. Para determinar se as células T específicas do P369 foram matar células tumorais de HLA de classe I de uma maneira dependente, ou anticorpo anti-HLA de classe I ou de anticorpo de controlo de isotipo foram adicionados a co-culturas. Como mostrado na Figura 3C, a lise pelas células T específicas do P369 foi suprimida através da inclusão de anticorpos demonstrando HLA de classe I de restrição. Por fim, uma vez que o desenvolvimento deste ensaio foi feito em grande parte o uso SKBR3, era importante determinar se o HLA-aderente outraCélulas tumorais que expressam A2 e HER-2/neu podem ser mortas por células T específicas do P369. Assim, as células T foram preparadas e adicionadas a uma proporção de 1:5 para o HLA-A2 e as células tumorais HER-2/neu-expressing, SKBR3, células MCF-7, e HCC1419 células. A linha de células de tumor negativas para HLA-A2, BT20 foi utilizado como um controlo negativo. Tal como mostrado na Figura 3D, todas estas células de tumor adicionais, excepto BT20 também foram mortos, tal como avaliado por impedância. Assim, o método parece ser útil para várias células tumorais aderentes alvo.

O ensaio à base de impedância é mais sensível do que o ensaio de libertação de crómio padrão para a detecção de actividade de células T citotóxicas

A (51 Cr) ensaio de liberação de cromo (CRA), que mede a atividade citolítica tem sido o padrão ouro pelo qual monitorar respostas de células T CD8 +. Neste ensaio, as células-alvo (por exemplo, células tumorais) são marcadas com 51Cr. Na maioria dos casos, as células-alvo saudáveis ​​pode reter a maioria doradioativamente ao longo do ensaio. As células T CD8 são adicionadas às células alvo, geralmente em concentrações variáveis, e de matar as células-alvo é detectado por libertação do 51Cr para o meio. Afora o fato de que ele usa a radiação perigosa, dois grandes problemas com o CRA é uma falta de sensibilidade e que o ensaio normalmente requer grandes quantidades de células T CD8, o que limita sua utilidade. Para determinar se o ensaio com base na impedância é mais sensível do que as células P369 CRA-específicas, HER-2/neu T foram gerados in vitro e aplicado, em quantidades variáveis, quer para os E-placas contendo as células tumorais não marcados ou placas de polipropileno padrão que contêm 51Cr-labeled células alvo. As medições de impedância, ou de crómio ou livre, foram medidos a 5 horas após a adição das células T. Figura 4, um exemplo representativo, mostra o ensaio de impedância supera a libertação de crómio.

A variação intra-ensaiodo ensaio com base na impedância é tipicamente inferior a 20%.

Variação intra-ensaio foi examinado, uma vez que uma maior utilização deste ensaio será determinada principalmente pelo seu modo reprodutível e de variação (Figura 5). Duas linhas de células T específicas do P369 foram geradas independentemente 30 dias separados e adicionados em triplicado numa gama de células tumorais para razões de células T. O gráfico de inserir na Figura 5 mostra que as linhas eram substancialmente equivalente, em termos de lise de células SKBR3. O coeficiente de variação% foi calculado em relação a cada célula e traçados. Como mostrado na Figura 5, entre 1:40 e 01:05 rácios dos coeficientes de variação (CV)% estavam abaixo de 15%. No 1:1,25 e 1:2,5, no entanto, os CVs foram alta ou imprevisível. Devido à grande variação biológica, não é possível medir a variabilidade inter-ensaio com linhas de células T primárias.

Figura 1
Figura 1. Impedância deve ser normalizada após a adição das células T. Painel A: demonstra que as células tumorais (linha vermelha) e não as células T (linha azul) são responsáveis ​​pela impedância. São mostrados os traçados de impedância mais de 40 horas para as células ou tumor ou T sozinho. Resultados semelhantes foram obtidos a partir de uma segunda experiência. Note-se que a perturbação do sinal em cerca de 20 horas representa o momento de adição das células T para os poços que contêm as células não tumorais Painel B:. Mostra que as medições de impedância são transitoriamente interrompida com a adição de células T para as células tumorais. Isto requer a normalização em algum ponto no tempo após a adição das células T (ver o ponto de normalização marcados em gráfico). Traços são compostas de pontos de dados duplicados. O traço de células tumorais só é mostrado em vermelho. Os outros traços representam células tumorais co-cultivados com HER-2/neu células T P369-específicos (Azul: proporção de 1,25 células T / células do tumor, Verde:proporção de 40 células T / células tumorais). Cada traço é calculado a partir de pontos de dados em duplicado recolhidas a cada 5 minutos através da duração da cultura. Os resultados são representativos de três experimentos separados. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 2
Figura 2. A redução da impedância mediada por células T é dependente da dose. Painel A: São mostrados os vestígios de impedância de SKBR3 células tumorais incubadas sozinhas ou com concentrações variáveis ​​de células T específicas do tumor. Cada traço é calculado a partir de pontos de dados recolhidos em triplicado a cada 5 minutos através da duração da cultura. Os resultados são representativos de três experimentos separados Painel B:. São mostrados os índices de células em 10 horas em todas as concentrações de células de células / tumor T. A linha tracejada representa o índice de células para as células tumorais alum. Cada símbolo é a média (± SEM) de determinações em triplicado. Os resultados são representativos de três experimentos separados. Clique aqui para ver a figura maior .

Figura 3
Figura 3. O ensaio baseado impedância detecta as respostas específicas de antigénio de células T citotóxicas. O painel A mostra o nível de lise das células SKBR3 pelo HER-2/neu células T específicas do P369 (vermelho) ou células T específicos para FLU (azul) em 5, 10, e 15 horas após a co-cultura. Cada ponto de dados é a média (± SEM) de medições em triplicado. Os resultados são representativos de três experiências separadas. Painel B mostra a lise de SKBR3 por células T específicas do P369 ou células T não-especificamente activados, o que demonstra que a lise específica do antigénio não é devida a interacções ligando Fas-Fas. As barras pretas representam co-culturas quecontinha um anticorpo do ligando de Fas. Cada barra representa a média de lise (± SEM) em triplicado a 5 horas após a adição das células T. Os resultados são representativos de três experiências separadas. Painel C mostra a lise 10 horas após a adição das células T de SKBR3 por células T específicas do P369 é de classe I HLA-dependente. Qualquer classe I HLA-bloqueio ou de controlo de isotipo foi adicionado durante a co-cultura. Cada barra representa a média de lise (± SEM) em triplicado. Esta experiência foi repetida duas vezes com resultados semelhantes. Painel D mostra a% de lise 10 horas após adição de vários HLA-A2 +, HER-2/neu-expressing linhas de células de tumor P369 por células T específicas de células-T. BT20, uma linha celular de cancro da mama HLA-A2 negativo foi usado como controlo negativo. Cada ponto representa uma experiência única calculado a partir de determinações em triplicata. Clique aqui para ver a figura maior .

"Figura Figura 4. O ensaio baseado impedância é mais sensível do que o ensaio de libertação de crómio para a detecção de células T específicas para o antigénio tumoral. São mostrados% de lise de SKBR3 em resposta a várias concentrações de células T específicas do P369, como medido em 5 horas após o tumor e células T misturando utilizando tanto o ensaio à base de impedância e o ensaio de libertação de crómio. Cada símbolo é a média (± SEM) de três réplicas. Os resultados são representativos de três experiências separadas.

Figura 5
Figura 5. % Coeficientes intra-ensaios de variação do ensaio com base na impedância da citotoxicidade das células T. Apresentados são médias% coeficientes (± DP) intra-ensaio de variação de lise de SKBR3 mais de uma gama de concentrações de células T específicas do antigénio. Cada símbolo é a média de três réplicas. Os números mostrados no gráfico são tele quer dizer% currículos. painel Inset mostra a média (± SEM, n = 3)% de lise de SKBR3, em diferentes concentrações de células T P369-377 específicos. Duas linhas de células T específicas do P369 gerados independentemente utilizando células T a partir de dois doadores diferentes são mostrados.

Discussion

As células T CD8 + são importantes para a resposta imune adaptativa, sendo capaz de matar directamente as células infectadas ou malignas 4. Embora haja várias maneiras de medir o número de células específicas de antigénio de células T CD8 (por exemplo, ELISPOT, tetrero, citometria de fluxo), muitas vezes, é útil saber se estas células são funcionalmente citotóxico 3. O ensaio mais reconhecível para a avaliação da função citotóxica é o PCR, o qual é considerado o 4 de ensaio padrão de ouro. As principais limitações do PCR são: (1) o requisito de radioactividade, (2) a falta de sensibilidade, (3) falta de informação mecanicista, (4) para o requisito de grandes quantidades de células, e (5) acima conjunto trabalhoso. Assim, ao longo da última década, tem havido um interesse na adoção de novas estratégias para minimizar essas limitações. Mais recentes abordagens incluem aqueles que medem caspase release 4, BLT esterase activity5 e expressão de superfície de CD107 6. O presente manuscrito sugere queo ensaio com base na impedância, executadas no sistema de xCELLigence Roche, podem também ser úteis como uma alternativa para a PCR. A capacidade de se adaptar a abordagem baseada em impedância baseia-se na observação de que as células T, que não aderem firmemente às superfícies, não parecem ter muito impacto sobre impedância diminuindo, assim, qualquer preocupação de interferência direta das células T com a medição. A mão de obra necessária para a utilização do sistema de ensaio da impedância deve ser significativamente menos principalmente devido à eliminação das preocupações regulamentares para a utilização de radioactividade. A única desvantagem notável do sistema baseado na impedância é que um dispêndio de $ 50.000 a $ 60.000 é necessária para a aquisição da unidade de xCELLigence. No entanto, a unidade xCELLigence elimina a necessidade de um contador de radiação e é muito mais versátil, sendo útil para avaliar a resposta celular aos medicamentos e à migração, além de citotoxicidade de células T 8.

As observações de quea diminuição na impedância de células de tumor é dependente da dose, como ilustrado na Figura 2, com uma inclinação relativamente acentuada na sequência de uma função quadrática simples secundário sugere que o ensaio pode ser utilizado em ensaios de diluição limitante (ADLs) para estimar a frequência de células citotóxicas 9 . Uma vantagem da abordagem baseada em impedância é que o número de células T e células tumorais exigido é inferior ao CRA, tornando LDA potencialmente mais viável. Por exemplo, na PCR, a uma razão 1:40, 1 x 10 5 células por poço tumorais são banhados que necessita de 4 x 10 6 células T totais por poço. No entanto, no ensaio baseado em impedância, são necessários apenas 1,5 x 4 10 células tumorais por poço, que consome apenas 6 x 10 5 células T totais por poço. Deste modo, o ensaio baseado em impedância utiliza 85% menos células T e as células tumorais. Esta redução indica que o sistema à base de impedância pode ser adaptado para monitorização imunológica em ensaios clínicos em humanos em que tele volumes de sangue chama pode ser limitada. Além disso, enquanto que a PCR se limita a um único ponto de tempo, o ensaio baseado em impedância recolhe dados contínua em tempo real, permitindo ao utilizador comparar vários pontos de tempo de lise no mesmo experimento com um mínimo de trabalho adicional e células. Cálculos de frequência poderia ser combinado com outras estratégias que não medem função como tetrâmero análises para determinar a proporção de células T citotóxicas ao total funcionais específicos para o antigénio das células T CD8 10. Uma das características mais atraentes da abordagem baseada na impedância é que, ao contrário da maioria dos outros ensaios, citotoxicidade pode ser monitorado em tempo real, o que poderia tornar mais fácil para estudar as interações celulares com o uso de inibidores ou anticorpos. Outra é que o método pode ser adequado para as células de tumor que resistem a rotulagem. Finalmente, uma vez que as células tumorais não são mortas não marcado e permanece esterilizado, mais colheita e estudo das células T de células resistentes é possívle.

Em resumo, embora ambos os sistemas fornecem tumorais matam dados em resposta a células T específicas, o ensaio baseado em impedância é mais sensível do que o PCR e proporciona uma plataforma mais flexível.

Disclosures

Produção e acesso gratuito deste vídeo-artigo é patrocinado pela Roche Diagnostics.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado por doações para Keith L. Knutson da Susan G. Komen for the Cure Foundation e NIH / NCI 9R01 CA152045 e P50-CA116201.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ficoll-Paque Plus GE Healthcare 17-1440-03 Used to isolate PBMCs from blood
RPMI 1640 Cellgro 10-040-CV Cell culture media
FBS Denville Scientific FB5001-H Cell culture media
Human IL-2 eBioscience 14-8029-81 For stimulating growth of T cells
Human Interferon gamma Cell Sciences CR2026 For stimulating MHC expression in tumor cells
HER-2/neu p369-377 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence KIFGSLAFL Binds to HLA-A2
Influenza p58-66 peptide Mayo Clinic peptide synthesis core amino acid sequence GILGFVFTL Binds to HLA-A2
Human CD3/CD28 Dynabeads Invitrogen 111-61D For non-specific T cell activation and expansion
Chromium-51 MP Biomedicals 62015 CRA labeling reagent
E-plate Roche Group 05469830001 For xCelligence impedance unit
Luma plate 96 PerkinElmer, Inc. 6005630 For measuring radioactivity in the Top Count NXT.
xCelligence RTCA DP Station Roche Applied Science RTCA DP Impedance unit
Top Count NXT PerkinElmer, Inc. C990601 Scintillation & Luminescence Counter
Fas Ligand antibody BD Biosciences 556372 For blocking Fas-Fas ligand interactions
HLA-A2 BB7.2 antibody BD Biosciences 551230 For blocking HLA class I
Mouse IgG2b, κ BD Biosciences 555740 Isotype control for HLA class I
SKBR3 tumor line ATCC HTB-30 Adenocarcinoma
MCF7 tumor line ATCC HTB-22 Adenocarcinoma
HCC1419 tumor line ATCC CRL-2326 Primary ductal carcinoma
BT20 tumor line ATCC HTB-19 Carcinoma

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References

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