ポリメラーゼ連鎖反応:基本的なプロトコルプラスのトラブルシューティングと最適化戦略

Biology
 

Summary

PCRは、多くの分子生物学の研究室で一般的な手法として登場しました。いくつかの従来のPCRプロトコルへのクイックガイドですここで提供される。各反応はユニークな実験であるため、製品を生成するために必要な最適な条件は異なります。反応の変数を理解することは非常に所望の結果を得ることができる機会を増やすことは、トラブルシューティングの効率を向上させます。

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Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998, doi:10.3791/3998 (2012).

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Abstract

生物学の発見の黄金時代に規律をカタパルト技術の進歩がありました。例えば、微生物学の分野は​​、科学者が初めての原核生物を可視化することができアントン·ファン·レーウェンフックの顕微鏡の出現で形質転換した。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の開発は、その影響は生物学で無数のsubdisciplinesにまたがると分子科学のコースを変更された技術革新の一つです。理論的なプロセスは1971年にKeppeや同僚で概説された、完全なPCR手順はシータス社の1985年の間にキャリーマリスによって記述され、実験的に適用されるまで、しかし、それは別の14年であった。この手法の自動化と洗練は、細菌サーマスのアクア 、結果的に名前のTaq DNAポリメラーゼの熱安定性DNAポリメラーゼの導入により、進行した。

PCRは、ポウです。出発材料の少量(すなわち、鋳型DNAまたは標的配列)のみからのDNAの特定のセグメント(すなわち、アンプリコン)の十分な供給を生成することができますrful増幅技術。単純な、一般的にトラブルフリーながら、誤った結果を生成する反応を複雑に落とし穴があります。 PCRが失敗したとき、それはアガロースゲル上のバンドのラダーまたはスメアとして現れ、さまざまなサイズの多くの非特異的なDNAの製品につながることができます。時々ない製品は全く形成されない。突然変異は意図せずにPCR産物の不均一な集団で、その結果、増幅産物に導入されたときに、別の潜在的な問題が発生します。忍耐と慎重なトラブルシューティングが整理し、問題(s)を解決するために採用されていない限り、PCRの失敗は、イライラになることができます。このプロトコルは、PCRの基本原理を概説し、ほとんどの標的配列の増幅をもたらす方法論を提供し、反応を最適化するための戦略を提示。このPCRガイドは、stに従うことにより、udentsのことができるようになります。

  • 従来のPCR実験のための反応と熱サイクル条件を設定
  • 様々な反応成分の機能とPCR実験で彼らの全体的な効果を理解する
  • 任意のDNAテンプレートのPCR実験の設計と最適化
  • 失敗したPCR実験のトラブルシューティング

Protocol

1。設計プライマー

適切なプライマーを設計するPCR実験の成功の結果に不可欠です。増幅のための所望のDNAの特定領域へのプライマーのセットを設計するとき、一方のプライマープラス慣例により5 '→3'方向に配向されるストランド(また、センスまたは非テンプレート鎖としても知られる)とにアニールする必要があります他のプライマーは3 '→5'方向(アンチセンス鎖またはテンプレート)に配向されるマイナス鎖を補完する必要があります。むしろその後、2)プライマーが互いにアニールする鋳型DNAプライマーを作成し、1)自己アニーリングのようなヘアピンループ( 図1a)のような二次構造の形成を生じるプライマーを:プライマーを設計する際に発生するいくつかの共通の問題があります。ダイマー( 図1b)、各プライマーの3)は大幅に異なる融解温度(T m)で、それが難しいすべてのなるアニール温度を選択するために作成フロー両方のプライマーが効率的にthemalサイクリング( 図1c)(T M Sの詳細については、サイクリング条件に融解温度(T m)とMODIFICATIONSを計算するのセクションを参照してください)の間に彼らの標的配列に結合する。

  1. 以下のプライマーを設計する際に考慮すべき特性のリストです。
    1. プライマーの長さは15から30ヌクレオチド残基(塩基)である必要があります。
    2. 最適なGC含量は40から60パーセントの範囲である必要があります。
    3. プライマーの3 '末端はプライミング効率を高め、プライマーをクランプし、両端の "呼吸"を防ぐために、GまたはCを含める必要があります。両端がアニール滞在がほつれや裂けていない場合にDNA "呼吸"が発生します。 GCペアで3つの水素結合が呼吸を防ぐのを助けるだけでなく、プライマーの融解温度を上昇させる。
    4. プラス鎖プライマーおよびマイナス鎖プライマーを含むプライマーセットの3 '末端は、Cであるべきではありませんお互いにomplementary、または単一のプライマーの3 '末端はプライマー内の他の配列と相補的になることができます。これら2つのシナリオはそれぞれ、プライマーダイマーやヘアピンループ構造の形成につながる。
    5. 範囲は45から65に拡大することができますが52から58°Cの間にプライマーの最適な融解温度(T m)は、℃、両方のプライマーの最終的なT m は、以上5未満で異なる℃以下とします。
    6. 彼らが形成するDNAとやヘアピンループ構造のプライミングセグメントに沿って滑る原因となりますのでジヌクレオチドリピート(例えば、GCGCGCGCGCまたはATATATATAT)、または単一の基本の実行(例えば、AAAAAまたはCCCCC)は避けるべきである。 DNAテンプレートの性質上やむを得ない場合は、その唯一の繰り返しを含めるか、または単一のベースは、4塩基の最大値で実行されます。

注意:

  1. プライマーペアを設計に役立つように設計された多くのコンピュータ·プログラムがあります。 NCBIのプライマーデザイン·ツールw.ncbi.nlm.nih.gov /ツール/プライマーブラスト/ "ターゲット=" _blank "> http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/とPrimer3のhttp://frodo .wi.mit.edu/primer3は/この目的のためにウェブサイトをお勧めします。
  2. 関連の偽または相同体の増幅を回避するためには、プライマーの標的特異性を確認するためにNCBIのBLASTを実行すると便利かもしれません。

2。材料と試薬

  1. PCR実験をセットアップするとき、それは準備することが重要です。反応混合物または試薬の汚染を避けるために手袋を着用してください。ネガティブコントロールが含まれており、ポジティブコントロール可能であれば。
  2. 新たにいっぱいアイスバケットのPCR実験に必要なすべての試薬 ​​を配置し、それらの反応( 図2)を設定する前に、完全に解凍してみましょう。実験を通して氷上に試薬を保持します。
    • 標準的なPCR試薬が含まれてい増幅される、目的の標的遺伝子またはDNAセグメントは、DNAポリメラーゼ、特定のDNAポリメラーゼ、デオキシヌクレオチド(dNTPを)、DNAテンプレート、および滅菌水のバッファに適したプライマーのセット。
    • 1〜10%の最終濃度で、追加の試薬 ​​は、ジメチルスルホキシド(DMSO、マグネシウム塩のMg 2 +(0.5から5.0 mMの終濃度)、カリウム塩のK +を (35から100 mMの最終濃度)を含むことができる(10-100μg/ mlの最終濃度))、ホルムアミド(1.25から10までパーセントの最終濃度)、ウシ血清アルブミン、及びベタイン(0.5 M〜2.5 Mの最終濃度)。添加剤は、トラブルシューティングのセクションでさらに議論されています。
  3. ワークベンチで実験装置を整理します。
    • 10μlの(P10)、2 - - 20μL(P20)、20から200μL(P200)材料は、PCRチューブおよびキャップ、PCRチューブ用ラック、エタノール耐性マーカー、と1の間で分配するmicropipettorsのセットが含まれていますと200 - 1000液(P1000)のほか、サーマルサイクラー。
    • すべてが同じ試薬を使用しているいくつかのPCR実験を設定するとき、それらは適切にスケーリングされ、マスター混合物(マスター·ミックス)で一緒に組み合わせることができます。このステップは、(ノートを参照してください)​​滅菌1.8ミリリットルマイクロチューブで行うことができます。
    • PCR実験から得られた増幅産物を分析するために、アガロースゲル電気泳動用試薬と機器が必要になります。 PCR産物のおおよそのサイズに、適切な場合には、市販の分子量サイズの標準が必要となります。

3。反応混合物を設定する

  1. 表1を参照)反応混合物に添加される試薬のテーブルを作ることから始めます。
  2. 次に、エタノール耐性マーカーを持つラベルPCRチューブ(秒)。
  3. 反応容量は、株式の試薬の濃度に応じて異なります。最終濃度(CF)の典型的な50μlの反応のために、次のとおりです。
    • Xバッファ(通常はDNAポリメラーゼの製造元から提供され、15 mMのMgCl 2を含む場合があります)。反応あたり10Xバッファー5μlを添加します。
    • 200μMのdNTP(4つのヌクレオチドの各50μM)。反応当たりの10mMのdNTP(をdATP、dCTP、dTTPのとdGTPを2.5mMのそれぞれである)を1μlを追加します。
    • 1.5mMのMg 2 +の 。それは10Xバッファ内に存在しないまたはPCRの最適化のために必要な場合のみ追加します。例えば、4.0 mMのMg 2 +の未知Mycobacteriophage反応( 図3)に25 mMのMgCl 2の8μlを加えるに見られる保存された566 bpのDNAセグメントの最適なアンプリコンの生産に必要なを取得します。
    • 各プライマーの20〜50 pmolの。各20μMのプライマー1μlを追加します。
    • 4月 10日から7月 10日までの分子(または1000から1約1ng)DNAテンプレートを追加します。 2ng /&ムーの0.5μlを加え、LゲノムDNAをMycobacteriophage。
    • 例えば、50μlの反応あたりのDNAポリメラーゼ(メーカーの推奨事項を参照)の0.5から2.5の単位を追加し、0.5シグマμlの0.5単位/μlのTaq DNA ポリメラーゼを追加します。
    • (QSは必要とされる金額をいう量子サティスのラテン語の省略形です)試薬のテーブルに事前に決定された反応あたり50μlの最終容量を取得するにはQS滅菌蒸留水を追加します。したがって、反応あたり33μlを50μlにボリュームを起動する必要があります。しかし、それは水が​​最初に追加されていますが、最初に試薬のテーブルを作り、反応液に加え、他のすべての試薬の量を決定する必要であることに留意すべきである。

4。基本的なPCRのプロトコル

  1. 0.2ミリリットル薄壁PCRチューブのホルダーとして氷のバケツに96ウェルプレートを配置します。 PCR試薬は冷0.2ミリリットル薄壁PCRチューブに添加することを許可するとnucleasを防ぐことができます電子活性および非特異的プライミング。
  2. 滅菌水、10X PCRバッファー、dNTPを、MgCl 2を 、プライマー、テンプレートDNA( 表1を参照してください):0.2ミリリットル薄壁PCRチューブ( 図4)に次の順序で、以下のPCR試薬をピペット。実験は少なくともネガティブコントロール、おそらくポジティブコントロールを持っているはずなので、それは1.8 mlのマイクロ遠心チューブにマスターミックスをセットアップする(Notesの説明を参照してください)​​に有益である。
  3. 独立した0.2ミリリットル薄壁PCRチューブ( 図4)ネガティブコントロール(不足しているボリュームを補うために水を増加させる)ためのテンプレートDNAを除くすべての試薬 ​​を追加します。さらに、別の反応は(試薬は使用可能な場合)テンプレートDNAとか、以前に実験的なPCRチューブと同じ条件で増幅することが知られているプラ​​イマーを用いてポジティブコントロールを含める必要があります。
  4. Taq DNA ポリメラーゼは、通常、50%グリセロールに格納されています溶液と反応ミックスを完全に分散するためには、少なくとも20回上下にピペッティングによりPCR試薬の穏やかに混合する必要があります。ミキシング時にピペットは、マスターミックスの約半分の反応ボリュームに設定する必要があります、と注意が気泡を導入することを避けるために注意するべきです。
  5. 0.2ミリリットル薄壁PCRチューブにキャップを置き、サーマルサイクラー( 図5)に配置します。サーマルサイクラーの蓋がしっかりと閉じられると( 表2を参照)プログラムを起動します。
  6. プログラムが終了したときに、0.2ミリリットル薄壁PCRチューブを4℃で削除して保存することができるPCR産物を臭化エチジウムで電気泳動後にゲルに移行したDNAを染色したアガロースゲルのウェルに各反応のアリコートをロードすることによって検出することができます。 PCR産物が存在する場合は、エチジウムブロマイドは、バンドは、UVイルミネーターで可視化することができるように、DNA鎖の塩基間にインターカレートします。 </ LI>

注意:

  1. 複数のPCR実験をセットアップするとき、それはすべての反応(すなわち、マスター·ミックス)への一般的な試薬の混合物を組み立てることが有利である。通常カクテルは、DNAポリメラーゼ、dNTP、反応バッファー、1.8 mlのマイクロ遠心チューブに組み込ま水の溶液が含まれています。各試薬の量は、反応のトータル数と同等であるプラス10%は最も近い整数に切り上げ反応マスターミックスに追加されます。例えば、ある場合は10×0.1 = 1反応し、(10 + 1)×5μlの10Xバッファがマスターミックスのための10Xバッファー55μlを等しくなります。マスターミックス中の試薬は、上述のように穏やかに約20回上下にピペットのプランジャーをポンプで十分に混合されています。各PCRチューブにDNAテンプレートのマスターミックスのアリコートを、必要なプライマーを受信し、実験に固有の試薬 ​​がします( 表1と表7を参照)が追加されます。
  2. followingのウェブサイトは、テンプレートDNA(のコピー数を決定するための計算機を提供http://www.uri.edu/research/gsc/resources/cndna.htmlを )。二本鎖DNAのコピー数の合計は、次の式を用いて計算することができる。
    / DNA =のコピー数(DNAの量(ng)×6.022x10 23)(DNA X 1×10 9 ng / mlの×650ダルトンの長さ)
    DNAのコピー数を算出する反応ごとに必要とされるどのくらいのテンプレートを決定するために使用されます。
  3. 誤検出は電気泳動後のアガロースゲル上で複数の不要な製品として視覚化であろう別のPCR反応からのキャリーオーバーの結果として発生する可能性があります。したがって、適切なテクニックを使用するのが賢明である、ネガティブコントロール(および陽性コントロール可能な場合)が含まれています。
  4. エチジウムブロマイドは、最も一般的な染色fのですが、またはそこに核酸は、いくつかの安全性と毒性の低い選択肢です。次のWebサイトでは、使用して、(最終製品を検出する方法の説明と一緒にレッドメチレンブルー、クリスタルバイオレット、SYBR Safeの、ゲルを含む代替案のいくつかを説明しhttp://bitesizebio.com/articles/ethidium-bromide-the- alternatives /に )。
  5. 最も近代的なPCRのマシンは、0.2 mlチューブを使用していますが、一部のモデルは、0.5 mlチューブでの反応が必要な場合があります。適切なサイズのチューブを判断するには、サーマルサイクラーのマニュアルを参照してください。

5。計算融解温度(T m)

  1. プライマーの融解温度(T m)を知ることは、成功したPCR実験のために不可欠です。利用可能ないくつかのT m 計算がありますが、それはこれらの計算が原因で実際のT mの推定値であることに注意することが重要である T mの計算機自体のアルゴリズムで行われた特定の反応と仮定に関する特定の情報が不足している。のT m≈4(GC)+ 2(AT):しかし、最近傍の熱力学モデルは、従来の計算よりも優先されます。それは考慮に隣接する塩基対のスタッキングエネルギーを要するため、前者はより正確なT mの推定を与える。計算は単純で、手で素早く行うことができるため、後者はより頻繁に使用されています。様々なPCR条件と添加剤が溶融温度にどのような影響を与えるかについては、トラブルシューティングのセクションを参照してください。
    最近傍熱力学的モデルでT m値を算出するために、次の計算のいずれかが推奨されます。
    http://www6.appliedbiosystems.com/support/techtools/calc/
    EDU /〜ジマー/ oligoTMcalc.html "ターゲット=" _blank "> http://www.cnr.berkeley.edu/〜ジマー/ oligoTMcalc.html
    http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/
    http://www.finnzymes.com/tm_determination.html~~V
    http://mobyle.pasteur.fr/cgi-bin/portal.py?#フォーム::溶融

6。サーマルサイクリング条件を設定

  1. 急速に熱と冷却PCRサーマルサイクラー反応混合物、プラスとマイナスの鋳型DNAの鎖と​​、PCR産物の伸長へのプライマーのアニーリング、二本鎖DNAの熱による変性(鎖分離)が可能になります。サイクル時間は、テンプレートのサイズおよびDNAのGC含量に基づいて計算されます。一般formul94℃、初期変性ステップで始まる°C〜98°CのDNAポリメラーゼ活性の最適温度と鋳型DNAのGC含量に応じて。典型的な反応は94℃で1分間変性℃で開始します3分以上、もはやその酵素活性を破壊し、DNAポリメラーゼを不活性化する可能性があります。ホットスタートPCRと呼ばれる1つの方法では、大幅に最大9分〜3分の初期変性時間を延長します。最初の誇張された変性ステップが終了した後にホットスタートPCRを使用すると、DNAポリメラーゼが追加されます。このプロトコルの変更は、DNAポリメラーゼ酵素の可能性が高い不活化を回避することができます。ホットスタートPCRやその他の代替方法の詳細については、このプロトコルのトラブルシューティングセクションを参照してください。
  2. 次のステップは3段階の温度サイクルの25から35ラウンド( 表2)の最初を開始するにはサーマルサイクラーを設定することです。 35上記のサイクル数を増やすことになりながら、PCR産物の大きい量、あまりにも多くのラウンドはしばしば望ましくない副生成物の濃縮をもたらす。単一サイクルの3温度ステップは3つのタスクを達成する最初のステップは、テンプレートを変性(およびそれ以降のサイクルで、増幅産物だけでなく)、2番目の手順は、プライマーのアニーリング最適なことができ、第三段階はにバインドするためにDNAポリメラーゼを許可DNAテンプレートとPCR産物を合成する。サイクル内の各ステップの継続時間と温度は、所望の増幅産物の生産を最適化するために変更される可能性があります。
    変性ステップの時間はできるだけ短くしています。通常10〜60秒は、ほとんどのDNAテンプレートで十分です。変性時間と温度は、鋳型DNAのGC含量と同様に、それが次への温度から変更するには、サーマルサイクラーにかかる時間です。ランプ·レートによって異なる場合があります。このステップの温度はそれが最初の変性段階のために使われる、通常と同じです(上記の手順1。例えば、94°C)。
    30秒のアニーリング工程は約5設定温度でのサイクル内で、以下のプライマー°の見かけのT m (理想的には52°C〜58°Cの間)に以下のC。
    サイクルは伸長ステップで終了します。温度は実験用に選択さDNAポリメラーゼに依存しています。例えば、Taq DNA ポリメラーゼは70の最適伸長温度が°C〜80°Cとし、増幅した各追加1キロバイトのための余分な分を必要とし、最初の2キロバイトを長くする1分を必要とします。 Pfu DNAポリメラーゼは、75の最適伸長温度を持つ別の耐熱性酵素℃です。 Pfu DNAポリメラーゼは、PCRと高忠実度を必要とし、増幅される毎に1キロバイトのために2分を必要とするプライマー伸長反応に使用することをお勧めします。それぞれの特定のDNAポリメラーゼのために示さ正確な伸長温度と伸長時間については、製造元の推奨事項を参照してください。
  3. 、Taq DNA ポリメラーゼの場合には、すべてのPCR産物の3 '末端へのアデニン残基の付加を可能にすることができます。この変更は、Taq DNA ポリメラーゼのターミナルトランスフェラーゼ活性により媒介されると3'-オーバーハングを必要とする後続の分子クローニング·プロシージャで使用すると便利です。
  4. 反応の終了は、混合物に4°Cおよび/または最終濃度10 mMにEDTAを添加することによってを冷却することにより達成される。

7。 PCRのトラブルシューティング重要な考慮事項

標準的なPCR条件は、目的のアンプリコンが得られない場合は、PCRの最適化は、より良い結果を達成する必要があります。反応のストリンジェンシーは、特異性は、変数(例えば、試薬を変えることによって調整されるように、変調されてもよいリコンプロファイルの結果に影響を与える濃度、サイクル条件)。反応が十分に厳格でない場合、たとえば、多くの偽のアンプリコンは、変数の長さで生成されます。反応があまりにも厳格である場合、製品が生成されません。トラブルシューティングPCR反応は時にはイライラする努力かもしれません。しかし、慎重に分析およびPCR実験で使用される試薬を十分に理解し、時間と望ましい結果を得るために必要な試験の量を減らすことができます。すべての考慮事項に影響を与えるPCRジェンは、Mg 2 +および/ ​​または可能性がほとんどの問題を解決するアニーリング温度を操作するの滴。しかし、何かを変更する前に、誤った結果が人間のエラーによるものではなかったことを確認してください。すべての試薬を与えられた反応液に添加し、試薬が汚染されていないことをされたを確認して起動します。電気泳動後のゲル上で可視化プライマーダイマーは:また、誤った結果をメモして、次の質問を抵抗(小さなバンドとしてこれらの経営のBレーンの下部にある<100)?そこに、非特定の製品(所望の生成物とは異なるサイズに移行するバンド)ですか?すべての製品の不足がありましたか?プラスミドまたはゲノムDNAの抽出物中の標的DNAは何ですか?また、希望するアンプリコンのGC含量を分析するのが賢明です。

  1. PCR試薬のいずれかがあなたの反応に壊滅的である場合、最初の決定します。これは、新しい試薬(例えば、新鮮な仕事を取り揃えて、新しい希釈液)を調製し、体系的に反応混合物を一度に1つの新しい試薬を加えることによって達成することができます。このプロセスは失敗したPCR実験のために犯人あった試薬が決定されます。多くの場合、阻害剤を蓄積し、非常に古いDNAの場合には、ウシ血清アルブミンの添加は、問題を軽減するのに役立つ可能性があることが実証されている。
  2. プライマーが優先的に自己アニールや反応の他のプライマーをアニールする時プライマーダイマーを形成することができます。この問題が発生した場合、小100未満のbpの製品はアガロースゲル上に表示されます。プライマーにテンプレートの比率を変えることによって起動します。プライマー濃度は、テンプレートの濃度以上の極端な過剰である場合、プライマーは、鋳型DNAを介して自分自身やお互いにアニールする可能性が高くなります。 DMSOを追加したり、ホットスタート、熱サイクルメソッドを使用すると、問題が解決する可能性があります。最終的には新たなプライマーを設計する必要があるかもしれません。
  3. PCRの厳しさは、変数の長さで非特異的なPCRバンドが得過度に低い場合に非特異的な製品が生産されています。これは、アガロースゲル上でラダーの効果を生成します。その後、ストリンジェンシーを上げるPCR条件を選択することをお勧めします。ゲノムDNAを増幅するときにさまざまなサイズの塗抹標本は、高度反復配列に設計したプライマーから生じる可能性があります。ただし、同じプライマーは、同じ問題に遭遇することなく、プラスミド上の標的配列を増幅することができます。
  4. PCR産物の欠乏は、おそらく反応条件によるものであるそれはあまりにも厳しいです。これらの分子が所望のDNAの対応と、もはや塩基対の可能性があるため、プライマーダイマーやプライマーを用いてまたは変性鋳型DNA中のフォームのヘアピンループ構造はまた、PCR産物の増幅を防ぐことができます。
  5. GC含量が分析されていない場合、それはそうする時間です。 GCリッチな領域のPCR(GC含量> 60%)はPCRの最大の課題のいくつかをもたらす。しかし、課題を軽減するために使用されている多くの添加物があります。

8。 PCR試薬を操作する

まず、目的の製品を得るために反応条件を変更する最善の方法を決定する際、従来のPCRに使用する試薬の機能を理解することが重要です。成功は、単にのMgCl 2、KClを、dNTPを、プライマー、テンプレートDNA、あるいはDNAポリメラーゼの濃度を変化さに依存する場合があります。しかし、このような試薬の濃度が間違ってstringencを減少させる、誤った結果につながる可能性があります反応のy。 PCRのトラブルシューティングを行うときは、1つの試薬を同時に操作する必要があります。しかし、それは操作試薬を滴定するのが賢明かもしれません。

  1. マグネシウム塩のMg 2 +(0.5から5.0 mMの最終反応濃度)
    耐熱性DNAポリメラーゼは、マグネシウムの存在が反応の過程で補因子として機能するようにする必要があります。マグネシウム濃度を変更すると、PCRの厳しさに大きな影響を与えるかもしれないで操作する最も簡単な試薬の一つです。一般に、PCR産物の収量は、Mg 2 +の高い濃度の添加で増加します。しかし、のMg 2 +濃度の上昇も、DNAポリメラーゼの特異性と忠実度が低下します。ほとんどのメーカーは、DNAポリメラーゼおよび10X PCR緩衝液と一緒に塩化マグネシウム(MgCl 2の )の溶液が含まれています。 10 X PCR緩衝液は、典型的なPCRのために十分である15mMのMgCl 2を含むかもしれません反応するか、それが特定の反応に最適化された濃度で個別に追加されることがあります。のMg 2 +は 、実際の反応で消費されていませんが、反応はそれが存在しなくても続行することはできません。あまりにも多くのMg 2 +がある場合、それは二重鎖を安定化させることによりDNAテンプレートの完全な変性を防ぐことができます。あまりにも多くのMg 2 +も間違ったテンプレートサイトや不要なPCR産物が得を減少させる特異プライマーのアニーリングスプリアス安定させることができます。十分なMg 2 +のがない場合、反応がないPCR産物を、その結果、続行されません。
  2. カリウム塩、K +(35から100 mMの最終反応濃度)
    しばしばDMSOおよび/またはグリセロールの添加と組み合わせて、通常の50mMの反応濃度からカリウム塩(塩化カリウム)を削減するより長いPCR産物(10〜40 KB)利点。希望するアンプリコンは、以下の1000 bpの長さと非特定の製品、specificiを形成している場合TYは100 mMまでの10 mM刻みで濃度を増加させる、KClを滴定することによって改善される場合があります。塩濃度を増やすと、より長いDNA分子に優先的に変性する短いDNA分子を許可します。
  3. ヌクレオチド5'-三リン酸(20〜200μMのそれぞれの最終反応濃度)
    彼らは(すなわち、[A] = [T] = [C] = [G])および/または反復からの不安定に起因する適切な同等の濃度でない場合は(dNTPsを)5'-三リン酸ヌクレオチドは、PCRのための問題を引き起こす可能性があります凍結融解。通常のdNTPの濃度は、4つのdNTPの各50μmである。しかし、PCRは、20と200μMの各間の濃度に耐えることができます。過度のdNTPの濃度は実際にPCRを阻害することができる間、dNTPの濃度が低い反応の特異性と忠実度の両方を増やすことができます。しかし、長いPCR-断片のため、より高いdNTPの濃度が必要な場合があります。 dNTPの濃度の大きな変化はco​​rresが必要になる場合がありますのMg 2 +の濃度の変化を田面。
  4. 熱安定性DNAポリメラーゼ
    最初のTaq DNA ポリメラーゼが最初に採用されたので、これらの酵素に関連付けられているPCR酵素とバッファーは、長い道のりを歩んできました。したがって、適切な酵素を選択すると、目的のアンプリコンの製品を得るために役立ちます。例えば、Taq DNA ポリメラーゼの使用は、能力(processivity)および/ ​​またはPCR産物の3 '末端へのアデニン残基の付加が必要な場合はPfu DNAポリメラーゼよりも優先されることがあります。 3の添加チミンハング 'アデニンは、3つの聖霊降臨祭のTAベクターへのクローニングPCR産物のための有用な戦略となっている'を。忠実度がより重要である場合ただし、このようなPfuのような酵素は、より良い選択かもしれません。いくつかは特殊なニーズのために設計された特定のDNAポリメラーゼの配列を持って製造しています。反応条件および所望の増幅産物の特性を見てみましょうし、適切なDNA pのPCR実験と一致してolymerase。ほとんどは、忠実度、歩留まり、速度、最適なターゲットの長さ、それがGCリッチ増幅またはホットスタートPCR用に有用であるかどうかなど、リストの特性による援助のDNAポリメラーゼの選択そのテーブルを持って製造しています。
  5. テンプレートDNA
    DNAの品質と純度は成功したPCR実験の可能性に大きな影響を持ちます。 DNAとRNAの濃度は260 nm(OD 260)でその光学密度の測定値を使用して決定することができます。溶液中で核酸を精製した質量が二重鎖DNAまたはRNAまたはOD 260で一本鎖DNA = 1.0のどちらかが40μg/ mlの濃度50μg/ mlになるように計算されます。 DNA抽出の汚染物質は、PCRの一般的な阻害剤であり、慎重に避けるべきである。 PCRの一般的なDNA抽出阻害剤は、タンパク質、RNA、有機溶剤、及び界面活性剤が含まれています。 OD 260がタンパク質OD280(OD 280分の260)のそれに比べて核酸の吸収極大を使用して、それが決定する際に可能です。抽出したDNAの純度の電子推定。理想的には、OD 280分の260の比は1.8と2.0の間です。下のOD 280分の260は、タンパク質および/ ​​またはすべての確率で、PCRのための問題になる可能性があります、溶剤汚染の指標である。
    テンプレートDNAの品質に加えて、DNA量の最適化が大幅にPCR実験の結果を利益を得るかもしれません。それはしばしば現代のnanospectrophotometersの出力である、ng /μLのに量を決定するのに便利ですが、成功したPCR実験に関連するユニットは、分子の数です。つまり、どのように多くのDNAテンプレートのコピーは、PCRプライマーに相補的な配列を含んでいますか?最適なターゲット分子は、7月 10日から4月 10日までの間の分子であり、上記の注意事項で説明したように計算することができます。

9。添加試薬

他のすべてが失敗したときに添加試薬は、結果をもたらす可能性があります。試薬を理解すると何が使われていると、試薬が目的のPCR産物の買収で最も効果的かもしれないかを決定する上で非常に重要です。反応液に試薬を加えることは、一つの試薬の操作は別の試薬の使用可能な濃度に影響を与えるかもしれないという事実によって複雑になっています。以下の試薬に加え、独自の市販の添加剤は、多くのバイオテクノロジー企業から提供されています。

10。 GCリッチテンプレートの利点添加

  1. ジメチルスルホキシド(1-10%DMSOの最終反応濃度)
    PCR実験では、鋳型DNAは、DMSOは、塩基対を破壊し、効果的にT mを下げることにより、反応を高めることができる追加、特にGCリッチ(GC含量> 60%)である。いくつかのT mの計算は、PCR実験で、目的のDMSOの濃度を追加するための変数のエントリが含まれています。しかし、2%以上のDMSOを追加すると、それは悪魔であったとして、より多くのDNAポリメラーゼを加えることが必要な場合がありますTaq DNA ポリメラーゼを阻害することがstrated。
  2. ホルムアミド(1.25から10までパーセントの最終反応濃度)
    以下の非特異的プライミングと増加増幅効率をもたらすプライマーアニーリングの厳しさを高めながら、DMSOのように、ホルムアミドはまた、塩基対形成を中断します。ホルムアミドはまた、GCリッチなテンプレートのエンハンサーであることが示されている。
  3. 7 -デアザ-2'-デオキシグアノシン5'-三リン酸(DC 7 GTPの最終反応濃度、3 DC 7 GTP:1 dGTPを50μM)
    1部、または12.5μMと一緒にグアノシン塩基アナログDC 7 GTPの3つの部分、または37.5μMを使用して、dGTPを、製品に二次構造の形成を不安定にします。リコンやテンプレートDNAが変性したように、それはしばしばそのようなヘアピンループなどの二次構造を形成します。 DNAアンプリコンにDC 7 GTPの取り込みは、これらの異常な構造の形成を禁止します。

注:

7 GTPは、それがdGTPを3:1の比率で使用されている理由であるエチジウムブロマイド染色の信号を減衰させる。

  1. ベタイン(2.5Mに0.5Mの最終反応濃度)
    ベタイン(N、N、N-トリメチルグリシン)が減少し、さらに塩基組成DNAの融解温度依存性をなくすことが両性アミノ酸アナログである。それは、GCリッチなターゲットのPCR増幅を助けるために添加剤として使用されます。ベタインは、しばしばDMSOとの組み合わせで採用されていると非常に高いGC含量を持つ増幅の標的DNAの可能性を向上させることができます。

11。阻害剤の存在下でPCRをヘルプ添加物

  1. 非イオン性界面活性剤は、二次構造形成を抑制し、DNAポリメラーゼを安定させるために機能します。例えばTriton X-100などの非イオン性界面活性剤、ツイーン20、NP-40は、アンプリコンの生産を増加させるために、0.1から1パーセントの反応濃度で使用することができます。しかし、concentr1%以上ゴム手袋は、PCRを阻害するかもしれません。非イオン性界面活性剤の存在は、潜在的に誤った製品の形成につながる、PCRジェンを減少させます。しかし、それらの使用も抑制がSDS、DNA抽出プロトコルの時折の汚染物質の影響を中和する。
  2. などの特定のタンパク質のほかウシ血清アルブミン(BSA)などのFeCl 3、ヘミン、フルボ酸、フミン酸阻害剤の存在下で150 ng /μLの援助PCRで400 ng /μLのおよび/ ​​またはT4遺伝子32タンパク質で使用され、タンニン酸、または糞便、新鮮な水、海洋水から抽出。しかし、胆汁酸塩、ビリルビン、EDTA、NaClを、SDSやTriton X-100を含むいくつかのPCR阻害剤は、BSAまたはT4遺伝子32タンパク質のいずれかを添加することによって緩和されていません。

12。サイクリング条件への変更

  1. アニーリング温度を最適化しても、PCR反応を強化すると他の添加剤および/または他のMOと一緒に組み合わせて考慮する必要がありますサイクリング条件にdifications。したがって、最適なアニーリング温度を計算するために次式が採用されています。
    T OPT = 0.3 T mの プライマー + 0.7 T mは製品 -14.9
    T mの プライマーは、次式を用いて以下の安定したペア T mのように計算されます。
    T mは入門 =((ΔH/(ΔS+ R Xはln(C / 4)))-273.15 + 16.6ログ[K +]ここでΔHは、ハイブリッドの最近傍エンタルピー変化の合計数であり、ΔSの合計です傍エントロピー変化であり、Rは気体定数(1.99 CAL K-1モル-1)です。Cは、プライマーの濃度であり、[K +]カリウム濃度である。
    後者の方程式は、次のWebサイトに掲載されているT mの計算のいずれかを使用して計算することができます。
    RS /融解/ sup_mat / servers_list.html "ターゲット=" _blank "> http://protein.bio.puc.cl/cardex/servers/melting/sup_mat/servers_list.html
    T mの 製品は次のように計算されます。
    T mは製品 = 0.41(%GC)+ 16.6ログ[K +] - 675/product長さ
    ほとんどのPCR反応のためのカリウムの濃度([K +])を50mMになるだろう。
  2. ホットスタートPCRは、初期変性時間は( 表4)劇的に増加されている多彩な修飾である。この変更は、サイクリング条件に他の変更の有無にかかわらず組み込むことができます。また、それはしばしば気まぐれなアンプリコンを形成するための添加剤と組み合わせて使用​​されます。実際には、ホットスタートPCRは、ますます一般的なサイクリング条件の定期的な側面として含まれています。ホットスタートは、反応の特異性と忠実度を向上させながら、アンプリコン収率を高めることが実証されている。ホットスタートPCRの背後にある理論的根拠は、T m以下の反応を設定するための結果として生じるかもしれプライマーダイマーや非特異的プライミングを排除することです。したがって、典型的なホットスタート反応は、少なくともいずれか増幅が発生することができます°Cの前に60に、最適なT m以上の温度にサンプルを加熱する。一般に、DNAポリメラーゼは、最初の、細長い、変性時の反応から天引きされています。反応の他のコンポーネントが、時にはDNAポリメラーゼの代わりに省略されていますが、ここでは、DNAポリメラーゼに焦点を当てます。固体ワックスバリアーの使用、抗DNAポリメラーゼ抗体、およびアクセサリータンパク質を含む初期変性期間が完了するまで、DNAポリメラーゼが無効になっているか、物理的に分離されたままにすることができますいくつかの方法があります。初期変性のサイクルが完了した後、別の方法として、DNAポリメラーゼは、単に反応に添加することができる。
  3. タッチダウンPCR(TD-PCR)は、推測のいくつかは、ブラケットでT mの計算の制限によりうまく計算されたアニーリング温度を取ることを意図。コンセプトは、サイクリング条件の二つの相( 表5)を設計することです。最初のフェーズは、計算されたT mまたは少し下℃で上記と仕上げの10時に開始し、2サイクルごとに(伝統的に1.0℃)を連続して低いアニーリング温度を採用しています。フェーズ2は別の20から25サイクルの間5℃、計算されたT メートル以下に設定アニーリング温度で標準的な3ステップの条件を利用しています。最初のフェーズでの機能は、正しい製品に4倍の利点を付与する、ミスプライミングを軽減する必要があります。したがって、10サイクル後、410倍の利点は、任意のスプリアスプライミング上、適切な製品の4096のコピーをもたらすでしょう。
    • ステップダウンPCRはプライマーの最初の段階でより少ない単位でのTD-PCRに似ています。例として、最初のフェーズでは、すべてのアニーリング温度を下げる3°C、2番目のサイクルは、℃以上10℃開始し、℃で計算されたT mは2以下で仕上げ。 TD-PCRと同様に、第二段階では、アニーリング温度が5に設定し、標準的な3ステップの条件を利用して°C別の20から25サイクルの計算されたT m以下。これは正しい製品に偽プライミング製品に比べ、256倍の優位性をできるようになります。
    • 減速PCRは、単にTD-PCRの変形であり、非常にGCリッチ(83%以上)の配列( 表6)を増幅するための成功を収めています。コンセプトは考慮ランプ速度と同様に冷却速度を調整することができます近代的なサーマルサイクラー、関連付けられた比較的新しい機能になります。プロトコルはまた、反応を阻害することができた2°構造の形成を低減するDC 7 GTPを使用しています。ランプ速度が2.5に低下させ°アニーリングサイクル1.5°C s -1の冷却速度でC s -1で 。最初のフェーズは始まりますそれは58℃に達するまで、70の温度をnealing℃、1アニーリング温度を下げる°Cごとに3ラウンド第二段階は、さらに15サイクルの58℃のアニーリング温度を続行します。
  4. nested PCR法では、スプリアスを除去するために使用する強力なツールです。単一のゲノム中のいくつかのパラログ遺伝子が存在するか、標的配列の低コピー数はオーソログ配列を異種の集団内である場合にネストされたプライマーの使用は、特に便利です。基本的な手順は、DNAの単一の領域を増幅する2セットのプライマーが含まれます。外側のプライマーは、目的のセグメントをまたぐと20から30サイクルにしばしば非特異的でありPCR産物を生成するために使用されています。小アリコート、最初の50μlの反応液から、通常約5μlを、内部の位置の相対的にアニールするプライマーの2番目のセットを使用して増幅の別の20から30ラウンドのテンプレートDNAとして使用されます最初のセットに。

他のPCRのプロトコルは、より専門的であり、この論文の範囲を超えて行く。例としては、RACE-PCR、マルチプレックスPCR、Vectorette-PCR、定量PCR、およびRT-PCRが含まれています。

13。代表的な結果

代表的なPCRの結果は、上述の基本的なPCRのプロトコルに従うことによって生成されました。結果は、反応の様々な試薬及び条件の効果を実証するためにいくつかのトラブルシューティングの戦略が組み込まれています。出芽酵母Saccharomyces cerevisiae由来と未知Mycobacteriophageから遺伝子がこれらの実験で増幅した。表2に示す標準的な3ステップPCRプロトコールは以下のとおり3つのすべての実験に用いた。

S.の両方からPCR実験、ゲノムDNAを設定する前に酵母とMycobacteriophageはアロでしょう濃度を定量化し、希釈した反応あたりのDNAの10 4 10 7分子間のワットワーキング株式は以下のように調製した。ゲノム酵母DNAの調製は、10 4 ng /μlにをもたらした。は10 ng /μlに希釈液をTE液pH8.0バッファー452μLに48μLを加えることによって生成されました。 S.以来、 cerevisiaeのゲノムは12.5 MB、ngは7.41×10 5分子を含む約10である。ゲノムMycobacteriophage DNAの調製は、313 ng /μlにをもたらした。で2 ng /μlに希釈液をTE液pH8.0バッファー993.6μlの中に6.4μLを加えることによって生成されました。このファージDNAは67 KBです。したがって、1 ngのは、一般的にPCRに使用するDNAの上限である2.73×10 7分子が含まれています。ワーキング株式は、 表7で概説マスターミックス溶液を生成するために使用されました。後述するように実験では、サイクリング条件を変化させた。

3a、S.からのゲノムDNAに酵母は、増幅するためのテンプレートとして使用されたガラクトース代謝に関与するタンパク質をコードする遺伝子GAL3、。この実験の目的は、試薬のセットに最適なMg 2 +濃度を決定することであった。全くのMgCl 2、 PCR緩衝液中に存在しませんでした、0.0 mMから5.0 mMにテストの範囲で示された濃度で補わなければなりませんでした。図に示すように、予想されるサイズ(2098 bp)のPCR産物は、Mg 2 4.0で最適な濃度で2.5 mMの+濃度(レーン6)MM(レーン9)から開始されます。メーカーが推奨する濃度は、典型的なPCRバッファーで提供される量は1.5 mMであった。おそらく驚くべきことに、この実験では生成物の形成に必要な必要な濃度は、この金額を超えています。

異なるDNAテンプレートは、 図3bに示す実験のために使用されていました。 MycobacteriophageからのゲノムDNAが保存された566 bpのDNAセグメントを増幅するために使用されていました。前の実験と同様に、最適なMg 2 +濃度が決定されなければならなかった。 図3bに示すように、目的のPCR産物の増幅は、少なくとも2.0 mMのMg 2 +を (レーン5)が必要です。 MgCl 2の濃度の増加に形成された製品の量より多くのばらつきがあったが、ほとんどのPCR産物は4 mMのMg 2 +の (レーン9)、酵母GAL3遺伝子を観察し、同じ濃度で観察された。

図3Aおよび図3Bに示す実験では、離散的なバンドはプライマーアニーリング温度に基づいて最適であると考えられてサイクリング条件を用いて得られたことに注意してください。具体的には、変性温度は61℃のアニーリング温度を95°Cであり、拡張子は、72℃1分間行った℃を30サイクル。最後の5分延長して72で行われた℃、 図3cに示す第三の実験のために図3cに示すように、 図3aの離散的なバンド何だったこれらのサブ最適なサイクリング条件の下で非特異的な製品の汚れになります。また、反応の全体的な厳しさでは、Mg 2の下部量を減らし+アンプリコンを形成する必要があります。

すべての3つの実験では、Mg 2 +濃度低すぎる場合には、全く増幅産物の生産がないことを示しています。これらの結果は示しているときにサイクリング条件の両方正しく設計され、試薬は最適な濃度であるされ、PCR実験が予想されるサイズに対応した控えめなアンプリコンを生成します。結果は、十分に高ストリンジェンシー(スミア対など、控えめなバンド)でPCR実験を行うことの重要性を示しています。また、実験では、1つのパラメータを変更するため、反応の結果に影響を与え、別のパラメータに影響を与えることができることを示しています。

試薬 ストック溶液の濃度 ボリューム 13X **
マスターミックス
最終濃度
滅菌H 2 O 50μlにQS 650μlのQS
PCRバッファー 10X 5μlの 65μlの 1X
のdNTPの 10mMの 1μlの 13μlの 200μM
MgCl 2を 25 mMの 3μlの 39μlの 1.5mMの
フォワードプライマー 20μM= 20ピコモル/μL 1μlの 13μlの 20 pmolの
プライマーを逆にする 20μM= 20ピコモル/μL 1μlの 13μlの 20 pmolの
テンプレートDNA 変数変数変数 〜10 5分子
Taq DNAポリメラーゼ 5ユニット/μl* 0.5μL μlを6.5 2.5単位
50μL/反応

順番に表1 PCR試薬は、それらを追加する必要があります。

*ユニットは、メーカー間で異なる場合があります

*滴定またはその反応変数かもしれませんが必要な任意のものを除くマスターミックスにすべての試薬を追加します。上記の表に示すようにマスターミックスを各反応チューブにアリコートに十分あることを確実にピペット転送損失に対応するために、11の反応と2つの余分な反応のために計算されます。

標準的な3ステップPCRサイクリング
サイクルステップ 温度 時間 サイクル数
初期変性 94°C〜98°C 1分 1
変性
アニーリング
拡張
94°C
5°CのT m以下
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
依存アンプリコンおよびDNAポリメラーゼ
25から35
最後の拡張 70&Dたとえば、C〜80°C 5分 1
*を保持する 4°C 1

表2標準的な3ステップPCRサイクリング。

*ほとんどのサーマルサイクラーは、4℃で無期限にサイクルの終了時に一時停止する能力を持っています。

70℃〜80℃°C
2ステップPCRサイクリング
サイクルステップ 温度 時間 サイクル数
初期変性 94°C〜98°C 1分 1
変性
アニーリング/エクステンション
10〜60秒
依存アンプリコンおよびDNAポリメラーゼ
25から35
最後の拡張 70℃〜80℃°C 5分 1

表3。2ステップのPCRサイクリング。

ホットスタートPCRサイクリング
サイクルステップ 温度 時間 サイクル
初期変性 60℃〜95℃°C 5分は、DNAポリメラーゼを追加する 1
変性
アニーリング
拡張
94°C
5°CのT m以下
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
依存アンプリコンおよびDNAポリメラーゼ
25から35
最後の拡張 70℃〜80℃°C 5分 1

表4。ホットスタートPCRサイクリング。

タッチダウンPCRサイクリング
サイクルステップ 温度 時間 サイクル
初期変性 94°C〜98°C 1
変性
アニーリング
拡張
94°C
X = 10°C、T m以上
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
依存アンプリコンおよびDNAポリメラーゼ
2
変性
アニーリング


拡張
94°C
X-1°C減らす1°C、他のすべてのサイクル
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
リコンと依存ポリメラーゼ
28
変性
アニーリング
拡張 94°C
5°CのT m以下
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
依存アンプリコンおよびDNAポリメラーゼ
20から25
最後の拡張 70℃〜80℃°C 5分 1

表5。タッチダウンPCRサイクリング。

減速PCRサイクリング
サイクルステップ テム温度 時間 サイクル
初期変性 94°C〜98°C 1分 1
変性
アニーリング
拡張
94°C
X°C = 10°C、T m以上
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
リコンと依存ポリメラーゼ
2
変性
アニーリング


拡張
94°C
X-1°C減らす1°C、他のすべてのサイクル
70°C〜80°C *
10〜60秒
30秒
Ampliconと依存ポリメラーゼ
28
変性
アニーリング
拡張
94°C
5°CのT m以下
70℃〜80℃°C
10〜60秒
30秒
リコンと依存ポリメラーゼ
20から25
最後の拡張 70℃〜80℃°C 5分 1

表6。減速PCRサイクリング。

*減速のためのPCR、ランプ速度が2.5に低下させ°アニーリングサイクル1.5°C s -1の冷却速度でC s -1で

ストック溶液 量は50μlの反応液に加え 13 X酵母マスターミックス 13 Xファージマスターミックス 最終濃度
滅菌H 2 O 50μl にQS = 31μlまたは30.5 QS 650μlまで= 396.5 520μL= 403μlに適量
PCRバッファー 10X 5μlの 65μlの 65μlの 1X
10mMの 1μlの 13μlの 13μlの 200μM
MgCl 2を 滴定各反応液に加え各反応液に加え各反応液に加え滴定を参照してください。を変数
フォワードプライマー 20μM= 20ピコモル/μL 1μlの 13μlの 13μlの 20 pmolの
プライマーを逆にする 20μM= 20ピコモル/μL 1μlの 13μlの 13μlの 20 pmolの
テンプレートDNA 2 ng /μLのファージまたは10 ng /μLの酵母 0.5μlのファージまたは1μlの酵母 μlを6.5 13μlの 〜10 7分子ファージまたは〜10 5分子酵母
ポリメラーゼ 0.5ユニット/μl** 0.5μL μlを6.5 μlを6.5 0.5ユニット/反応
40μlの+ 10(滴定)/μlの反応 滴定
[MgCl 2の ] 0.00 mMの 0.5mMの 1.0mMの 1.5mmの 2.0mMの 2.5mMの 3.0 mMの 3.5 mmの 4.0 mmの 4.5mMの 5.0mMの
MgCl 2を 0.00μL 1.00μL 2.00μL 3.0μL 4.00μL 5.00μL 6.00μL 7.00μL 8.00μL 9.00μL 10.00μL
H 2 O 10.00μL 9.00μL 8.00μL 7.00μL 6.00μL 5.00μL 4.00μL 3.00μL 2.00μL 1.00μL 0.00μL

<strong>の表7のMg 2 +の滴定を図3に使用されます。

図1
図1プライマーと標的DNAの3ステップPCR増幅で発生する共通の問題。 (1)二次ヘアピンループ構造の形成を生じるプライマーのセルフアニーリング。プライマーは、常に極端な両端にアニールされず、小さなループ構造を形成することができることに注意してください。 (b)のプライマーではなく、DNAテンプレートではなく、お互いにアニーリングプライマーダイマーを作成します。プライマーが互いにアニールしたら、彼らはプライマーの両端に細長います。 (c)のPCRサイクルは、特定のアンプリコンが生成されます。標準的な3ステップPCRサイクルは、鋳型DNAの変性、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによる標的DNA(アンプリコン)の拡張が含まれています。

図2
reagと図2。アイスバケットエント、ピペット、およびPCRに必要なラック。 (1)P-200ピペット、(2)P-1000ピペット、(3)P-20ピペット(4)P-10ピペット(5)96ウェルプレートおよび0.2ml薄壁PCRチューブTaqポリメラーゼ 、10×PCRバッファー、MgCl 2を 、滅菌水、dNTPを、プライマー、テンプレートDNAを含む、(6)試薬(7)1.8 mlチューブとラック。

図3
図3標準的な3ステップPCRプロトコルを用いてPCR実験を最適化するために使用されるMg 2 +の滴定の例。 ()S.酵母酵母のゲノムDNAは2098塩基対GAL3遺伝子を増幅するためのテンプレートとして使用されていました。のレーン1から6、Mg 2 +濃度が低すぎる場合には、どちらかの製品には形成された(レーン1-5)または非常に小さな製品が(レーン6)が形成されていません。レーン7から2098 bpのアンプリコン生成物の存在によって示される11は、このPCR実験のためにMg 2 +の最適な濃度を表しています。 (b)にuncharacteriZED mycobacteriophageゲノムDNAテンプレートは、566 bpのアンプリコンを増幅するために使用されていました。レーン1から4は、Mg 2 +濃度は、製品の不在によって示され、低すぎる。レーン5から11は、566キロバイトリコン生成物の存在によって示されるこのPCR用のMg 2 +最適な濃度表しています 。 (c)のS.酵母酵母のゲノムDNAは、パネルに示されているように2098 bpのGAL3遺伝子を増幅するためのテンプレートとして使用されていました。しかし、アニーリング温度は61から減少しました°C〜58°C、アガロースゲル上でスメア効果を生成する変数の長さで非特異的なPCRバンドが得。レーン1から4、Mg 2 +濃度が低すぎる場合には、商品はありませんが形成された。レーン5から8は、2098キロバイトのアンプリコンの製品サイズ約塗抹し、バンドの存在によって見られるように+このPCR用のMg 2の最適な濃度を表しています。レーン9から11が形成されない製品に過度に厳しい条件を示している。 (AC)、レーン12はnegatiです。任意のテンプレートDNAが含まれていなかった制御を簡単お好み検索。レーンM(マーカー)は、NEB 1キロバイトのラダーをロードします。

図4
図4 PCRに用いた滅菌チューブ。 (1)1.8 mlチューブ(2)0.2ミリリットル、個々の薄い壁PCRチューブ、(3)0.2ミリリットルストリップ薄壁PCRチューブとキャップ。

図5
図5。サーマルサイクラー。サーマルサイクラー左の画像を閉じた。右の画像は開いたサーマルサイクラーの加熱ブロック内に配置0.2ミリリットル薄壁PCRチューブを含んでいます。

Discussion

PCRは、生物科学兵器で欠かせないツールとなっています。 PCRは、さらに生化学的な分析のためのゲノムと多様性だけでなく、単にクローニング遺伝子の洞察を得て、生物学者はゲノムを支配する力を得て、具体的かつ正確な臨床試験を可能にする、新たな機能を備えたハイブリッド遺伝子を加えることができ、科学のコースを変更した。 PCRアプリケーションは、その力を行使する科学者の想像力によって制限されます。そこにPCRの新しい特殊な使用法を説明し、多くの書籍や論文があり、多くは生物科学の次の世代にわたって開発されます。しかし、関係なく、予想されるアプローチは、基本的なフレームワークが変わっていません。 PCRは、そのすべての壮大さには、in vitroでのアプリケーション内の DNAの特定のセグメントを大量に生成することです。

PCR実験を設計する思想と忍耐を必要とします。図3に示す結果は、主要なチャンネルの一つを例示PCRの最適化戦略を設計する際にallenges。 PCRの1つのパラメータが変更されているつまり、それは相互に影響を与える可能性があります。例として、初期のPCRは最適なMgを2でサブ最適なアニーリング温度(58℃)で実施された場合、2.0 mMの+濃度、その結果は図3cに見られるように塗抹標本を生成します。塗抹標本を解決しようとすると、2.0 mMのMgCl 2を含む反応とPCR条件を設定し、61℃にアニール温度を調整伴うかもしれないしかし、図3aに示すように、これは任意の生成物を得ませんでした。したがって、むしろ誤った結果のトラブルシューティングを行うときに、単一の反応に1つの濃度を追加することなく、試薬を滴定することをお勧めします。また、PCR実験を最適化するために必要とされる最も一般的な調整は、Mg 2 +濃度を変更し、アニール温度を修正することです。ただし、これらの変更は最小限に抑えたり、異常な結果を廃止、additiの滴定しない場合VESおよび/または表2-6に説明したようにサイクリング条件のプロトコルを変更するには、問題を軽減することがあります。他のすべてが失敗した場合は、プライマーを再設計して、もう一度試してみてください。

Disclosures

私は、開示することは何もありません。

Acknowledgments

試薬を設定し、ゲルを注ぐとカリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)エリン·サンダースにインスピレーション、ガイダンス、およびサポートのために、原稿を校正するためのカリフォルニア大学ロサンゼルス校(UCLA)クリスReddiに感謝します。私もGAL3遺伝子を増幅するために酵母ゲノムDNAとプライマーを供給するためのジャンカルロCostagutaとグレゴリー·S.ペインに感謝したいと思います。 4 - 私もラボ機器および図2を作るために使用する試薬の写真を撮るためにBhairav​​シャーに感謝します。このプロジェクトの資金は、HHMI(ハワードグラント番号52006944)によって提供されていました。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Taq Polymeras Sigma-Aldrich D4545-25UN
dNTPs Qiagen 201225
0.2 ml Thin Wall Tubes PCR tubes Bio-Rad 223-9469
0.2 ml Thin Wall Tube caps Bio-Rad 223-9472
EDTA disodium salt dihydrate Sigma-Aldrich E5134
Trizma-HCl Sigma-Aldrich T-3253
Custom Phage Primer Invitrogen 25441F_RL6_Contig2_68k TACTGCAACGCGATGTTGCG
Custom Phage Primer Invitrogen 26007R_RL6_ Contig2_68k TCACCATCAATCGTGGCGGT
Custom Yeast Primer Integrated DNA Technologies SacI-Gal3(-256) ACCTGGAGCTCCTATTT TAACATGTGGATTTCTTGAAAGAATGAAATCG
Custom Yeast Primer Integrated DNA Technologies Gal3(1848)-SacI CGGATGGAGCTCGCGT GAAGGTAATTTTTTTTTATGTCTCCG
Thermal Cycler Bio-Rad 170-9703 My Cycler
Agarose ISC BioExpress E-3120-500
Gel electrophoresis Hoeffer Scientific Instruments Model HE33
1 kb DNA Ladder New England Biolabs N3232S
Bio Rad Power Pack Bio-Rad 164-5050 PowerPac Basic
Gel Doc system Fotodyne Incorporated FOTO/Analyst Investigator FX Workstation

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References

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Comments

1 Comment

  1. Thanks for the great overview of the all-important PCR procedure. I will no doubt reference it often in the future.

    I have a PCR troubleshooting question...what do to about streaking on the gel after a successful amplification? My bands are nice and bright and where they are supposed to be, but there is a heavily-streaked "path" starting at the wells and following until the end where my bands are. Is there something I can do about my PCR conditions, or the thermocycler settings? Any comments would be appreciated.

    Reply
    Posted by: Doug E.
    September 8, 2013 - 1:23 PM

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