Author Produced

Анализ одноклеточных транскрипции гена РНК-флуоресцентный

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Флуоресцентный

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Адгезия Plasmodium тропической инфицированных эритроцитов (IE) в человеческих эндотелиальных рецепторов во время заражения малярией при посредничестве выражения PfEMP1 вариантов белка, кодируемого VAR генов.

Гаплоидный P. тропической таит в геноме около 60 различных вар генов, из которых только один был Считается, что транскрибируется в камере в то время, в течение кровью стадии инфекции. Как такие взаимоисключающие регулирования VAR транскрипции генов достигается неясно, как это идентификация отдельных генов или VAR подгруппы VAR генов, связанных с различными рецепторами и следствие дифференциальной обязательными для клинического исхода П. тропической инфекции. В последнее время взаимоисключающие парадигмы транскрипции была поставлена ​​под сомнение транскрипции анализы, основанные на отдельных P. тропической стенограммы идентификации в разовыхected эритроцитарных клеток с помощью РНК-флуоресцентной гибридизации (FISH) анализ VAR транскрипции генов паразита в отдельных ядер P. тропической IE 1.

Здесь мы представляем подробный протокол для проведения РНК-FISH методологии анализа VAR транскрипции генов в одно-ядрах P. тропической инфицированных эритроцитов человека. Метод основан на использовании дигоксигенином и биотин-меченых зондов антисмысловой РНК помощью TSA Plus флуоресценции Палитра Система 2 (Perkin Elmer), микроскопические анализы и недавно выбранный P. тропической IE. На месте методом гибридизации может быть использован для контроля транскрипции и регулирования различных генов, выраженных в ходе различных этапов P. тропической жизненного цикла и может быть адаптирована к другим малярийных паразитов рыб и других организмов и типов клеток.

Protocol

1. Генерация Свежий Выбранный зараженных эритроцитов

Для этого теста, лучшие результаты получаются при использовании культур недавно выбранных для поверхностного выражения PfEMP1 белка. В данном эксперименте 3d7 P. тропической линии был выбран с помощью специфических антител, как описано ранее 1.

День 1

  1. Урожай 200 мкл упакованных клеток крови из P. тропической культуры, содержащие 2-5% в конце IE этапе путем центрифугирования при 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре.
  2. Повторное приостановить кровь гранул в 2 мл 37 ° C теплый 0,75% раствор желатина в 14 мл стерильной пробирке, и оставить на 15-20 мин при 37 ° C, чтобы неинфицированных и кольцо стадии IE в осадок.
  3. Урожай поздних стадиях IE, то есть верхнюю фазу, в новый 14 мл трубки и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
  4. Развести 50 мкл специфических анти-PfEMP1 антител в 2 мл 37 ° С теплыми РБК-стирка средствами массовой информации и стерильный фильтр.
  5. Смешать промытый поздней стадии IE с стерилизованное разбавленный антисыворотки в 14 мл стерильной пробирке и инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
  6. Спином вниз на 800 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре, и мыть два раза по 10 мл 37 ° C теплый РБК-стирка СМИ.
  7. Вымойте 50 мкл Dynabead белка подвеска дважды РБК-стирка массовой информации, использующих DynaMaq-15 магнита.
  8. Ресуспендируют Dynabeads в 300 мкл РБК-стирка СМИ и добавить их в промытую поздней стадии IE. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C при осторожном перемешивании.
  9. Передайте трубку к DynaMaq-15 магнита. Оставьте на 1-2 минут и удалить все жидкости.
  10. Ресуспендируют Dynabeads в 4-5 мл РБК-стирка СМИ. Передайте трубку обратно на магните и оставьте на 1-2 минут, прежде чем снимать всю жидкость. Повторите стадии промывки один раз.
  11. Передача промытый бусины на 25 см 2 стерильных F культурыласк, содержащие 200 мкл свежей эритроцитарной массы. Добавить 5-6 мл Albumax средств массовой информации в культуре. Хранить в течение ночи при 5% CO 2 при 37 ° C.

День 2

  1. Снимите Dynabeads от культуры, когда выбран ИЭ reinvaded свежие эритроциты, передав все культуры в 14 мл стерильной пробирке. Положите трубку на DynaMaq-15 магнита и оставить на 1-2 мин. Затем залить все жидкости обратно в колбу культуры.
  2. Культура как для нескольких циклов насколько возможно, пока паразитемии 5-10% и паразиты находятся в ringstage.
  3. IE должны быть проанализированы FACS, чтобы убедиться, что правильный фенотип поверхности, т.е. экспрессия белка либо and/orPF11_0008 PFD1235w был получен 1.

2. Подготовка зонды

Антисмысловую РНК-зондов были получены из самых разнообразных регионов PFD1235w и PF11_0008 VAR </ EM> генов из P. тропической 3d7 геномной ДНК. ДНК амплифицировали с помощью ПЦР и клонировали в pSPT18 или 19 вектор для транскрипции, соответственно, по описанию производителя (Roche). Зондов (580 пар оснований (п.о.) и 590 б.п. в длину) были помечены дигоксигенин (DIG) или биотин помощью DIG РНК маркировки Kit или биотин РНК маркировки Mix, соответственно. Мы подтвердили специфичность проб и анализов на Северном пятно и одной меткой FISH анализа 1.

3. Тонкий мазок и фиксации Паразиты До в гибридизация

День 1

Все действия выполняются в РНКазы окружающей среды и все реагенты РНКазы или предварительно обрабатывают диэтиловым pyrocarbonate (DEPC) или РНКазы Зап (Invitrogen). Слайдов и покровные стекла должны быть очищены спиртом для удаления остатков смазки производства. Важно, чтобы выполнить протокол без паузы между шагамиВ целях сведения к минимуму риска загрязнения нуклеазы.

  1. Сделать тонкой пленкой крови стандартным методом распространения 3. Использование 100x объектива нефти микроскопом, подсчитать IE и расчета доли IE в культуре. Проверьте, что паразит этапов в приближенных синхронно, в кольце и в начале Трофозоита этапах IE цикла. Таковы предварительные репликации, одно-пузырькового стадии, выражая VAR мРНК гена и подходит для одной ячейки FISH транскрипции анализа этого типа.
  2. Передача 50 мкл культуры паразита, на паразитемии на 5-10%, до 1,5 мл РНКазы трубки Эппендорф. Центрифуга течение 1 мин при 2000 оборотов в минуту при комнатной температуре.
  3. Удалить СМИ и добавить 50 мкл PBS рН 7,2 в DEPC обработанной воды. Перемешивать трубку осторожно. Повторите шаг центробежного осаждения в два раза мыть клетки свободны от средств массовой информации и остатков клеток.
  4. Сделайте четыре хорошего качества тонких мазков. Для каждого мазка, сделайте один мазок наодин 11 мм в диаметре скважины 4 хорошо слайд, то есть четыре стеклянные слайды в общем, в РНКазы капот (критический шаг). Волна скользит кратко в воздух, чтобы высохнуть. Сделайте три дополнительные слайды для отрицательного контроля одного слайда для одного окрашивания зонд для любой другой ген имеет значения с использованием специального зонда, другой слайд для РНКазы лечение и третий слайд, содержащий IE не выражал интерес гена. Оставьте слайды для просушки на скамейке в течение 10-20 мин.
  5. Исправить тонких пленок путем добавления 60 мкл фиксации раствор, содержащий 4% параформальдегида и 5% ледяной уксусной кислоты в скважинах. Оставьте на 10 минут на скамейке при комнатной температуре.
  6. Вымойте слайды в 2x ГНПП буфера в течение 5 минут на легком перемешивании при комнатной температуре. Коротко удаления избытка жидкости, касаясь лунки, содержащие клетки осторожно салфеткой.
  7. Накройте слайды с 0,01% пепсина в 0,01 М HCl в течение 2 мин при 37 ° C (чрезвычайно важный шаг). Вымойте слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
  8. Разведите раствор РНКазы до конечной концентрации 10 мкг / мл. Накройте отрицательных мазков управления с 60 мкл раствора РНКазы. Инкубировать в течение 30 мин при 37 ° C, а затем вымыть слайды в 2x ГНПП течение 5 мин при комнатной температуре.
  9. Немедленно приступить к гибридизации шаг.

4. Гибридизация РНК-зондов для фиксированного Слайды

День 1

  1. Подготовка гибридизации камеры, такие как Thermostar 100 HC4 или пустую коробку кончика пипетки помещают в чистую печь, путем распыления с РНКазы Зап и вытирая его в чистоте с бумажной ткани. Заполните каналы камеры гибридизации или в нижней части коробки с DEPC обработанной воды, чтобы убедиться, что слайды не будут высыхать при гибридизации. Закройте камеру и разогрейте до 48 ° C.
  2. Развести зонды в гибридизации решение конечной концентрации 12 нг / мкл. Денатурации зонд раствора при 65 ° C в течение 5 мин в нагревательный блок. Немедленно охладить на льду.
  3. Коротко сухой воздух слайды после стирки 2x ГНПП. Аккуратно удалите лишнюю жидкость вокруг скважины с бумагой.
  4. Откройте гибридизации камеру и поместить слайды в камере. Применение одного или обоих зондов в общем объеме 60 мкл на лунку. Осторожно покрытия капли жидкости с РНКазы покровного стекла с использованием стерильных щипцов.
  5. Закройте камеру и гибридизуется слайды при 48 ° C в течение не менее 16 часов в течение ночи.

5. Сопряжение антител и флуоресцентного усиление

День 2

Следующие шаги основаны на TSA Plus флуоресценции Палитра системы от Perkin Elmer. Все действия выполняются при комнатной температуре.

  1. Вымойте слайды 3 раза в буфере TNT в течение 5 мин при осторожном перемешивании.
  2. Блок скважины в 150 мкл буфера TNB в течение 30 мин.
  3. Развести HRP-конъюгированных α-DIG антител в буфере TNB в соотношении 1:100 и HRP-конъюгированных α-биотина антител в буфере ТНБ, в соотношении 1:500. Удалите излишки буфера TNB из слайдов с бумагой. При обнаружении двух транскриптов одновременно, как антитела могут идти одновременно. Нанесите на общую сумму в 100 мкл антитела TNB раствора на хорошо и тщательно накрыть крышкой скольжения. Инкубируйте слайды в течение 2 часов.
  4. Снимите крышку скользит внимательно. Вымойте слайды в буфере TNT 3 раза в течение 5 мин.
  5. Развести FITC-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500 и применять по 100 мкл раствора в каждую лунку. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
  6. Снимите крышку скользит тщательно вымыть и слайды 3 раза в течение 5 мин в буфере TNT нежным агитации.
  7. Развести Cyan3-флуорофора в tyramide реагента усиления в соотношении 1:500. Добавить 100 мкл наа этого решения. Накройте крышкой скважин с промахами и инкубировать в течение 12 мин.
  8. Снимите крышку скользит внимательно, а затем промыть слайды быстро путем погружения в буфере TNT.
  9. Вымойте слайды 3 раза TNT буфера в течение 5 мин.
  10. Погрузитесь слайды быстро DEPC обработанной воды.
  11. Оставьте слайды высохнуть на воздухе. Установите слайды с анти-Fade реагентом, содержащим DAPI. Печать по углам крышки скользит с лаком для ногтей.
  12. Слайды готовы для микроскопии. Держите горки покрыты алюминиевой фольгой и хранить при 4 ° C, если эксперимент будет завершен на следующий день. Полная герметизация стороны слайдов может быть осуществлена ​​через 24 часа после применения анти-Fade реагента. Это позволит слайдов, чтобы быть отображена на срок до одной недели после того, как протокол был завершен.

6. Визуализация гибридизированных зонды

  1. Включите микроскопом. Стандартные иммунофлюоресценции микроскоп sufficдиентом для такого эксперимента, но если у вас есть доступ к конфокальной микроскопии Вы также можете использовать это для 3D-изображений или для получения видео из ваших окрашенных клеток. Разрешить микроскоп, чтобы прогреться в течение 15-30 мин. Включите компьютер и программное обеспечение.
  2. Проверьте качество окраски на иммунофлюоресценции микроскопом. Выберите место, содержащий несколько паразитов.
  3. Регулировка усиления каждого лазерного вручную. Отрегулируйте пикселей жить до 4-6 м -1 с -1 и шаги, до 512 х 512 пикселей.
  4. Пройти тест изображения с помощью кадров Lambda. Отрегулируйте усиления лазера.
  5. Возьмите как минимум 20 хороших фотографий люминесцентных отдельных клеток. По крайней мере, 2-5 фотографий поле, содержащее 5-20 паразитов необходимы для того, чтобы получить справедливую обзор процент положительных паразитов.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

На рисунке 1 показана блок-схема основных этапов и длительности методологии FISH РНК.

Серия представитель изображениями хорошо, и плохо сохранившиеся окрашенных экспериментов FISH мРНК с использованием одной P. тропической IE показано на рисунке 2. Это внутриклеточные простейшие имеет небольшой (1-1.5 мкм в диаметре) ядром которого окрашен в голубой цвет с DAPI. Двадцать четыре часа после вторжения в эритроцитах P. тропической процесс шизогонии, т.е. ядерное деление, начинается. Оптимальное обнаружение рыбы VAR транскрипции генов происходит на уровне около 10-22 часов в этом 48 час внутри эритроцитов литического цикла. Зонды вообще гибридизуются видов мРНК, которые появляются рядом с главным ядерным тела, в том, что, вероятно, ядерная оболочка связанных эндоплазматической сети. Хорошее качество изображения в строке шоу-FITC (зеленый) и Cyan3-(красный) меченых зондов соответствующие PFD1235w и PF11_0008 VAR гены, соответственно, в двойном выбран P. тропической к югу от линии, 3d7 PFD1235w/PF11_0008. Сотрудничество локализации генов, очевидно, но не абсолютным. Ряд B показывает плохие гибридизации обоих зондов к паразитам, которые либо деградировали или в значительной степени перестала расшифровки VAR мРНК. В строке C, хорошо гибридизации рыб получены, но сотовые сохранение плохой, как показано плохо распространяться и агрегирования паразитов.

Рисунок 1
Рисунок 1. РНК FISH эксперимент блок-схемы. Блок-схема иллюстрирует основные пункты и сроки проведения FISH процедуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Конфокальной изображения РНК-FISH в двойном выбран P. тропической указывает simultanous мРН.А. транскрипции двух различных генов VAR обозначалась либо с FITC (зеленый) или Cyan3 (красный) сигнал. Окрашивание DAPI (синий) указывает паразиты ядерной ДНК. Вертикальный ряд A1, B1 и C1 показать передачу изображения паразитов. Шкала бар 5 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

РНК FISH анализ, в отличие от методов, таких как Северная блоттинга и RT-PCR, позволяющий дискриминации конкретных транскриптов мРНК на одном уровне клетки. Это позволяет различать транскрипционно активные и неактивные клетки, в данном примере, P. тропической паразитических простейших человека внутри красных кровяных клеток. Такие цельноклеточной наблюдения часто необходимы и могут разгадать важных и новых транскрипционных модели 1.

Хотя другие рыбы РНК методы были описаны 4-10, было необходимо для развития новых и изысканных протокол для изучения одновременного VAR транскрипцией мРНК в P. тропической. С помощью зондов асРНК как средства обнаружения, специальные временные паттерны активности мРНК могут быть легко локализована в клетках. Кроме того, асРНК датчики также могут быть использованы в других экспериментальных систем, которые будут поддерживать их специфичности 1. Другие критческих параметров, которые важны при разработке нового протокола включает в себя фиксацию и permeabilzation клеток. Эти шаги были эмпирически определить путем тестирования различных химических реагентов, как это было предложено других авторов 5. Мы пришли к выводу, что, объединив медленно действующий параформальдегида крест компоновщик вместе с коагулянтом фиксатором уксусной кислоты мы могли бы получить хорошую сохранность тканей морфологии. Кроме того, мы узнали, что предварительного блокирования клетки перед добавлением зондов не было необходимости, как и в других описанных РНК FISH протоколов 5. Кроме того, в настоящем протоколе мы используем нежно моет, мягкий протеазы (пепсин) при низких объемах и короткий инкубационный период, чтобы обеспечить зонда и антител к диффундировать в ядро ​​и гибридизации с мРНК крепится на ER, сводя к минимуму повреждения окружающих мембраны (рис. 2A1-2A4).

Кроме того, рыба РНК и изображений с высоким разрешением порожденных ВерблюдПрилагаемый к конфокальной микроскопии показывает, является ли конкретная ячейка является позитивной для окрашивания или нет, а также дает ценную информацию о пространственных отношениях между окрашенных антисмысловых РНК и ядра окрашенных DAPI. Как решить в изображениях на рис 2A4, мРНК, по-видимому, придает рядом с ядром, вероятно, в эндоплазматической сети, а не на нем, как ожидается, в ДНК-FISH изображений 11-12.

Исследование одиночных камерах наблюдения требуют многочисленных паразитов и в различные моменты времени, чтобы получить статистически значимый результат. Таким образом, РНК FISH анализ является довольно трудоемкой техникой, которая требует терпения и значительных экспериментов методом проб и ошибок, чтобы откалибровать технику. Как РНК рыбы Техника многим параметрам по устранению неисправностей на основных этапов этого протокола приведены в таблице 1.

Проблема Возможные осторожностьюЮ-В Рекомендация
Слабый сигнал или нет сигнала
  • Низкая экспрессия мРНК.
  • деградации мРНК.
  • Зонд ухудшается, в эффективно помечены или слишком низкой концентрации.
  • Слишком высокая температура гибридизации.
  • Слишком долго пепсина лечения.
  • Клетки не пермеабилизованной достаточно.
  • Проверьте экспрессии белка по FACS.
  • Работа по РНКазы условиях свободного и использовать только свежеприготовленные растворы.
  • Сделайте проверку качества меченых зондов на геле и сравнить с меченой РНК управления. Сделать титрования серии зонда концентрация в рыбе.
  • Уменьшить температура гибридизации поэтапно.
  • Уменьшите длину пепсина лечения.
  • Продлить пепсина ТреаДлина tment или попробуйте другой моющего средства.
Плохо сотовой сохранения
  • Слишком высокая паразитемии или стресса паразитов.
  • Слишком толстые пленки.
  • Плохо очищена слайдов.
  • Клеток на слайды deattached.
  • Используйте здоровые культуры паразита, сохраняя паразитемии менее 10% и изменение ячейки средств массовой информации каждый день.
  • Развести паразита культуры.
  • Очистите слайды с алкоголем и подождите не менее 10 минут для слайдов, чтобы высохнуть.
  • Используйте свежеприготовленные пара-формальдегида и / или увеличить длину параформальдегида инкубации.
Высокий фон
  • Слишком высокая концентрация зонда.
  • Недостаточная промывка изпаразиты.
  • Разрывные shizonts.
  • Стирок вашем гибридизации пост.
  • Блокировка буфера загрязненных или неэффективно.
  • Сделать титрования серии зонда концентрация в рыбе.
  • Вымойте паразитов дважды, прежде чем подготовка тонких пленок.
  • Синхронизация культуры более жестко.
  • Увеличение числа и / или длина стирок.
  • Подготовка нового блокирующего буфера. Попробуйте другие блокирующего реагента, концентрации или продлить срок блокировки
РНКазы лечение управления положительно
  • Решение РНКазы неактивно.
  • Слишком низкая концентрация РНК.
  • Инкубационный была слишком короткой.
  • Подготовьте новый РНКазы решенияния.
  • Увеличение концентрации. Сделать титрования серии.
  • Продлить срок РНКазы лечение.
Ложное срабатывание обнаружения отрицательного контроля паразитов
  • Зонд не является специфичным.
  • Паразиты не выражают мРНК обнаружены зондом.
  • Проверьте специфику зондов.
  • Проверьте, что паразит линии, используемой является правильным и недавно выбрали.

Таблица 1. Troobleshooting руководства.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Авторы хотели бы поблагодарить Майкла Alifrangis и Улла Abildtrup для генотипирования паразитов и Кристина Holm за отличную техническую помощь. Эта работа финансировалась Медицинского института Говарда Хьюза (грант 55005511), Lundbeck фонда (грант R9-A840) и Нильс Бор Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  3. Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
  4. Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
  5. Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
  6. Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
  7. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
  8. Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
  9. Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
  10. Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
  11. Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics