Author Produced

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

פלואורני

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

הידבקות של אריתרוציטים Plasmodium falciparum הנגועים (IE) לקולטנים אנדותל אדם במהלך זיהומי מלריה מתווכת על ידי ביטוי של PfEMP1 גרסות חלבונים המקודדות על ידי גני var.

הפלואידים פ falciparum הגנום מטפח כ 60 גני var שונים אשר אחד בלבד כבר האמינו שעבד לכל תא בכל פעם בשלב הדם של הזיהום. איך רגולציה סותרת כזה של שעתוק הגנים var מושגת לא ברור, כפי שהוא זיהוי גני var בודדים או תת קבוצות של גנים הקשורים לvar קולטנים שונים והתוצאה של מחייב הפרש בתוצאה הקלינית של פ זיהומי falciparum. לאחרונה, הפרדיגמה שעתוק מוציאות כבר נקראה בספק על ידי מבחני שעתוק המבוססים על פ פרט זיהוי תמליל falciparum בinf אחתתאי האריתרוציטים ected באמצעות רנ"א ניאון כלאה באתר (FISH) ניתוח של שעתוק הגנים var ידי הטפיל בגרעינים בודדים של פ falciparum 1-IE.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מפורט לביצוע המתודולוגיה RNA-FISH לניתוח של שעתוק הגנים var בגרעינים בודדים של פ falciparum נגוע אריתרוציטים אדם. השיטה מבוססת על השימוש בdigoxigenin וביוטין שכותרתו RNA באמצעות בדיקות antisense TSA פלוס מערכת פלואורסצנטי פלטת 2 (פרקין אלמר), ניתוחים מיקרוסקופים ונבחר טריים פ falciparum IE. בשיטת כלאה באתר ניתן להשתמש כדי לפקח על שעתוק ורגולציה של מגוון רחב של גנים הביע בשלבים השונים של פ מחזור חי falciparum וניתן להתאמה למינים אחרים מלריה טפיל ואורגניזמים אחרים וסוגי תאים.

Protocol

1. דור של אריתרוציטים הנגועים הנבחרים טרי

עבור assay זה, את התוצאות הטובות ביותר מתקבלות בעת שימוש בתרבויות שנבחרו זה עתה לביטוי פני PfEMP1 חלבון. בניסוי המסוים הזה 3D7 פ שושלת falciparum נבחרה באמצעות נוגדנים ספציפיים כמתואר 1 בעבר.

יום 1

  1. 200 μl הקציר של תאי דם ארוז מפ falciparum התרבות המכילה 2-5% אקספלורר שלב מאוחר על ידי צנטריפוגה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר.
  2. Re-להשעות גלולה בדם של 2 מ"ל 37 ° C 0.75% פתרון חם ג'לטין בצינור סטרילי 14 מ"ל, ולצאת לדקות 15-20 על 37 מעלות צלזיוס כדי לאפשר IE אינו הנגוע וטבעת שלבים למשקעים.
  3. לקצור את IE בשלב מאוחר, כלומר את השלב העליון, לתוך צינור חדש מ"ל 14 ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
  4. לדלל 50 μl של אנטי PfEMP הספציפי1 נוגדנים ב2 מ"ל של 37 ° C תקשורת RBC-לשטוף ולסנן סטריליים החמימה.
  5. מערבב את IE השטוף בשלב מאוחר עם נסיובי עוקר בדילול המלא בצינור סטרילי 14 מ"ל ודגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  6. ספין למטה XG ב 800 דקות ל8 בטמפרטורת חדר, ולשטוף פעמים עם 10 מ"ל של 37 ° C התקשורתיים חם RBC-שטיפה.
  7. שטוף 50 μl של חלבון Dynabead השעיה פעמים עם תקשורת RBC-שטיפה באמצעות-15 DynaMaq מגנט.
  8. Resuspend את Dynabeads ב300 תקשורת μl RBC-לשטוף ולהוסיף אותם לאקספלורר השטוף בשלב מאוחר. דגירה במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה.
  9. העברת הצינור למגנט DynaMaq-15. השאר למשך 1-2 דקות ולהסיר את כל הנוזלים.
  10. Resuspend את Dynabeads במיליליטר 4-5 המדיה RBC-שטיפה. העברת הצינור בחזרה אל המגנט ולהשאיר אותה במשך 1-2 דקות לפני ההסרה כל הנוזלים. חזור על שלב כביסת פעם אחת.
  11. להעביר את החרוזים המכובסים לו 25 סנטימטרים 2 סטרילי תרבותלאסק מכיל 200 תאי דם μl ארוז טרי אדומים. הוסף 5-6 מ"ל של Albumax תקשורת בתרבות. אחסן לילה בCO 5% 2 ב 37 ° C.

יום 2

  1. הסר את Dynabeads מהתרבות כאשר IE שנבחר פלישה חוזרת של תאי הדם האדומים הטריים על ידי העברה כל התרבות לצינור סטרילי 14 מ"ל. שים את הצינור אל-15 DynaMaq המגנט ולצאת ל1-2 דקות. לאחר מכן, שופך את כל הנוזל בחזרה לבקבוק התרבות.
  2. תרבות לכמה שפחות מחזורים ככל האפשר עד parasitemia של 5-10% וטפילים הן בringstage.
  3. אקספלורר צריך להיות מנותח על ידי FACS כדי לוודא שהפנוטיפ המשטח הנכון, ביטוי חלבון כלומר של או and/orPF11_0008 PFD1235w הושג 1.

2. הכנת הבדיקות

בדיקות antisense RNA נוצרו מהאזורים המשתנים ביותר של PFD1235w וvar PF11_0008 </ Em> גנים מפ הדנ"א הגנומי 3D7 falciparum. דנ"א הוגבר באמצעות PCR ומשובט לתוך וקטור pSPT18 או 19 לשעתוק, בהתאמה לפי התיאור של היצרן (רוש). הבדיקות (580 זוגות בסיסים (bp) ו590 BP באורך) תויגו עם Digoxigenin (DIG) או ביוטין באמצעות DIG-RNA תיוג קיט או מיקס תיוג ביוטין רנ"א, בהתאמה. אנחנו אשרנו את הספציפיות של הבדיקות הן על ידי ניתוח כתם הצפון ועל ידי ניתוח יחיד, תווית דגי 1.

3. למרוח דקים וקיבוע של טפילים לפני הכלאה באתר

יום 1

כל הצעדים נעשים בסביבת RNase-חופשיה וכל המגיבים הם RNase חינם או מראש טופל-עם diethyl pyrocarbonate (DEPC) או RNase Zap (Invitrogen). את השקופיות וחוטרי כיסוי יש לנקות עם אלכוהול כדי להסיר שומן ייצור שיורית. חשוב לבצע את הפרוטוקול ללא כל הפסקה בין צעדיםעל מנת למזער את הסיכון לזיהום nuclease.

  1. לעשות סרט דם דק בשיטת ההפצה הסטנדרטית 3. באמצעות העדשה אובייקטיבי שמן 100x של המיקרוסקופ, לספור את IE ולחשב את האחוז של IE בתרבות. בדקו ששלבי הטפיל הם בתיאום מקורב, בטבעת והשלבים מוקדמים של trophozoite מחזור IE. אלה הם mRNA הגן var להביע מראש שכפול, שלבים חד nucleate, ומתאים למבחנים בודדים סלולריים דגי שעתוק מסוג זה.
  2. העברה 50 μl של התרבות הטפילה, בparasitemia של 5-10%, לצינור 1.5 מ"ל RNase ללא אפנדורף. צנטריפוגה לדקות 1 ב2000 סל"ד בטמפרטורת חדר.
  3. הסר את המדיה ולהוסיף pH 50 μl PBS 7.2 במי DEPC טופל. להתסיס את הצינור בעדינות. חזור על שלב שקיעת צנטריפוגלי פעמים כדי לשטוף את התאים חינם מתקשורת ופסולת תא.
  4. לעשות ארבע מריחות דקות באיכות טובה. לכל כתם, כתם להפוך לאחד אל11 קוטר מ"מ אחד הטוב של 4 שקופיות טובות, ארבע שקופיות זכוכית כלומר בסך הכל, במכסת מנוע RNase חינם (שלב קריטי). גל מחליק לרגע באוויר לייבוש. הפוך שלוש שקופיות נוספות לשקופית שלילית בקרות אחד להכתמת בדיקה אחת לכל גן רלוונטי אחר באמצעות בדיקה ספציפית, שקופית אחרת לטיפול RNase ושקופית המכילה 3 אקספלורר לא מבטא את הגן של עניין. השאר את השקופיות לייבוש על הספסל במשך 10-20 דקות.
  5. תקן את הסרטים הדקים על ידי הוספת 60 μl של פתרון קיבעון המכיל paraformaldehyde 4% וחומצה אצטית קרחונים 5% לבארות. השאר למשך 10 דקות על הספסל בטמפרטורת חדר.
  6. שטוף את השקופיות ב2x SSPE חיץ למשך 5 דקות על ידי תסיסה עדינה בטמפרטורת חדר. בקצרה סילוק נוזלים עודפים על ידי נגיעה בבארות המכילות את התאים בעדינות במגבת נייר.
  7. לכסות את השקופיות עם פפסין 0.01% ב0.01 M HCl עבור 2 דקות על 37 מעלות צלזיוס (צעד מאוד קריטי). שטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  8. לדלל את תמיסת RNase לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל. לכסות על כתמי בקרה השליליות עם 60 μl של פתרון RNase. דגירה במשך 30 דקות על 37 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לשטוף את השקופיות ב2x SSPE למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר.
  9. פנה מייד לצעד ההכלאה.

4. כלאה של בדיקות RNA על שקופיות קבועות

יום 1

  1. הכן קאמרי הכלאה, כגון ThermoStar 100 HC4 או תיבת קצה פיפטה ריקה לשים בתנור נקי, על ידי ריסוס עם RNase Zap ומנגב אותו נקי במגבת נייר. מלא את הערוצים של חדר ההכלאה או התחתון של התיבה עם מי DEPC טופל כדי לוודא שהשקופיות לא תתייבשנה במהלך הכלאה. סגור את החדר ומחמם עד 48 מעלות צלזיוס
  2. לדלל את החקירות בפתרון ההכלאה לריכוז סופי של 12 ng / μl. לפגל פתרון החללית על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות בבלוק חימום. מייד לצנן על קרח.
  3. בקצרה אוויר תיבש את השקופיות אחרי כביסת SSPE 2x. מוציא בזהירות את הנוזל עודף סביב הבארות במגבת נייר.
  4. פתח את תא ההכלאה ולמקם את השקופיות בבית הבליעה. תחול אחת או בשתי הבדיקות בהיקף כולל של 60 μl לטוב. זהירות לכסות טיפת הנוזל עם תלוש כיסוי RNase-חופשי באמצעות מלקחיים סטריליים.
  5. סגור את התא ולהכליא את השקופיות ב48 מעלות צלזיוס במשך לפחות 16 שעות במשך הלילה.

5. נטיית נוגדן והגברת קרינה

יום 2

השלבים הבאים מבוססים על מערכת TSA פלוס פלטת קרינה מפרקין אלמר. כל הצעדים נעשים בטמפרטורת חדר.

  1. שטוף את השקופיות 3 פעמים בTNT חיץ למשך 5 דקות עם תסיסה עדינה.
  2. חסום את הבארות ב150 μl של חיץ TNB למשך 30 דקות.
  3. לדלל את נוגדן HRP-מצומדות α-DIG במאגר TNB ביחס של 1:100 ונוגדן HRP-מצומדות α-ביוטין במאגר TNB, ביחס של 1:500. הסר את כל חיץ TNB עודף מהשקופיות עם ממחטת נייר. כאשר גילוי 2 תעתיקים בו זמנית, שני הנוגדנים יכולים ללכת מייד. למרוח כמות כוללת של 100 μl של פתרון נוגדן לTNB היטב ולכסות בזהירות עם פתק כיסוי. דגירת השקופיות עבור 2 שעות.
  4. הסר את התלושים לכסות בזהירות. שטוף את השקופיות בTNT חיץ 3 פעמים למשך 5 דקות.
  5. דלל את FITC-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500 ולהחיל 100 μl של פתרון לכל באר. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
  6. הסר את המכסה מחליק בזהירות ולשטוף את השקופיות 3 פעמים למשך 5 דקות בחיץ TNT ידי תסיסה עדינה.
  7. דלל את Cyan3-fluorophore בריאגנט ההגברה tyramide ביחס של 1:500. הוסף לμl 100גם בפתרון זה. לכסות את הבארות עם תלושי כיסוי ודגירה במשך 12 דקות.
  8. הסר את המכסה מחליק בזהירות ולאחר מכן לשטוף את השקופיות במהירות על ידי טבילה בחיץ TNT.
  9. שטוף את השקופיות 3 פעמים עם חיץ TNT למשך 5 דקות.
  10. לטבול את השקופיות במהירות במי DEPC טופל.
  11. השאר את השקופיות לייבוש באוויר. הר את השקופיות עם ריאגנט אנטי לדעוך מכיל DAPI. לאטום את הפינות של תלושים לכסות עם לק.
  12. את השקופיות מוכנות כעת למיקרוסקופיה. שמור את השקופיות מכוסות בנייר האלומיניום ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס, אם הניסוי הוא להסתיים ביום למחרת. איטום מלא של הצדדים של השקופיות יכול להתבצע 24 שעות לאחר ההחלה מגיבה נגד הדהייה. זה יאפשר את השקופיות שצלמו עד שבוע לאחר הפרוטוקול הושלם.

6. ויזואליזציה של בדיקות הכלאה

  1. הפעל מיקרוסקופ. מיקרוסקופ immunofluorescence סטנדרטי הוא sufficient לסוג זה של ניסוי, אבל אם יש לך גישה למיקרוסקופ confocal אתה יכול גם להשתמש בזה לתמונות 3D או כדי לקבל קטעי וידאו של התאים המוכתמים שלך. אפשר מיקרוסקופ כדי להתחמם במשך 15-30 דקות. כבה את המחשב ואת התוכנה.
  2. בדקו את איכות הצביעה במיקרוסקופ immunofluorescence. בחר מקום המכיל כמה טפילים.
  3. התאם את הרווח של כל ליזר באופן ידני. התאם פיקסל להתעכב כדי 4-6 מ '-1 של -1 והצעדים ל512 x 512 פיקסלים.
  4. קח תמונת בדיקה באמצעות המסגרת למבדה. להסתגל רווח הליזר.
  5. קח מינימום של 20 תמונות טובות של תאים בודדים ניאון. לפחות 2-5 תמונות של שדה המכיל 5-20 טפילים נדרשות על מנת לקבל סקירה הוגנת של אחוז הטפילים חיוביים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

איור 1 מדגים תרשים זרימה של השלבים העיקריים ומשך הזמן של המתודולוגיה דגי רנ"א.

סדרה של תמונות מייצגות של ניסויים וגם גרועים השתמרו מוכתמים mRNA דגים באמצעות פ אחת falciparum אקספלורר מוצגים באיור 2. protozoan התאי זו יש גרעין קטן (1-1.5 קוטר מיקרומטר) שהוכתם כחול עם DAPI. עשרים וארבע שעות לאחר פלישה כדורית אדומה בפ falciparum תהליך רביית השסע, חלוקה גרעינית כלומר, מתחיל. איתור דגים אופטימלי של שעתוק הגנים var מתרחש בסביבות 10-22 שעות למחזור הזה 48 שעתי תוך האריתרוציטים מוסס. בדיקות בדרך להכליא לmRNA מינים המופיעים בסמוך לגוף הגרעיני הראשי, במה שהוא כנראה reticulum endoplasmic מעטפה הקשורים גרעיני. את התמונות באיכות הטובה בשורת תכנית FITC-(ירוק) וCyan3-(אדום) בדיקות מתאימות לPFD1235w וP הכותרתF11_0008 גני var, בהתאמה, בפ בחר הכפול falciparum תת קו, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-לוקליזציה של הגנים היא גלויה, אך אינה מוחלטת. שורת B מציג הכלאה ירודה של שתי הבדיקות לטפילים שיש להם או מושפל או חדל במידה רבה לתעתוק mRNA var. בשורת C, הכלאת דגים טובה מתקבלת אך השימור הסלולרי הוא עני, כפי שמוצג על ידי התפשט קשים וצבירה של טפילים.

איור 1
איור 1. תרשים זרימת ניסוי דגי רנ"א. תרשים הזרימה ממחיש את הנקודות והעיתוי העיקריים של הליך הדגים.

איור 2
איור 2. תמונות confocal של RNA-דגים בפ בחר כפול falciparum המציין simultanous מרשעתוק NA של שני גנים var השונים שכותרתו עם שני FITC (ירוק) או אות Cyan3 (אדום). מכתים DAPI (כחול) מציין את ה-DNA הגרעיני הטפיל. השורה האנכית A1, B1 ו C1 להראות את תמונות שידור של הטפילים. 5 מיקרומטר סרגל קנה מידה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ניתוח דגי רנ"א, בניגוד לשיטות כמו סופג צפון וRT-PCR, מאפשר אפליה של תעתיקי mRNA ספציפיים ברמת התא הבודדה. זה מאפשר להבחין בין תאי תעתיק פעילים ולא פעילים, בדוגמה זו, פ falciparum הטפיל פרוטוזואה בתוך תאי דם אדומים אנושיים. תצפיות כאלה כל תא הן לעתים הכרחיות ויכולות לחשוף דפוסי תעתיק חשובים ורומן 1.

למרות שיטות דגי RNA אחרות כבר תארו 4-10, יש כבר צורך בפיתוח פרוטוקול חדש ומעודן למחקר של שעתוק mRNA var סימולטני בפ falciparum. באמצעות בדיקות asRNA ככלים לזיהוי, את הדפוסים מיוחדים הזמניים של פעילות mRNA יכולים להיות מקומיים בקלות בתאים. בנוסף, בדיקות asRNA יכולות לשמש גם במערכות ניסיוניות אחרות שיתמכו בייחודם 1. מכה קריטית אחרתפרמטרי פורמאליות שחשובות בעת פיתוח פרוטוקול חדש כוללים קיבוע וpermeabilzation של התאים. צעדים אלה הוגדרו על ידי בדיקה אמפירית ריאגנטים כימיים שונים כפי שהוצע על ידי מחברים אחרים 5. אנחנו הגענו למסקנה שעל ידי שילוב paraformaldehyde המקשר האיטי פועל הצלב יחד עם החומצה אצטית מקבעת קרישה אנחנו יכולים להשיג שימור טוב של מורפולוגיה הרקמות. בנוסף, התבררנו לנו שמראש חוסם את התאים לפני שמוסיף את הבדיקות לא הייתה צורך בכך, בדומה לדגים אחרים תארו רנ"א פרוטוקולים 5. יתר על כן, בפרוטוקול הנוכחי אנו משתמשים שטיפות עדינות, פרוטאז קל (פפסין) בסכומים נמוכים ותקופת דגירה קצרה כדי לאפשר לחללית ואת הנוגדנים כדי לפזר לתוך הגרעין ולהכליא עם mRNA המוצמד לחדר המיון, מזעור ניזק לקרומים סמוכים (איור 2a1-2a4).

בנוסף, דגי RNA ואת התמונות ברזולוציה הגבוהה שנוצרו על ידי camerמצורף לconfocal מיקרוסקופ מגלה אם תא מסוים הוא חיובי או לא מכתים וגם נותן מידע רב ערך על היחסים מרחביים בין antisense RNA המוכתם והגרעין המוכתם DAPI. כפי שהוחלט בתמונות בדמות 2a4, mRNA מופיע שיש לצרף לצד הגרעין, כנראה בendoplasmic reticulum, ולא על גבי זה, כצפוי בדמות ה-DNA-FISH 11-12.

מחקרים של תאים בודדים דורשים תצפיות של טפילים רבים ובנקודתי זמן שונים כדי לקבל תוצאה מובהקת סטטיסטי. לכן, ניתוח דגי RNA הוא טכניקה רבה ולא זמן שדורשת סבלנות וניסוי וטעייה, במידה ניכר כדי לכייל את הטכניקה. כמו דגי RNA הוא טכניקה של פרמטרים רבים מדריך בעיות ירי אל השלבים העיקריים של פרוטוקול זה מוצג בטבלת 1.

בעיה Cau האפשריse המלצה
אות חלשה או אין אות
  • ביטוי mRNA נמוך.
  • mRNA שפלה.
  • חללית היא מושפלת, ביעילות מסומנת או נמוך מדי בריכוז.
  • טמפרטורת הכלאה גבוהה מדי.
  • טיפול פפסין זמן רב מדי.
  • תאים אינם permeabilized מספיק.
  • בדקו את ביטוי החלבון על ידי FACS.
  • לעבוד בתנאים חופשיים RNase ולהשתמש בפתרונות רק טרי.
  • האם בדיקת איכות של החללית מתויגת על ג'ל ולהשוות לרנ"א בקרה שכותרת. הפוך סדרת טיטרציה של ריכוז החללית בדגים.
  • מנמיך את חום הכלאת שלבים.
  • להפחית את אורך טיפול פפסין.
  • להאריך את גיד פפסיןאורך tment או לנסות חומר ניקוי אחר.
עניים סלולריים שימור
  • parasitaemia גבוה מדי או טפילים לחוצים.
  • סרטים עבים מדי.
  • ניקה קשות שקופיות.
  • התאים על שקופיות deattached.
  • השתמש תרבות טפילה בריאה על ידי שמירה על parasitemia תחת 10% ושינוי בתקשורת הסלולרית כל יום.
  • דלל את התרבות הטפילה.
  • נקה את השקופיות עם אלכוהול ולחכות לפחות 10 דקות עבור שקופיות לייבוש.
  • השתמש מוכן טרי-פורמלדהיד סעיף ו / או להגדיל את אורך דגירת paraformaldehyde.
רקע גבוה
  • חללית ריכוז גבוה מדי.
  • שטיפה מספקת שלטפילים.
  • מתפוצץ shizonts.
  • כביסות הכלאת הודעה לא מספיקות.
  • חיץ חסימה הוא מזוהם או לא יעיל.
  • הפוך סדרת טיטרציה של ריכוז החללית בדגים.
  • שטוף את הטפילים פעמים לפני הכנת שכבות דקות.
  • סנכרן את התרבות בצורה הדוקה יותר.
  • להגדיל את המספר ו / או אורך של כביסות.
  • הכן את חיץ חסימה חדש. נסה אחר, מגיבים ריכוז חסימה או להאריך את תקופת החסימה
RNase הביקורת שטופלה היא חיובית
  • פתרון RNase אינו פעיל.
  • ריכוז RNase נמוך מדי.
  • הדגירה הייתה קצרה מדי.
  • הכן RNase solu חדשtion.
  • להגביר את הריכוז. הפוך סדרת טיטרציה.
  • להאריך את תקופת טיפול RNAse.
זיהוי חיובי כוזב של טפילי בקרה שליליים
  • הבדיקה אינה ספציפית.
  • טפילים לא מבטאים את ה-mRNA זוהה על ידי החללית.
  • בדקו את הספציפיות של הבדיקות.
  • בדקו שטפיל הקו משמש הוא את האדם הנכון וטרי שנבחר.

טבלת 1. הדרכת Troobleshooting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות למיכאל Alifrangis ואולה Abildtrup לgenotyping של טפילים וכריסטינה הולמת לסיוע טכני מעולה. עבודה זו מומנה על ידי הווארד יוז רפואי במכון (מענק 55005511), הקרן לונדבק (מענק R9-A840) ועל ידי נילס בוהר הקרן.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  3. Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
  4. Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
  5. Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
  6. Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
  7. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
  8. Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
  9. Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
  10. Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
  11. Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics