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Analisi di Single-cell trascrizione del gene per l'RNA fluorescente

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Biology

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Summary

Fluorescente

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

Adesione di Plasmodium falciparum eritrociti infetti (IE) per recettori umani endoteliali durante la malaria è mediato dall'espressione di PfEMP1 varianti proteiche codificate dai geni var.

Il aploide P. falciparum genoma ospita circa 60 differenti geni var di cui uno solo è creduto per essere trascritto per cella alla volta durante la fase di sangue dell'infezione. Come tale regolamentazione si escludono a vicenda della trascrizione genica var si ottiene non è chiaro, così come l'identificazione di singoli geni var o sotto-gruppi di geni associati con var diversi recettori e la conseguenza del legame differenziale sui risultati clinici di P. falciparum infezioni. Di recente, il paradigma trascrizione si escludono a vicenda è stata messa in dubbio da saggi di trascrizione sulla base di singoli P. falciparum identificazione trascrizione in inf singoloected cellule eritrocitari utilizzando RNA ibridazione fluorescente in situ (FISH) Analisi della trascrizione genica var dal parassita in singoli nuclei di P. falciparum IE 1.

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per effettuare la RNA-FISH metodologia di analisi della trascrizione genica var in single-nuclei di P. falciparum infettato eritrociti umani. Il metodo si basa sull'uso di digossigenina e biotina marcato con sonde di RNA antisenso utilizzando il sistema TSA Plus. Fluorescence Palette 2 (Perkin Elmer), analisi al microscopio e appena selezionato P. falciparum IE. Il metodo in situ può essere utilizzato per monitorare la trascrizione e la regolazione di una varietà di geni espressi durante le diverse fasi del P. ciclo di vita falciparum ed è adattabile ad altre specie parassita della malaria e di altri organismi e tipi di cellule.

Protocol

1. Generazione di appena selezionati eritrociti infetti

Per questo test, i risultati migliori si ottengono utilizzando colture appena selezionati per espressione di superficie di PfEMP1 proteine. In questo esperimento particolare, il P. 3D7 lineage falciparum è stato selezionato utilizzando anticorpi specifici come descritto in precedenza 1.

Giorno 1

  1. Harvest 200 pl di globuli confezionati da un P. falciparum coltura contenente 2-5% IE fase tardiva mediante centrifugazione a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente.
  2. Risospendere il pellet sangue in 2 ml di 37 ° C caldo soluzione 0,75% di gelatina in una provetta sterile 14 ml, e lasciare per 15-20 minuti a 37 ° C per consentire l'IE non infette e anello fase sedimenti.
  3. Raccogliere il ritardo-fase IE, cioè la fase superiore, in una nuova provetta 14 ml e lavare due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media.
  4. Diluire 50 ml di anticorpi specifici anti-PfEMP1 anticorpi in 2 ml di 37 ° C caldo RBC-lavaggio mezzi e filtro sterili.
  5. Mescolare il lavato all'ultimo stadio IE con gli antisieri sterilizzato diluito in un tubo 14 ml sterile e incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione.
  6. Centrifugare a 800 xg per 8 minuti a temperatura ambiente, e lavate due volte con 10 ml di 37 ° C caldi RBC-lavaggio media.
  7. Lavare 50 pl di proteina Dynabead Una sospensione due volte con RBC-lavaggio supporti tramite un DynaMaq-15 magnete.
  8. Risospendere le Dynabeads in 300 ml RBC-lavaggio dei media e aggiungerli alla lavato fase avanzata di IE. Incubare per 30 min a 37 ° C con agitazione.
  9. Trasferire il tubo al DynaMaq-15 magnete. Lasciare agire per 1-2 minuti e rimuovere tutto il liquido.
  10. Risospendere le Dynabeads in 4-5 ml di RBC-lavaggio dei media. Trasferire il tubo sul magnete e lasciare per 1-2 minuti prima di rimuovere tutto il liquido. Ripetere la fase di lavaggio una volta.
  11. Trasferire le perle lavate a un cm 25 2 f cultura sterileLASK contenente 200 ul cellule rosse del sangue appena confezionati. Aggiungere 5-6 ml di Albumax supporto nella cultura. Memorizzare una notte a 5% di CO 2 a 37 ° C.

Giorno 2

  1. Rimuovere i Dynabeads dalla cultura in cui il IE selezionato è reinvaded le cellule rosse del sangue fresco, trasferendo tutta la cultura in una provetta 14 ml sterile. Inserire il tubo sul DynaMaq-15 magnete e lasciar riposare per 1-2 minuti. Poi, versare tutto il liquido nuovamente ad un pallone di coltura.
  2. Cultura per il minor numero possibile di cicli fino ad un parassitemia del 5-10% e parassiti sono al ringstage.
  3. IE devono essere analizzate mediante FACS per assicurarsi che il fenotipo corretta superficie, cioè l'espressione della proteina di entrambi and/orPF11_0008 PFD1235w è stato ottenuto 1.

2. Preparazione di sonde

Le sonde di RNA antisenso sono stati generati dalle regioni più variabili della PFD1235w e la var PF11_0008 </ Em> geni di P. falciparum 3D7 DNA genomico. DNA è stato amplificato mediante PCR e clonato nel vettore pSPT18 o 19 per la trascrizione, rispettivamente, secondo la descrizione del produttore (Roche). Le sonde (580 paia di basi (bp) e 590 bp di lunghezza) sono state marcate con digossigenina (DIG) o biotina mediante un kit DIG RNA etichettatura o biotina RNA Mix etichettatura, rispettivamente. Abbiamo confermato la specificità delle sonde sia mediante analisi Northern blot e da etichetta singola analisi FISH 1.

3. Striscio sottile e la fissazione di parassiti Prima di ibridazione in situ

Giorno 1

Tutte le fasi vengono eseguite in un ambiente privo di RNasi e tutti i reagenti sono RNase-free o pre-trattato con dietil pirocarbonato (DEPC) o RNasi Zap (Invitrogen). Le diapositive e le marze di copertura devono essere puliti con alcool per rimuovere grasso residuo di produzione. È importante eseguire il protocollo senza pausa tra fasial fine di minimizzare il rischio di contaminazione nucleasi.

  1. Fare un film sottile di sangue con il metodo standard diffusione 3. Utilizzando la lente obiettivo 100x olio del microscopio, contare il IE e calcolare la percentuale di IE nella cultura. Verificare che le fasi parassiti sono in sincronia approssimativi, sul ring e prime fasi del ciclo di trofozoite IE. Questi sono i pre-replicazione, uni-nucleate fasi, esprimendo mRNA gene var e adatto per le prove singole di trascrizione FISH delle cellule di questo tipo.
  2. Trasferire 50 microlitri della cultura parassita, ad una parassitemia del 5-10%, 1,5 ml di una RNase-free provetta Eppendorf. Centrifugare per 1 min a 2000 rpm a temperatura ambiente.
  3. Rimuovere il supporto e aggiungere 50 microlitri di PBS pH 7.2 in DEPC-acqua trattata. Agitare delicatamente il tubo. Ripetere il passaggio centrifuga sedimentazione due volte per lavare le cellule prive di mezzi di comunicazione e detriti cellulari.
  4. Fai quattro buona qualità strisci sottili. Per ogni striscio, fare uno striscio sul'altro di 11 mm di diametro e di una slitta 4 bene, vale a dire quattro lastre di vetro in totale, in una RNasi-free cofano (un passaggio fondamentale). Onda scivola brevemente in aria per asciugare. Effettuare tre diapositive supplementare per diapositiva controlli negativi-one per la colorazione singola sonda per qualsiasi altro gene irrilevante utilizzando una sonda specifica, un'altra diapositiva per il trattamento RNasi e una terza slitta contenente IE non esprime il gene di interesse. Lasciare i vetrini si asciughino in panchina per 10-20 min.
  5. Fissare i film sottili aggiungendo 60 pl di soluzione di fissazione contenente paraformaldeide al 4% e il 5% di acido acetico glaciale nei pozzetti. Lasciare agire per 10 minuti in panchina a temperatura ambiente.
  6. Lavare i vetrini in 2x SSPE tampone per 5 minuti agitando con prudenza a temperatura ambiente. Brevemente rimuovere il liquido in eccesso premendo i pozzetti contenenti le cellule delicatamente con un fazzoletto di carta.
  7. Coprire i vetrini con il 0,01% di pepsina in HCl 0,01 M per 2 minuti a 37 ° C (un passo estremamente critico). Lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente.
  8. Diluire la soluzione RNasi ad una concentrazione finale di 10 pg / ml. Coprire gli strisci di controllo negativo con il 60 microlitri della soluzione del RNasi. Incubare per 30 min a 37 ° C e poi lavare i vetrini in 2x SSPE per 5 min a temperatura ambiente.
  9. Procedere immediatamente alla fase di ibridazione.

4. Ibridazione di sonde di RNA a diapositive fisse

Giorno 1

  1. Preparare la camera di ibridazione, come ad esempio un Thermostar HC4 100 o una scatola vuota puntale messo in un forno pulito, bagnandoli con RNasi Zap e asciugandosi pulirlo con un fazzoletto di carta. Riempire i canali della camera di ibridazione o il fondo della scatola con acqua trattata con DEPC per assicurarsi che i vetrini non si asciughino durante l'ibridazione. Chiudere la camera e preriscaldare a 48 ° C.
  2. Diluire le sonde nella soluzione di ibridazione ad una concentrazione finale di 12 ng / pl. Denaturare la soluzione della sonda a 65 ° C per 5 minuti in un blocco di riscaldamento. Immediatamente raffreddare su ghiaccio.
  3. Brevemente l'aria asciugare i vetrini dopo il lavaggio 2x SSPE. Rimuovere con cura il liquido in eccesso intorno ai pozzetti con un fazzoletto di carta.
  4. Aprire la camera di ibridazione e posizionare i vetrini nella camera. Applicare una o entrambe le sonde in un volume totale di 60 microlitri per pozzetto. Coprire attentamente la goccia liquido con un RNasi-free coprioggetto utilizzando pinze sterili.
  5. Chiudere la camera e ibridare i vetrini a 48 ° C per almeno 16 ore durante la notte.

5. Coniugazione anticorpo e Amplificazione Fluorescence

Giorno 2

Le seguenti operazioni sono basate sulla TSA Plus System Palette fluorescenza da Perkin Elmer. Tutti i passaggi sono eseguiti a temperatura ambiente.

  1. Lavare i vetrini 3 volte in TNT tampone per 5 minuti con agitazione.
  2. Bloccare i pozzetti in 150 ml di tampone per 30 min TNB.
  3. Diluire il coniugato HRP-α-DIG anticorpo in tampone TNB in ​​un rapporto di 1:100 e il coniugato HRP-α-biotina in tampone TNB, con un rapporto di 1:500. Rimuovere il tampone in eccesso TNB dai vetrini con un fazzoletto di carta. Quando si rilevano due trascritti simultaneamente, entrambi gli anticorpi può andare in una sola volta. Applicare una quantità totale di 100 microlitri della soluzione di anticorpo-TNB per bene e coprire accuratamente con un vetrino coprioggetti. Incubare i vetrini per 2 ore.
  4. Rimuovere i vetrini con attenzione. Lavare i vetrini in TNT tampone 3 volte per 5 min.
  5. Diluire il FITC-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide in un rapporto di 1:500 e applicare 100 pl della soluzione ad ogni pozzetto. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min.
  6. Togliere il coperchio scivola con cura e lavare i vetrini 3 volte per 5 min in tampone TNT agitando con prudenza.
  7. Diluire il Cyan3-fluoroforo nel reagente di amplificazione tiramide ad un rapporto di 1:500. Aggiungere 100 microlitri perbene di questa soluzione. Coprire i pozzetti con i vetrini coprioggetto e incubare per 12 min.
  8. Togliere il coperchio scivola attentamente e poi sciacquare i vetrini rapidamente per immersione in tampone TNT.
  9. Lavare i vetrini 3 volte con tampone di TNT per 5 min.
  10. Immergere rapidamente i vetrini in acqua trattata con DEPC.
  11. Lasciare i vetrini asciugare all'aria. Montare i vetrini con anti-fade reagente contenente DAPI. Sigillare gli angoli dei vetrini coprioggetto con smalto.
  12. I vetrini sono ora pronti per la microscopia. Conservare i vetrini coperti con un foglio di alluminio e conservare a 4 ° C se l'esperimento deve essere completata il giorno successivo. Una sigillatura completa dei lati dei vetrini possono essere effettuati 24 ore dopo l'applicazione del reagente anti-fade. Ciò permetterà le diapositive da acquisire fino ad una settimana dopo il protocollo è stato completato.

6. Visualizzazione dei prodotti ibridati

  1. Accendere il microscopio. Un microscopio standard di immunofluorescenza è sufficient per questo tipo di esperimento, ma se si ha accesso ad un microscopio confocale è possibile utilizzare anche questo per le immagini in 3D o per ottenere i video delle vostre cellule colorate. Lasciare microscopio per riscaldare per 15-30 min. Accendere il computer e il software.
  2. Verificare la qualità della colorazione sul microscopio immunofluorescenza. Scegli un posto che contiene pochi parassiti.
  3. Regolare il guadagno di ogni laser manualmente. Regolare il pixel sosta a 4-6 m 1 s-1 e le misure di 512 x 512 pixel.
  4. Scattare una foto di prova con cornice Lambda. Regolare il guadagno laser.
  5. Prendete un minimo di 20 belle foto di singole cellule fluorescenti. Almeno 2-5 immagini di un campo contenente 5-20 parassiti sono necessari al fine di ottenere un quadro delle percentuale di parassiti positivi.

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Representative Results

La figura 1 illustra un diagramma di flusso delle fasi principali e la durata dell'impulso del metodo FISH RNA.

Una serie di immagini rappresentative di bene e male esperimenti mRNA conservati colorate FISH utilizzando una singola P. falciparum IE sono mostrati in Figura 2. Questo protozoo intracellulare ha una piccola (1-1,5 micron di diametro), nucleo che è di colore blu con DAPI. Ventiquattro ore dopo l'invasione degli eritrociti in P. falciparum il processo di schizogonia, vale a dire la divisione nucleare, comincia. L'individuazione del pesce ottimale della trascrizione genica var si verifica a circa 10-22 ore in questo ore 48 intra-eritrocitaria ciclo litico. Generalmente sonde ibridano a mRNA specie che appaiono adiacente al corpo principale nucleare, in quella che probabilmente nucleare busta-associata reticolo endoplasmatico. Le immagini di buona qualità in fila Uno spettacolo-FITC (verde) e Cyan3-(rosso) sonde marcate corrispondenti alla PFD1235w e PF11_0008 geni var, rispettivamente, nella doppia P. selezionato falciparum parte della linea, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-localizzazione dei geni è evidente, ma non assoluta. Riga B mostra ibridazione poveri di entrambe le sonde ai parassiti che hanno sia degradato o in gran parte cessato trascrizione mRNA var. In fila C, una ibridazione FISH buona, ma si ottiene il mantenimento cellulare è scarsa, come dimostrato da mal diffondersi e aggregazione parassiti.

Figura 1
Figura 1. Diagramma di flusso FISH RNA esperimento. Il diagramma di flusso illustra i punti principali ei tempi della procedura FISH.

Figura 2
Figura 2. Immagini confocali di RNA-FISH in doppia selezionato P. falciparum indicando simultaneo mRNA trascrizione di due geni diversi var marcati sia con FITC (verde) o Cyan3 (rosso) del segnale. Colorazione DAPI (blu) indica il parassita DNA nucleare. La riga verticale a1, b1 e c1 mostrare le immagini di trasmissione dei parassiti. Scala bar 5 micron.

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Discussion

Analisi FISH RNA, a differenza di metodi come Northern blotting e RT-PCR, permette la discriminazione di mRNA trascritti specifici a livello di singola cellula. Ciò rende possibile discriminare tra cellule trascrizionalmente attiva e inattiva, in questo esempio, P. falciparum protozoi parassiti all'interno globuli rossi umani. Tali cellule intere osservazioni sono spesso necessari e possono svelare modelli trascrizionali importanti e nuovi 1.

Sebbene altri metodi FISH RNA sono stati descritti 4-10, vi è stata una necessità per lo sviluppo di un nuovo protocollo e raffinato per lo studio della simultanea trascrizione dell'mRNA var in P. falciparum. Utilizzando sonde asRNA come strumenti di rilevazione, i particolari-temporali modelli di attività mRNA può essere facilmente localizzato nelle cellule. Inoltre, sonde asRNA può essere utilizzato anche in altri sistemi sperimentali che supportano la loro specificità 1. Crit Altroical parametri che sono importanti quando si sviluppa un nuovo protocollo include fissazione e permeabilzation delle cellule. Queste misure sono state definite empiricamente testando reagenti chimici vari, come suggerito da altri autori 5. Abbiamo concluso che, combinando l'azione lenta paraformaldeide linker croce insieme con il coagulante acido acetico fissativo si potrebbe ottenere una buona conservazione della morfologia del tessuto. Inoltre, abbiamo scoperto che il pre-blocca le cellule prima di aggiungere le sonde non era necessario, in modo simile ad altri FISH descritto RNA protocolli 5. Inoltre, nella presente protocollo usiamo lavaggi dolci, una proteasi lieve (pepsina) a valori bassi e un breve periodo di incubazione per consentire la sonda e gli anticorpi per diffondere nel nucleo e ibridano con l'mRNA attaccato sulla ER, minimizzando l' danni alle membrane che circondano (Fig. 2A1-2A4).

Inoltre, la FISH RNA e le immagini ad alta risoluzione generato dal camerun allegato al microscopio confocale rivela se una determinata cella è positivo per la colorazione o meno, e fornisce anche preziose informazioni sulle relazioni spaziali tra l'RNA antisenso macchiato e il nucleo macchiato DAPI. Come risolto nelle immagini in figura 2A4, l'mRNA sembra essere attaccato vicino al nucleo, probabilmente nel reticolo endoplasmatico, e non su di esso, come previsto in un DNA-FISH immagine 11-12.

Studi di singole cellule richiedono osservazioni di numerosi parassiti ed a tempi diversi per ottenere un risultato statisticamente significativo. Pertanto, l'analisi FISH RNA è una tecnica piuttosto tempo che richiede pazienza e notevole sperimentazione tentativi ed errori per calibrare la tecnica. Come FISH RNA è una tecnica di molti parametri di risoluzione dei problemi guida per le fasi principali di questo protocollo sono riportati nella tabella 1.

Problema Possibile Cause Raccomandazione
Segnale debole o nessun segnale
  • MRNA espressione bassa.
  • mRNA degradazione.
  • Probe è degradata, in modo efficiente etichettati o troppo basso di concentrazione.
  • Temperatura di ibridazione troppo alta.
  • Pepsina trattamento troppo lungo.
  • Cellule non permeabilizzate abbastanza.
  • Controllare l'espressione della proteina mediante FACS.
  • Lavorare in condizioni di RNAsi liberi e utilizzare solo soluzioni preparate di recente.
  • Fare un controllo di qualità della sonda marcata su gel e confrontare ad un RNA di controllo etichettati. Fare una serie di titolazione della concentrazione sonda FISH.
  • Ridurre la temperatura di ibridazione graduale.
  • Ridurre la durata del trattamento pepsina.
  • Prolungare la Trea pepsinatment lunghezza o provare un altro detergente.
Scarso cellulare conservazione
  • Parassitemia troppo alta o parassiti stressati.
  • Film troppo spessa.
  • Badly pulito diapositive.
  • Le cellule sui vetrini deattached.
  • Utilizzare una sana cultura parassita mantenendo la parassitemia sotto del 10% e sostituzione del supporto di cellule ogni giorno.
  • Diluire la cultura parassita.
  • Pulire i vetrini con alcool e attendere almeno 10 minuti per le diapositive ad asciugare.
  • Utilizzare preparati para-formaldeide e / o aumentare la lunghezza paraformaldeide incubazione.
Sfondo di alta
  • Sonda concentrazione troppo alta.
  • Un lavaggio insufficiente diparassiti.
  • Scoppio shizonts.
  • Insufficienti lavaggi post-ibridazione.
  • Buffer di blocco è contaminato o inefficienti.
  • Fare una serie di titolazione della concentrazione sonda FISH.
  • Lavare i parassiti due volte prima di preparare il film sottili.
  • Sincronizzare la cultura più strettamente.
  • Aumentare il numero e / o la lunghezza di lavaggi.
  • Preparare nuovo tampone di bloccaggio. Prova altre blocco reagente, la concentrazione o prolungare il periodo di blocco
Il controllo positivo è trattata RNasi
  • La soluzione di RNasi è inattivo.
  • Troppo basso RNasi concentrazione.
  • L'incubazione è stato troppo breve.
  • Preparare una nuova soluzione di RNasizione.
  • Aumentare la concentrazione. Effettuare una serie di titolazione.
  • Prolungare il periodo di trattamento RNasi.
Falsi positivi di parassiti di controllo negativo
  • La sonda non è specifico.
  • Parassiti non esprimono l'mRNA rilevata dalla sonda.
  • Verificare la specificità delle sonde.
  • Verificare che la linea parassita utilizzato è quello giusto e appena selezionato.

Tabella 1. Guida Troobleshooting.

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Disclosures

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Acknowledgments

Gli autori desiderano ringraziare Michael Alifrangis e Ulla Abildtrup per la genotipizzazione di parassiti e Christina Holm per un'eccellente assistenza tecnica. Questo lavoro è stato finanziato da Howard Hughes Medical Institute (sovvenzione 55.005.511), la Fondazione Lundbeck (sovvenzione R9-A840) e dalla Fondazione Niels Bohr.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
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