Author Produced

Analyse af enkeltcelle-gentransskription ved RNA Fluorescent

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Fluorescent

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Adhæsion af Plasmodium falciparum inficerede erythrocytter (IE) til humane endotel receptorer under malariainfektioner medieres ved ekspression af PfEMP1 proteinvarianter kodet af VaR gener.

The haploid P. falciparum genom havne cirka 60 forskellige was gener, hvoraf kun én er blevet menes at blive transskriberet per celle ad gangen i blodet fase af infektionen. Hvordan en sådan gensidigt udelukker regulering af var gentranskription opnås er uklar, da er at identificere individuelle was gener eller undergrupper af VaR gener forbundet med forskellige receptorer og konsekvensen af forskellen binding på det kliniske resultat af P. falciparum infektioner. Senest har gensidigt udelukker transkription paradigme været draget i tvivl ved transskription assays baseret på individuel P. falciparum udskrift identifikation i en enkelt infected erytrocytiske celler under anvendelse af RNA fluorescerende in situ hybridisering (FISH) analyse af var gentranskription af parasitten i enkelte kerner af P. falciparum IE 1.

Her præsenterer vi en detaljeret protokol til udførelse af RNA-FISH metode til analyse af var gentranskription i single-kerner af P. falciparum inficerede humane erythrocytter. Fremgangsmåden er baseret på anvendelse af digoxigenin-og biotin-mærket antisense RNA-prober ved hjælp af TSA Plus Fluorescence Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopiske analyser og frisk valgt P. falciparum IE. Den in situ-hybridisering metode kan bruges til at overvåge transkription og regulering af en række gener udtrykt under de forskellige faser af P. falciparum livscyklus og kan tilpasses til andre malariaparasitten arter og andre organismer og celletyper.

Protocol

1. Generering af Frisk Udvalgte Inficerede Erythrocytter

Til dette assay, er de bedste resultater opnået ved anvendelse af frisk udvalgte kulturer for overfladeekspression af PfEMP1 protein. I dette særlige forsøg blev 3D7 P. falciparum linie blev valgt under anvendelse af specifikke antistoffer som beskrevet tidligere 1.

Dag 1

  1. Høst 200 pi pakkede blodlegemer fra en P. falciparum kultur indeholdende 2-5% sent IE ved centrifugering ved 800 x g i 8 minutter ved stuetemperatur.
  2. Resuspendere blodet pelleten i 2 ml 37 ° C varm 0,75% gelatineopløsning i et 14 ml sterilt rør, og efter henstand i 15-20 minutter ved 37 ° C for at tillade uinficerede og ring-fase IE at sedimentere.
  3. Høste de sene IE, dvs øvre fase, til et nyt 14 ml rør og vaskes to gange med 10 ml 37 ° C varm RBC-vaskemedier.
  4. Fortynd 50 ul specifik anti-PfEMP1-antistoffer i 2 ml 37 ° C varm RBC-vask medier og sterilt filter.
  5. Bland den vaskede sene IE med den steriliserede fortyndede antisera i et 14 ml sterilt rør og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
  6. Spin ned ved 800 x g i 8 minutter ved stuetemperatur, og vaskes to gange med 10 ml 37 ° C varm RBC-vaskemedier.
  7. Vask 50 pi Dynabead Protein A suspension to gange med RBC-vask medier ved hjælp af en DynaMaq-15 magnet.
  8. Resuspender de Dynabeads i 300 gl RBC-vask medier og tilføje dem til den vaskede sene IE. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C under forsigtig omrøring.
  9. Overfør røret til DynaMaq-15 magnet. Orlov til 1-2 min og fjerne al væsken.
  10. Resuspendere Dynabeads i 4-5 ml af RBC-vaskemedier. Overfør røret tilbage på magnet og lad det stå 1-2 min, før du fjerner al væsken. Gentag vasketrinet gang.
  11. Overfører de vaskede perler i et 25 cm2 steril kultur fLASK indeholdende 200 ul frisk pakkede røde blodceller. Tilføj 5-6 ml af Albumax medier ind i kulturen. Opbevares natten over ved 5% CO2 ved 37 ° C.

Dag 2

  1. Fjern Dynabeads fra kulturen, når den valgte IE har reinvaded de friske røde blodlegemer ved at overføre hele kulturen til et 14 ml sterilt rør. Sæt røret på DynaMaq-15 magnet og orlov til 1-2 min. Derefter hældes al væsken tilbage til en dyrkningskolbe.
  2. Kultur for så få cykler som muligt, indtil en parasitemia på 5-10% og parasitter er på ringstage.
  3. IE bør analyseres ved FACS for at sikre, at den korrekte overflade fænotype, har dvs proteinekspression for enten PFD1235w and/orPF11_0008 opnået 1.

2. Fremstilling af prober

Antisense RNA prober blev genereret fra de variable regioner af PFD1235w og PF11_0008 var </ Em> gener fra P. falciparum 3D7 genomisk DNA. DNA blev amplificeret ved PCR og klonet i pSPT18 eller 19 vektor til transkription, henholdsvis ifølge producentens beskrivelse (Roche). Proberne (580 basepar (bp) og 590 bp i længden) blev mærket med digoxigenin (DIG) eller biotin under anvendelse af en DIG-RNA-mærkningskit eller en Biotin-RNA mærkning Mix hhv. Vi bekræftede specificiteten af proberne både ved Northern blot-analyser samt ved en enkelt-label FISH-analyse 1.

3. Tynd Smear og Fiksering af parasitter Før In Situ Hybridization

Dag 1

Alle trin udføres i et RNase-frit miljø og alle reagenser er RNase-frit eller præ-behandlet med diethylpyrocarbonat (DEPC) eller RNase Zap (Invitrogen). De dias og dækglas skal rengøres med sprit for at fjerne resterende produktion fedt. Det er vigtigt at udføre protokollen uden nogen pause mellem trinfor at minimere risikoen for nuclease kontaminering.

  1. Lav en tynd blod film ved standard sprede metode 3. Brug af 100x olie objektiv af mikroskopet, IE tælle og beregne den procentdel af IE i kulturen. Kontroller, at parasitten faser er i omtrentlige synkront, i ringen og tidlige trophozoite stadier af IE cyklus. Det drejer sig om præ-replikation, uni-nucleate faser, der udtrykker var mRNA og egnet til encellede FISH transskription assays af denne type.
  2. Overfør 50 pi af parasitten kultur, ved en parasitæmi på 5-10%, til et 1,5 ml RNase-frit Eppendorf-rør. Centrifugeres i 1 minut ved 2.000 rpm ved stuetemperatur.
  3. Fjern mediet, og der tilsættes 50 pi PBS pH 7,2 i DEPC-behandlet vand. Omrør røret forsigtigt. Gentag centrifugal sedimentering trin to gange for at vaske cellerne fri medier og cellerester.
  4. Lav fire gode kvalitet tynde udstrygninger. For hver smear, gøre en smøre påen 11 mm diameter godt af en 4 godt dias, henholdsvis fire objektglas i alt, i en RNase-fri hætte (et afgørende skridt). Bølge glider kortvarigt i luften for at tørre. Har tre ekstra slides for negative kontroller-et objektglas for enkelt probe farvning for andre irrelevant gen ved anvendelse af en specifik probe, et andet objektglas til RNase-behandling og en tredje objektglas indeholdende IE ikke udtrykker genet af interesse. Lad objektglassene tørre på bænken for 10-20 min.
  5. Fastgør tynde film ved tilsætning af 60 pi fiksering opløsning indeholdende 4% paraformaldehyd og 5% iseddikesyre i brøndene. Lad i 10 minutter på bænken ved stuetemperatur.
  6. Vask objektglassene i 2 x SSPE-puffer i 5 minutter ved forsigtig omrystning ved stuetemperatur. Kort beskrevet fjerne overskydende væske ved at berøre brøndene indeholdende cellerne forsigtigt med en papirserviet.
  7. Dæk objektglassene med 0,01% pepsin i 0,01 M HCI i 2 minutter ved 37 ° C (en yderst kritisk trin). Vask objektglassene i 2 x SSPE i 5 minutter ved stuetemperatur.
  8. Fortyndes RNase opløsning til en slutkoncentration på 10 ug / ml. Dæk de negative kontrolprøver udstrygningspræparater med 60 ul af RNase løsning. Inkuber i 30 minutter ved 37 ° C og derefter vaske objektglassene i 2 x SSPE i 5 minutter ved stuetemperatur.
  9. Fortsæt straks til hybridiseringstrinnet.

4. Hybridisering af RNA-prober til Faste Slides

Dag 1

  1. Forbered hybridiseringskammeret, såsom en ThermoStar 100 HC4 eller en tom pipettespids box sat i en ren ovn, ved sprøjtning med RNase Zap og tørrer den ren med en papirserviet. Fyld kanalerne i hybridiseringskammeret eller bunden af ​​kassen med DEPC-behandlet vand for at sikre, at gliderne ikke udtørrer under hybridisering. Kammeret lukkes og forvarmes til 48 ° C.
  2. Fortynd proberne til hybridiseringsopløsningen til en slutkoncentration på 12 ng / ul. Denaturere probe opløsning ved 65 ° C i 5 min i en varmeblok. Straks chill på is.
  3. Kortvarigt lufttørre objektglassene efter 2x SSPE vask. Omhyggeligt fjerne overskydende væske omkring brøndene med en papirserviet.
  4. Åbn hybridiseringskammeret og placere dias i kammeret. Anvende en eller begge prober i et samlet volumen på 60 ul per well. Omhyggeligt dække væskedråbe med en RNase-frit dækglas med sterile pincetter.
  5. Kammeret lukkes og hybridiserer objektglassene ved 48 ° C i mindst 16 timer natten over.

5. Antistofkonjugation og fluorescens amplifikation

Dag 2

De følgende trin er baseret på TSA Plus Fluorescence Palette system fra Perkin Elmer. Alle trin udføres ved stuetemperatur.

  1. Vask gliderne 3 gange i TNT-puffer i 5 minutter med forsigtig omrøring.
  2. Bloker brøndene i 150 pi TNB-puffer i 30 minutter.
  3. Fortyndes HRP-konjugeret α-DIG-antistof i TNB-puffer i et forhold på 1:100 og HRP-konjugeret α-biotin antistof i TNB puffer, i et forhold på 1:500. Fjern overskydende TNB buffer fra dias med en papirserviet. Når der detekteres to transskripter samtidigt, kan begge antistoffer komme op. Anvendes en total mængde på 100 ul antistof-TNB opløsning per brønd og forsigtigt dækkes med en dækstrimmel. Glassene inkuberes i 2 timer.
  4. Fjern dækglas omhyggeligt. Vask objektglassene i TNT buffer 3 gange i 5 min.
  5. Fortynd FITC-fluorofor i tyramid amplifikationsreagens i et forhold på 1:500 og anvende 100 pi af opløsningen til hver brønd. Dække brøndene med dækglas og inkuberes i 12 min.
  6. Fjern låget glider forsigtigt og vask gliderne 3 gange i 5 minutter i TNT-puffer ved forsigtig rystning.
  7. Fortynd Cyan3-fluorofor i tyramid amplifikationsreagens i et forhold på 1:500. Tilsæt 100 pi prbrønd af denne opløsning. Dække brøndene med dækglas og inkuberes i 12 min.
  8. Fjern låget glider forsigtigt og derefter glassene skylles hurtigt ved nedsænkning i TNT buffer.
  9. Vask objektglassene 3 gange med TNT-puffer i 5 minutter.
  10. Fordyb diasene hurtigt i DEPC-behandlet vand.
  11. Lad objektglassene lufttørre. Monter glassene med anti-fade reagens indeholdende DAPI. Forsegl hjørnerne af dækglas med neglelak.
  12. Objektglassene er nu klar til mikroskopi. Hold slides dækket med aluminiumfolie og opbevares ved 4 ° C, hvis forsøget er at være afsluttet næste dag. En fuldstændig forsegling af siderne af gliderne kan udføres 24 timer efter påføring af anti-fade reagens. Herved vil slides der skal afbildes i op til en uge efter protokollen er afsluttet.

6. Visualisering af hybridiserede prober

  1. Tænd for mikroskopet. En standard immunofluorescens mikroskop er sufficient for denne slags eksperiment, men hvis du har adgang til et konfokalt mikroskop, kan du også bruge dette til 3D-billeder eller for at opnå videoer af dine farvede celler. Tillad mikroskop for at varme op i 15-30 minutter. Tænd for computeren og softwaren.
  2. Kontrollere kvaliteten af ​​farvningen på immunofluorescens-mikroskop. Vælg et sted, der indeholder et par parasitter.
  3. Justér forstærkningen af ​​hver laser manuelt. Juster pixel dvæle til 4-6 m -1 s -1 og de ​​skridt til 512 x 512 pixels.
  4. Tag et testbillede med Frame Lambda. Justér laser gevinst.
  5. Tage mindst 20 gode billeder af fluorescerende enkeltceller. Mindst 2-5 billeder af et felt indeholdende 5-20 parasitter er nødvendige for at opnå en rimelig overblik over procentdelen af ​​positive parasitter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 illustrerer et rutediagram af de vigtigste trin og varigheden af RNA FISH metoden.

En række repræsentative billeder af godt og dårligt bevarede farvede mRNA FISH eksperimenter med enkelt P. falciparum IE er vist i figur 2. Denne intracellulære protozo har en lille (fra 1 til 1,5 um diameter) kerne, som er farvet blåt med DAPI. Fireogtyve timer efter erythrocyt invasion i P. falciparum processen med schizogony, dvs nukleare division, begynder. Fisks påvisning af var gentransskription forekommer ved ca 10 til 22 timer i denne 48 timers intra-erytrocytiske lytiske cyklus. Prober generelt hybridisere til mRNA arter, der ligger lige op til den vigtigste nukleare organ, i hvad der sandsynligvis nuklear kappe-associeret endoplasmatiske reticulum. De billeder af god kvalitet i række A viser FITC-(grøn) og Cyan3-(rød) mærkede prober svarende til PFD1235w og PF11_0008 was gener forbindelser på den dobbelte udvalgte P. falciparum delaktionslinje, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-lokalisering af generne fremgår, men ikke absolut. Række B viser ringe hybridisering af begge prober til parasitter, som har enten nedbrudt eller stort set ophørt omskriver var mRNA. I række C, er en god fisk hybridisering opnået, men det cellulære konservering er dårlig, som det fremgår af dårligt sprede og samle parasitter.

Figur 1
Figur 1. RNA FISH eksperiment flowchart. Rutediagrammet illustrerer de vigtigste punkter og tidspunktet for FISH procedure.

Figur 2
Figur 2. Konfokale billeder af RNA-FISH i dobbelt udvalgte P. falciparum angiver samtidig kørsel mRNA transkription af to forskellige was gener mærket med enten FITC (green) eller Cyan3 (rød) signal. DAPI-farvning (blå) angiver parasitten kerne-DNA. Den lodrette række a1, b1 og c1 viser transmissions billeder af parasitterne. Scale bar 5 um.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNA FISH-analyse, i modsætning til fremgangsmåder såsom Northern blotting og RT-PCR, muliggør diskriminering af specifikke mRNA-transkripter på enkeltcelleniveau. Dette gør det muligt at skelne mellem transkriptionelt aktive og inaktive celler, i dette eksempel, P. falciparum parasitiske protozoer inden i humane røde blodlegemer. Sådanne helcelle-observationer er ofte nødvendige, og kan udrede vigtige og hidtil ukendte transkriptionelle mønstre en.

Selvom andre RNA-FISH metoder er blevet beskrevet 4-10, har der været et behov for udvikling af en ny og raffineret protokol til undersøgelse af samtidige var mRNA-transkription i P. falciparum. Ved at bruge asRNA prober som værktøjer til afsløring, kan de særlige tidsmæssige mønstre af mRNA aktivitet let lokaliseret i cellerne. Desuden kan asRNA prober også anvendes i andre eksperimentelle systemer som understøtter deres specificitet 1. Andre critriske parametre der er vigtige ved udviklingen af ​​en ny protokol omfatter fiksering og permeabilzation af cellerne. Disse foranstaltninger er blevet empirisk defineret ved at teste forskellige kemiske reagenser som foreslået af andre forfattere 5. Vi konkluderede, at ved at kombinere den langsomtvirkende tværbinder paraformaldehyd sammen med koagulanten fikseringsmiddel eddikesyre vi kunne opnå en god bevarelse af vævsmorfologi. Desuden fandt vi ud af, at præ-blokering af cellerne, før du tilføjer sonderne var det ikke nødvendigt, i lighed med andre beskrevet RNA FISH protokoller 5. Endvidere i denne protokol anvender vi blid vask, en mild protease (pepsin) i lave mængder og en kort inkubationsperiode for at tillade sonden og antistofferne diffundere ind i kernen og hybridisere med mRNA fastgjort på ER, minimere skader på omkringliggende membraner (Fig 2a1-2A4).

Desuden genererede RNA fisk og billeder med høj opløsning ved cameren fastgjort til konfokalt mikroskop viser, om en bestemt celle er positive for farvning eller ikke, og også giver værdifuld information om de rumlige relationer mellem de farvede antisense-RNA og DAPI-farvet kerne. Som løst i billederne i fig 2A4, mRNA synes at være fastgjort ved siden af kernen, sandsynligvis i det endoplasmatiske reticulum, og ikke ovenpå det, som forventet i en DNA-FISH billede 11-12.

Undersøgelser af enkeltceller kræver observationer af mange parasitter, og på forskellige tidspunkter for at få et statistisk signifikant resultat. Således RNA FISH-analyse er en temmelig tidskrævende teknik, der kræver tålmodighed og betydelige trial-and-error eksperimenteren at kalibrere teknikken. Da RNA FISH er en teknik mange parametre en fejlfinding guide til de vigtigste trin i denne protokol er angivet i tabel 1.

Problem Mulig cause Anbefaling
Svagt signal eller intet signal
  • Lav mRNA ekspression.
  • mRNA nedbrydning.
  • Probe nedbrydes, in-effektivt mærket eller for lav koncentration.
  • For høj hybridiseringstemperatur.
  • For lang pepsin behandling.
  • Celler ikke permeabiliseret nok.
  • Kontroller proteinekspression ved FACS.
  • Arbejdet under RNAse frie betingelser og kun bruge frisk fremstillede opløsninger.
  • Gør et kvalitetstjek af den mærkede probe på gel og sammenligne til en mærket kontrol RNA. Lav en titrering serie af sonden koncentration i fisk.
  • Reducere hybridiseringstemperatur trinvis.
  • Reducere pepsin behandling længde.
  • Forlænge pepsin treatment længde eller prøv en anden rengøringsmiddel.
Poor cellulær konservering
  • For høj parasitæmi eller stressede parasitter.
  • For tykke film.
  • Badly rengøres dias.
  • Cellerne på dias er deattached.
  • Anvende en sund parasit kultur ved at holde parasitemia under 10% og ændring af cellemediet hver dag.
  • Fortynd parasitten kultur.
  • Rengør glassene med alkohol og vente mindst 10 min for dias til tørre.
  • Brug frisk fremstillet para-formaldehyd og / eller øge paraformaldehydet inkubation længde.
Høj baggrund
  • For høj probekoncentration.
  • Utilstrækkelig vask afparasitter.
  • Bursting shizonts.
  • Utilstrækkelige post-hybridiserings-vaske.
  • Blokeringsbuffer er forurenet eller ineffektiv.
  • Lav en titrering serie af sonden koncentration i fisk.
  • Vask parasitter to gange, før fremstilling af de tynde film.
  • Synkronisere kulturen mere stramt.
  • Øge antallet og / eller varigheden af ​​vaskene.
  • Forbered ny blokeringspuffer. Prøv andre blokeringsreagens, koncentration eller forlænge blokeringsperioden
RNase behandlet kontrol er positiv
  • RNase løsning er inaktiv.
  • For lav RNase koncentrationen.
  • Inkubationen var for kort.
  • Forbered en ny Rnase løstion.
  • Øge koncentrationen. Lav en titrering serie.
  • Forlænge RNAse behandlingsperioden.
Falsk positiv påvisning af negative kontrol parasitter
  • Proben er ikke specifik.
  • Parasitter udtrykker ikke mRNA detekteret af sonden.
  • Kontroller specificiteten af ​​proberne.
  • Kontroller, at parasitten anvendte linje er den rigtige, og frisk valgt.

Tabel 1. Troobleshooting vejledning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne takke Michael Alifrangis og Ulla Abildtrup til genotypning af parasitter og Christina Holm for fremragende teknisk bistand. Dette arbejde blev finansieret af Howard Hughes Medical Institute (tilskud 55.005.511), Lundbeckfonden (tilskud R9-A840) og af Niels Bohr Instituttet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  3. Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
  4. Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
  5. Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
  6. Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
  7. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
  8. Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
  9. Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
  10. Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
  11. Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics