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Analyse von Einzel-Zell-Gene Transkription durch RNA-Fluorescent

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Biology

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Summary

Fluoreszierend

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

Adhäsion von Plasmodium falciparum infizierten Erythrozyten (IE) für die menschliche endotheliale Rezeptoren bei Malaria-Infektionen durch Expression PfEMP1 Protein-Varianten durch die Gene kodiert var vermittelt.

Die haploiden P. falciparum Genoms beherbergt etwa 60 verschiedene Gene var von denen nur eine geglaubt hat, die pro Zelle zu einem Zeitpunkt während des Blut Stadium der Infektion transkribiert. Wie solche gegenseitig ausschließenden Regulierung der Gentranskription var erreicht ist unklar, da die Identifizierung einzelner Gene oder var Untergruppen von var Gene mit verschiedenen Rezeptoren und die Folge der unterschiedlichen Bindung auf das klinische Ergebnis von P. zugeordneten falciparum-Infektionen. Vor kurzem hat die gegenseitig ausschließende Transkription Paradigma in Zweifel durch Transkription Assays auf Basis einzelner P. aufgerufen falciparum transcript Identifikation in einzelnen infektiert erythrozytären Zellen unter Verwendung von RNA Fluoreszenz in situ Hybridisierung (FISH) von var Gentranskription durch den Parasiten im einzelnen Kerne von P. falciparum IE 1.

Wir beschreiben hier ein ausführliches Protokoll zur Durchführung des RNA-FISH-Methodik zur Analyse von var Gentranskription in Einzel-Kerne von P. falciparum infiziert menschliche Erythrozyten. Das Verfahren beruht auf der Verwendung von Digoxigenin-Basis und Biotin-markierte Antisense-RNA-Sonden unter Verwendung der Fluoreszenz-Plus-TSA Palette System 2 (Perkin Elmer), mikroskopische Analysen und frisch ausgewählt P. falciparum IE. Die in situ-Hybridisierungsverfahren verwendet werden, um Transkription und Regulation einer Vielzahl von Genen in den verschiedenen Phasen des P. ausgedrückt überwachen falciparum Lebenszyklus und ist anpassungsfähig an andere Malaria-Parasiten Arten und anderen Organismen und Zelltypen.

Protocol

Ein. Generation von Frisch gewählte infizierten Erythrozyten

Für diesen Test werden die besten Ergebnisse erhalten werden, wenn unter Verwendung von frisch ausgewählt Kulturen für Oberflächenexpression von PfEMP1 Protein. In diesem speziellen Experiment das 3D7 P. falciparum Linie gewählt wurde mittels spezifischer Antikörper wie zuvor 1 beschrieben.

Tag 1

  1. Ernte 200 ul verpackt Blutzellen aus einer P. falciparum Kultur enthaltend 2-5% Spätstadium IE durch Zentrifugation bei 800 × g für 8 Minuten bei Raumtemperatur.
  2. Resuspendieren das Blut Pellet in 2 ml 37 ° C warmes 0,75% Gelatine Lösung in einem 14 ml steriles Röhrchen und lassen für 15-20 min bei 37 ° C, um die nicht-infizierten und Ring-Stadium IE zu sedimentieren lassen.
  3. Ernten die Late-Stage-IE, dh die obere Phase in ein neues 14 ml Tube und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien.
  4. Verdünnen Sie 50 ul von spezifischen Anti-PfEMP1-Antikörpern in 2 ml 37 ° C warmen RBC-Waschmedium und Sterilfilter.
  5. Mischen des gewaschenen Spätstadium IE mit der sterilisierten verdünnten Antiseren in einem 14 ml steriles Röhrchen und Inkubation 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren.
  6. Spin-Down bei 800 xg für 8 min bei Raumtemperatur und waschen zweimal mit 10 ml 37 ° C warmen RBC-wash Medien.
  7. Waschen 50 ul Dynabead Protein Eine Suspension zweimal mit RBC-wash Medien mit einem DynaMaq-15 Magnet.
  8. Resuspendieren Dynabeads in 300 ul RBC-wash Medien und fügen Sie sie der gewaschenen späten Stadium IE. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter vorsichtigem Rühren.
  9. Übertragen des Rohres mit dem DynaMaq-15-Magnet. Lassen Sie für 1-2 min und entfernen Sie die gesamte Flüssigkeit.
  10. Resuspendieren Dynabeads in 4-5 ml RBC-wash Medien. Übertragen Sie den Schlauch wieder auf den Magneten und lassen Sie es für 1-2 min, bevor Sie die gesamte Flüssigkeit. Wiederholen Sie den Waschschritt einmal.
  11. Übertragen Sie die gewaschenen Perlen zu einem 25 cm 2 sterile culture fLASK mit 200 ul frisch verpackt roten Blutkörperchen. Fügen Sie 5-6 ml Albumax Medien in der Kultur. Bewahren Sie über Nacht bei 5% CO 2 bei 37 ° C.

Tag 2

  1. Entfernen Sie die Dynabeads aus der Kultur, wenn der ausgewählte IE hat die frischen roten Blutkörperchen durch die Übertragung all der Kultur auf eine 14 ml steriles Röhrchen reinvaded. Setzen Sie den Schlauch auf den DynaMaq-15 Magneten und lassen für 1-2 min. Dann gießen Sie die gesamte Flüssigkeit zurück zu einer Kulturflasche.
  2. Kultur für so wenige Zyklen wie möglich, bis einer Parasitämie von 5-10% und Parasiten sind in der ringstage.
  3. IE sollte durch FACS analysiert werden, um sicherzustellen, dass die richtige Oberfläche Phänotyp, dh Protein Expression von entweder PFD1235w and/orPF11_0008 wurde 1 erhalten.

2. Herstellung von Sonden

Die Antisense-RNA-Sonden wurden aus den variablen Regionen der PFD1235w und dem PF11_0008 var erzeugt </ Em> Gene aus P. falciparum 3D7 genomischer DNA. DNA wurde durch PCR amplifiziert und in den Vektor pSPT18 oder 19 für die Transkription, jeweils gemäß der Beschreibung des Herstellers (Roche). Die Sonden (580 Basenpaare (bp) und 590 bp in der Länge) wurden mit Digoxigenin (DIG) oder Biotin markiert unter Verwendung eines DIG-RNA-Markierungskits oder einer RNA-Markierung Biotin-Mischung sind. Wir bestätigten die Spezifität der Sonden sowohl durch Northern Blot-Analysen und einfacher Bezeichnung FISH-Analyse 1.

3. Thin Smear und Fixierung der Parasiten Vor In-Situ-Hybridisierung

Tag 1

Alle Schritte werden in einer RNase-freien Umgebung durchgeführt wird und alle Reagenzien sind RNase-frei oder mit Diethylpyrocarbonat (DEPC) oder RNase Zap (Invitrogen) vorbehandelt. Die Objektträger und Deckgläser sollten mit Alkohol gereinigt werden, um restliche Fertigung Fett zu entfernen. Es ist wichtig, um das Protokoll ohne Pause zwischen den Schritten durchzuführenUm das Risiko einer Kontamination zu minimieren Nuklease.

  1. Machen Sie eine dünne Blutausstrich von der Norm Streumethode 3. Mit der 100x Öl Objektiv des Mikroskops, zählen die IE und berechnen den Anteil der IE in der Kultur. Prüfen, ob die Parasitenstadien in ungefährer Synchronität sind, in dem Ring und der frühen Stadien der Trophozoiten IE Zyklus. Dies sind die pre-Replikation, uni-nukleieren Stufen exprimieren var-mRNA und geeignet für einzelne Zelle FISH Transkriptionsassays dieses Typs.
  2. Übertragen 50 ul des Parasiten Kultur bei einer Parasitämie von 5-10%, einem 1,5 ml RNase-freies Eppendorfröhrchen. Säule für 1 min bei 2.000 rpm bei Raumtemperatur.
  3. Entfernen Sie die Medien und 50 ul PBS pH 7,2 in DEPC-behandeltem Wasser. Man schüttelt das Rohr vorsichtig. Wiederholen Sie den Zentrifugalsedimentation Schritt zweimal, um die Zellen frei von Medien und Zelltrümmer zu waschen.
  4. Machen Sie vier gute Qualität dünne Abstriche. Für jeden Abstrich machen ein Abstrich aufein Durchmesser von 11 mm sowie einer 4 gut Rutsche, dh vier Glasobjektträger insgesamt in einem RNase-free Haube (ein kritischer Schritt). Welle gleitet kurz in die Luft zu trocknen. Make drei zusätzliche Folien für Negativkontrollen-one Rutsche für einzelne Sonde Färbung für jede andere irrelevant Gen durch Verwendung einer spezifischen Sonde, ein weiterer Schieber für RNase-Behandlung und einer dritten Folie mit IE nicht Expression des Gens von Interesse. Lassen Sie die Folien auf der Bank für 10-20 min trocknen.
  5. Befestigen Sie die dünnen Schichten durch Zugabe von 60 ul der Fixierung Lösung mit 4% Paraformaldehyd und 5% Eisessig in die Vertiefungen. Lassen Sie für 10 Minuten auf der Bank bei Raumtemperatur.
  6. Waschen der Objektträger in 2x SSPE-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln bei Raumtemperatur. Entfernen Sie kurz die überschüssige Flüssigkeit durch Berühren die Brunnen, welche die Zellen vorsichtig mit einem Papiertuch.
  7. Bedecken Sie die Folien mit 0,01% Pepsin in 0,01 M HCl für 2 min bei 37 ° C (ein äußerst wichtiger Schritt). Waschen der Objektträger in 2x SSPE, 5 min bei Raumtemperatur.
  8. Verdünnt das RNase-Lösung bis zu einer Endkonzentration von 10 ug / ml. Bedecken Sie die negative Kontrolle Abstriche mit 60 ul der RNase-Lösung. Inkubieren für 30 min bei 37 ° C und dann waschen Sie die Folien in 2x SSPE für 5 min bei Raumtemperatur.
  9. Fahren Sie direkt mit der Hybridisierung.

4. Hybridisierung von RNA-Sonden auf Fixed Slides

Tag 1

  1. Bereiten Sie die Hybridisierung Kammer, wie ThermoStar 100 HC4 oder eine leere Pipettenspitzen-Kasten in einem sauberen Ofen geschoben, durch Bespritzen mit RNase Zap und Abwischen mit einem Papiertuch reinigen. Füllen der Kanäle der Hybridisierungskammer oder dem Boden der Schachtel mit DEPC-behandeltem Wasser, um sicherzustellen, daß die Schieber nicht austrocknet während der Hybridisierung. Schließen Sie die Kammer und Vorwärmung auf 48 ° C.
  2. Verdünnt den Sonden in der Hybridisierungslösung bis zu einer Endkonzentration von 12 ng / ul. Denaturieren die Sonde Lösung bei 65 ° C für 5 min in einem Heizblock. Sofort auf Eis kühlen.
  3. Kurz an der Luft trocknen die Folien nach der 2x SSPE waschen. Entfernen Sie vorsichtig die überschüssige Flüssigkeit rund um den Brunnen mit einem Papiertuch.
  4. Öffnen Sie die Hybridisierung Kammer und legen Sie die Folien in der Kammer. Anwendung einer oder beide Sonden in einem Gesamtvolumen von 60 ul pro Vertiefung. Sorgfältig decken die Flüssigkeitstropfen mit einem RNase-free Deckglas mit einer sterilen Pinzette.
  5. Schließen Sie die Kammer und hybridisieren die Folien bei 48 ° C für mindestens 16 Stunden über Nacht.

5. Antikörper Konjugation und Fluoreszenz Amplification

Tag 2

Die folgenden Schritte werden auf der TSA Plus-Fluoreszenz Palette System von Perkin Elmer basiert. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt.

  1. Waschen Sie die Slides 3 mal in TNT-Puffer für 5 min unter leichtem Schütteln.
  2. Blockieren Sie den Brunnen in 150 ul TNB-Puffer für 30 min.
  3. Verdünnt das HRP-konjugiertem α-DIG Antikörpers in TNB-Puffer in einem Verhältnis von 1:100 und das HRP-konjugiertem α-Biotin-Antikörper in TNB-Puffer, in einem Verhältnis von 1:500. Entfernen Sie überschüssiges TNB-Puffer von den Dias mit einem Papiertuch. Bei der Erfassung zwei Transkripte gleichzeitig können beide Antikörper auf einmal zu gehen. Tragen Sie eine Gesamtmenge von 100 ul des Antikörper-TNB-Lösung pro Well und vorsichtig mit einem Deckglas abdecken. Inkubieren Sie die Objektträger für 2 Stunden.
  4. Entfernen Sie die Deckgläser vorsichtig. Waschen der Objektträger in TNT-Puffer 3-mal für 5 min.
  5. Verdünnt das FITC-Fluorophor in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500 und anzuwenden 100 ul der Lösung in jede Vertiefung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min.
  6. Entfernen Sie den Deckel rutscht sorgfältig waschen und die Folien 3 mal für 5 min in TNT-Puffer durch vorsichtiges Schütteln.
  7. Verdünnt das Cyan3-Fluorophors in der Tyramid Amplifikationsreagens in einem Verhältnis von 1:500. Fügen Sie 100 ul proauch dieser Lösung. Bedecken Sie die Wells mit Deckgläsern und inkubieren für 12 min.
  8. Entfernen Sie den Deckel rutscht vorsichtig und dann spülen Sie die Folien schnell durch Eintauchen in TNT-Puffer.
  9. Waschen Sie die Slides 3 mal mit TNT-Puffer für 5 min.
  10. Eintauchen der Objektträger schnell in DEPC-behandeltem Wasser.
  11. Lassen Sie die Folien an der Luft trocknen. Montieren Sie die Folien mit Anti-Fade Reagenz DAPI. Verschließen Sie die Ecken der Deckgläser mit Nagellack.
  12. Die Folien sind nun bereit für die Mikroskopie. Halten Sie die Folien mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C abgedeckt, wenn das Experiment abgeschlossen am nächsten Tag ist. Eine vollständige Abdichtung der Seiten der Folien kann werden 24 Stunden nach dem Aufbringen des Anti-Fade-Reagens durchgeführt wird. Dadurch können die Folien für abgebildet werden bis zu einer Woche nachdem das Protokoll abgeschlossen ist.

6. Visualisierung der hybridisierten Sonden

  1. Schalten Sie das Mikroskop. Ein Standard Immunfluoreszenzmikroskop ist sufficient für diese Art von Experiment, aber wenn Sie Zugang zu einem konfokalen Mikroskop haben, können Sie dieses auch verwenden, für 3D-Bilder oder Videos von Ihrem gefärbten Zellen zu erhalten. Lassen Mikroskop zum Aufwärmen für 15-30 min. Schalten Sie den Computer und die Software.
  2. Prüfen Sie die Qualität der Färbung auf der Immunfluoreszenzmikroskop. Wählen Sie einen Ort mit ein paar Parasiten.
  3. Passen Sie die Verstärkung jedes Laser manuell. Passen Sie die Pixel zu 4-6 m -1 s -1 und die Schritte zu 512 x 512 Pixel wohnen.
  4. Nehmen Sie ein Testbild mit Frame Lambda. Stellen Sie die Laserverstärkung.
  5. Nehmen Sie ein Minimum von 20 gute Bilder von fluoreszierenden Einzelzellen. Mindestens 2-5 Bilder eines Feldes mit 5-20 Parasiten notwendig sind, um eine faire Überblick über den Prozentsatz an positiven Parasiten erhalten.

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Representative Results

Abbildung 1 zeigt ein Flussdiagramm der wichtigsten Schritte und der Zeitdauer der RNA FISH Methodik.

Eine Reihe von repräsentativen Bildern von gut und schlecht erhaltenen gefärbten mRNA FISH-Experimente mit einzelnen P. falciparum IE sind in Abbildung 2 gezeigt. Diese intrazellulären Protozoen hat einen kleinen (1-1.5 Mikrometer Durchmesser) Kern, blau gefärbt mit DAPI wird. Vierundzwanzig Stunden nach Erythrozyten Invasion im P. falciparum der Prozess der Schizogonie, dh Kernteilung beginnt. Optimal FISH Erkennung von var Gentranskription tritt bei etwa 10-22 h in diesem 48-Stunden-Intra-Erythrozyten-lytischen Zyklus. Sonden hybridisieren allgemein auf Arten, die neben dem Haupt nuklearen Körpers auftreten, im wohl Kernhülle-assoziierten mRNA endoplasmatische Retikulum. Die Bilder von guter Qualität in Zeile A zeigen FITC-(Grün) und Cyan3-(rot) markierten Sonden entsprechend der PFD1235w und PF11_0008 var Genen, die jeweils in der doppelten ausgewählt P. falciparum sub-line, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Co-Lokalisierung der Gene ist offensichtlich, aber nicht absolut. Reihe B zeigt eine schlechte Hybridisierung der beiden Sonden an Parasiten, die entweder abgebaut oder weitgehend eingestellt Transkription var mRNA haben. In Reihe C, ist eine gute FISH-Hybridisierung erhalten, aber die zelluläre Erhaltung schlecht ist, wie schlecht verteilt und Aggregation Parasiten gezeigt.

Abbildung 1
Abbildung 1. RNA FISH Experiment Flussdiagramm. Das Flussdiagramm zeigt die wichtigsten Punkte und den Zeitpunkt der FISH-Verfahren.

Abbildung 2
Abbildung 2. Konfokale Bilder von RNA-FISH im Doppelzimmer gewählt P. falciparum zeigt gleichzeitige mRNA Transkription von zwei unterschiedlichen Genen var entweder mit FITC (grün) oder Cyan3 (rot)-Signal bezeichnet. DAPI-Färbung (blau) zeigt den Parasiten nuklearen DNA. Die vertikale Reihe a1, b1 und c1 zeigen die Transmissionsbilder der Parasiten. Maßstab 5 um.

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Discussion

FISH-Analyse RNA im Gegensatz zu Verfahren, wie Northern Blot und RT-PCR, erlaubt die Diskriminierung von spezifischen mRNA-Transkripte in der einzelnen Zelle. Dies macht es möglich, zwischen transkriptionell aktiven und inaktiven Zellen zu unterscheiden, in diesem Beispiel, P. parasitischen Protozoen falciparum in menschlichen roten Blutzellen. Solche whole-cell Beobachtungen sind oft notwendig und kann zu entwirren wichtige und neuartige transkriptionellen Mustern ein.

Obwohl andere RNA FISH Methoden 4-10 beschrieben worden sind, hat es einen Bedarf an der Entwicklung eines neuen und verbesserten Protokolls für das Studium der gleichzeitigen var mRNA Transkription in S. falciparum. Durch die Verwendung von asRNA Sonden als Erkennungs-Tools können die Spezial-zeitlichen Muster der mRNA Aktivität leicht in den Zellen lokalisiert werden. Zusätzlich kann asRNA Sonden auch in anderen experimentellen Systemen, die ihre Spezifität 1 unterstützt verwendet würde. Andere critical wichtigen Parameter bei der Entwicklung einer neuen Protokoll umfasst Fixierung und permeabilzation der Zellen. Diese Schritte wurden empirisch durch Testen verschiedener chemischer Reagenzien wie von anderen Autoren 5 vorgeschlagen, definiert. Wir schlossen daraus, dass durch die Kombination der langsam wirkende Vernetzer Paraformaldehyd zusammen mit dem Koagulationsmittel Fixativ Essigsäure konnten wir eine gute Konservierung des Gewebes Morphologie zu erhalten. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass pre-Blockierung der Zellen vor der Zugabe der Sonden war nicht notwendig, ähnlich wie bei anderen beschriebenen RNA FISH-Protokolle 5. Ferner ist in der vorliegenden Protokoll verwenden wir sanfte wäscht, eine milde Protease (Pepsin) bei geringen Mengen und einen kurzen Inkubationszeit für die Sonde und den Antikörpern in den Kern diffundieren und hybridisieren mit der mRNA auf der ER befestigt ermöglichen, die Minimierung Schäden an umliegenden Membranen (Abb. 2a1-2a4).

Darüber hinaus ist die RNA FISH und die Bilder mit hoher Auflösung von der camer generierta angehängten dem konfokalen Mikroskop Aufschluss darüber, ob eine bestimmte Zelle positiv für Färbung oder nicht und gibt auch wertvolle Informationen über die räumlichen Beziehungen zwischen den gefärbten Antisense-RNA und der DAPI gefärbten Kern. Wie in den Bildern in Figur 2a4 gelöst, wird die mRNA neben dem Kern, wahrscheinlich in das endoplasmatische Retikulum, und nicht oben auf ihm befestigt werden, wie in einem DNA-FISH Bild 11-12 erwartet.

Studien von einzelnen Zellen erfordern Beobachtungen zahlreicher Parasiten und zu verschiedenen Zeitpunkten, um eine statistisch signifikante Ergebnisse zu erhalten. So ist RNA FISH-Analyse eine recht zeitaufwendige Technik, die Geduld und erheblichen trial-and-error Experimente verlangt, um die Technik zu kalibrieren. Als RNA FISH ist eine Technik von vielen Parametern a Fehlersuche Infos zu den wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind in Tabelle 1 angegeben.

Problem Mögliche cause Empfehlung
Schwaches Signal oder kein Signal
  • Low-mRNA-Expression.
  • mRNA-Abbau.
  • Probe abgebaut wird, in-effizient bezeichnet oder zu niedrig in der Konzentration.
  • Zu hohe Hybridisierungstemperatur.
  • Zu lange Pepsinbehandlung.
  • Zellen nicht permeabilisiert genug.
  • Überprüfen Sie die Proteinexpression durch FACS.
  • Arbeiten unter RNAse freien Bedingungen und verwenden Sie nur frisch hergestellte Lösungen.
  • Führen Sie eine Qualitäts-Check der markierten Sonde auf Gel und im Vergleich zu einem markierten Kontroll-RNA. Machen Sie eine Titrationsreihe der Sonde Konzentration in FISH.
  • Reduzieren Sie die Hybridisierungstemperatur schrittweise.
  • Reduzieren Sie die Pepsinbehandlung Länge.
  • Verlängern Sie die Pepsin treatment Länge oder versuchen Sie eine andere Reinigungsmittel.
Schlechte zellulären Erhaltung
  • Zu hohe Parasitämie oder gestresste Parasiten.
  • Zu dicke Schichten.
  • Schlecht gereinigt Dias.
  • Die Zellen werden auf die Folien deattached.
  • Verwenden Sie ein gesundes Parasiten Kultur, indem sie die Parasitämie unter 10% und die Änderung der Zellmedien jeden Tag.
  • Verdünnen Sie die Parasiten Kultur.
  • Reinigen Sie die Folien mit Alkohol und warten Sie mindestens 10 Minuten für die Folien zu trocknen.
  • Frisch hergestellten verwenden para-Formaldehyd und / oder Erhöhung der Paraformaldehyd Inkubation Länge.
Hohe Hintergrund
  • Zu hohe Konzentration der Sonde.
  • Ungenügendes Waschen derParasiten.
  • Platzen shizonts.
  • Unzureichende Beitrag Hybridisierung Wäschen.
  • Blockpuffer verschmutzt oder ineffizient.
  • Machen Sie eine Titrationsreihe der Sonde Konzentration in FISH.
  • Waschen Sie die Parasiten zweimal, bevor die Vorbereitung der Dünnschichten.
  • Synchronisieren Sie die Kultur stärker.
  • Erhöhen Sie die Anzahl und / oder die Länge der Wäschen.
  • Bereiten Sie neue Blocking-Puffer. Versuchen Sie andere Blockierungsreagenz, Konzentration oder Verlängerung der Sperrfrist
Die RNase behandelten Kontrollgruppe positiv
  • Die RNase-Lösung ist inaktiv.
  • Zu niedrige RNase-Konzentration.
  • Die Inkubationszeit war zu kurz.
  • Bereiten Sie eine neue Rnase Lösungention.
  • Erhöhen Sie die Konzentration. Machen Sie eine Titration Serie.
  • Verlängern Sie die RNAse Behandlungszeitraum.
Falsch positive Erkennung von negativen Kontrolle Parasiten
  • Die Sonde ist nicht spezifisch.
  • Parasiten drücken nicht die mRNA durch die Sonde nachgewiesen wird.
  • Überprüfen Sie die Spezifität der Sonden.
  • Prüfen Sie, ob der Parasit Linie verwendet die richtige ist und frisch ausgewählt.

Tabelle 1. Troobleshooting Führung.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgments

Die Autoren bedanken sich bei Michael Alifrangis und Ulla Abildtrup zur Genotypisierung von Parasiten und Christina Holm für hervorragende technische Unterstützung danken. Diese Arbeit wurde vom Howard Hughes Medical Institute (Zuschuss 55.005.511), The Lundbeck Foundation (R9-A840) und durch die Niels Bohr Foundation finanziert.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
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