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RNA 형광하여 단일 세포 유전자 전사의 분석

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Biology

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Summary

형광성의

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

말라리아 감염 동안 인간의 내피 수용체에 Plasmodium falciparum에 감염된 적혈구 (IE)의 접착은 VAR 유전자에 의해 인코딩 PfEMP1 단백질 변형의 표현에 의해 중재됩니다.

haploid P. falciparum 게놈은 하나가 감염 혈액 단계에서 한 번에 셀 당 베꼈 것으로되어있는 약 60 가지 VAR 유전자를 비호. 어떻게 VAR 유전자 전사의 이러한 상호 배타적 인 규제가 달성하는 것은 명확하지 않다, 개별 VAR 유전자 또는 P.의 임상 결과에 대한 서로 다른 수용체 및 차동 바인딩의 결과와 관련된 VAR 유전자의 하위 그룹의 식별이 falciparum 감염. 최근 상호 배타적 인 전사 패러다임은 개별 P.에 따라 전사 assays에 의해 의심을하게되었습니다 단일 INF의 falciparum 대본 확인P.의 개별 핵에있는 기생충에 의한 VAR 유전자 전사의 원위치 하이브리드 화에 RNA 형광을 사용하여 ected erythrocytic 전지 (물고기) 분석 falciparum IE 1.

여기, 우리는 P.의 단일 핵에 VAR 유전자 전사의 분석을 위해 RNA - 물고기 방법론을 수행하기위한 세부 프로토콜을 제시 falciparum은 인간의 적혈구를 감염. 방법의 사용을 기반으로 digoxigenin 및 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템 2 (Perkin 엘머), 미세 분석 갓 선택한 P.를 사용하여 안티센스 RNA 프로브에게 비오틴 - 표시 falciparum IE. 현장 하이브리드 방식의는 P.의 다른 단계에서 표현 전사와 유전자의 다양한 규제를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다 falciparum 수명주기와는 다른 말라리아 기생충 종과 다른 생물과 세포 유형에 적용 할 수 있습니다.

Protocol

1. 갓 선정 감염된 적혈구의 생성

PfEMP1 단백질의 표면 표현 신선한 선택 문화를 사용하는 경우이 분석은 가장 좋은 결과를 얻을 수 있습니다. 특정 실험 3D7 P.에서 falciparum의 일족이 이전에 1 설명한 바와 같이 특정 항체를 사용하여 선정되었습니다.

1 일

  1. P.의 포장 혈액 세포의 수확 200 μl falciparum 문화는 실온에서 8 분 800 XG에서 원심 분리하여 2~5% 늦게 무대 IE를 포함.
  2. 37 2 ML에서 피 펠렛를 다시 일시 중지 ° C 따뜻한 0.75 % 젤라틴 14 ML 멸균 튜브에 솔루션 및 침전에 감염되지 않은 및 링 단계 IE를 허용하도록 37 ° C 15-20 분에 출발합니다.
  3. 말기 IE를 수확, 새로운 14 ML 튜브로, 위의 단계를 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어.
  4. 특정 항 PfEMP의 50 μl를 희석37의 2 ML ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어와 살균 필터 1 항체.
  5. 37 번 30 분에 14 ML 멸균 튜브와 배양에서 살균 희석 antisera ° 부드러운 교반과 C와 함께 바랜 말기 IE를 섞는다.
  6. 상온에서 8 분 800 XG에 스핀 다운, 그리고 37 ° C 따뜻한 RBC - 세탁 미디어 10 ML로 두 번 씻어.
  7. DynaMaq-15 자석을 사용하여 RBC - 세탁 미디어와 중지 두 번 Dynabead 단백질의 50 μl를 씻으십시오.
  8. 300 μl RBC - 세탁 미디어에서 Dynabeads을 Resuspend하고 바랜 말기 IE에 추가​​합니다. 부드러운 교반과 37 ° C에서 30 분에 품다.
  9. DynaMaq-15 자석에 튜브를 전송합니다. 1-2 분을 위해 남겨 모든 액체를 제거합니다.
  10. RBC - 세탁 미디어의 4-5의 ML에 Dynabeads을 Resuspend. 자석에 튜브를 다시 전송하고 모든 액체를 제거하기 전에 1-2 분을 위해 출발합니다. 한 번 세척 단계를 반복합니다.
  11. 25cm 멸균 문화 F에 씻은 구슬을 전송200 μl 갓 포장 적혈구를 포함하는 lask. 문화에 Albumax 미디어의 5-6 ML을 추가합니다. 37 5 % CO 2에서 하루 아침에 저장 ° C.

2 일

  1. 선택한 IE는 14 ML 멸균 튜브에 대한 모든 문화를 전달하여 새로운 적혈구를 reinvaded 한 문화에서 Dynabeads를 제거합니다. DynaMaq-15 자석에 튜브를 넣고 1-2 분 동안 둡니다. 그런 다음, 문화 플라스크에 모든 액체를 다시 흘려.
  2. 와 같은 몇 5~10%의 parasitemia 때까지 가능한 한주기와 기생충에 대한 문화 ringstage 이용하실 수 있습니다.
  3. IE는 올바른 표면 표현형이 중 PFD1235w의 and/orPF11_0008의 즉, 단백질 표현이 1를 획득되었는지 확인하기 위해 FACS에 의해 분석해야합니다.

2. 프로브의 작성

안티센스 RNA 프로브는 PFD1235w과 PF11_0008 VAR의 가장 변수 지역에서 생성 된 <P.에서 / em>는 유전자 falciparum 3D7의 게놈의 DNA. DNA는 제조업체의 설명 (로슈)에 따라 각각 PCR에 의해 증폭 및 해독을 위해 pSPT18 또는 19 벡터로 복제되었습니다. 프로브 (580 기본 쌍 (BP)와 길이 590 BP)이 각각 파 RNA 라벨 키트 또는 비오틴 RNA 라벨 믹스를 사용하여 Digoxigenin (파) 또는 비오틴으로 표시되었습니다. 우리는 모두 북부 얼룩 분석 의해 단일 레이블 생선 분석 (1)에 의해 프로브의 특이성을 확인했습니다.

3. 현장 하이브리드 화에 얇은 문질러과 이전 기생충 고정

1 일

모든 단계는 RNase없는 환경에서 수행하고 모든 시약은 RNase 무료 또는 디 에틸 pyrocarbonate (DEPC) 또는 RNase 해치 (Invitrogen)로 사전 처리 있습니다. 슬라이드와 커버 용지는 잔여 제조 그리스를 제거하려면 알코올로 세척해야합니다. 이 단계들 사이에서 일시 정지하지 않고 프로토콜을 수행하는 것이 중요합니다nuclease 오염의 위험을 최소화하기 위해 인치

  1. 표준 확산 방법 3 얇은 혈액 필름을합니다. 현미경의 100x 오일 목적 렌즈를 사용 IE를 계산하고 문화 IE의 비율을 계산합니다. 기생충 단계는 링과 IE주기의 초기 trophozoite 단계에서, 대략 synchrony에 있는지 확인합니다. 다음은 미리 복제, 단일 핵 단계, 표현 VAR 유전자 mRNA와 이런 종류의 단세포 생선 전사 assays에 적합합니다.
  2. 1.5 ML RNase 무료 Eppendorf 튜브에 5-10 %의 parasitemia에서 기생충 문화의 50 μl를 전송합니다. 상온에서 2,000 rpm으로 1 분에 원심 분리기.
  3. 미디어를 제거하고 DEPC - 처리 된 물 50 μl PBS의 pH를 7.2을 추가합니다. 부드럽게 튜브를 선동. 미디어 및 세포 잔해에서 무료로 세포를 씻어 두 번 원심 침강 단계를 반복합니다.
  4. 넷 품질 얇은 얼룩을합니다. 각 비방를 들어,에 한 도말 표본을잘 RNase-자유 후드에서 4도 슬라이드, 총 즉, 네 유리 슬라이드 (중요한 단계) 중 하나에 11mm 직경. 파도가 건조 할 수있는 공중으로 간단히 슬라이드. 특정 프로브, RNase 처리 및 관심 유전자를 표현하지 IE 포함 삼분의 일 슬라이드의 또 다른 슬라이드를 사용하여 다른 관련이없는 유전자에 대한 단일 프로브 착색을위한 컨트롤 - 하나의 제외 슬라이드하기위한 세 가지 여분의 슬라이드를 확인합니다. 10-20 분 동안 벤치에 건조 할 수있는 슬라이드를 둡니다.
  5. 우물에 4 % paraformaldehyde 5 % 빙하 아세트산을 포함하는 고정 솔루션을 60 μl를 추가하여 박막을 수정합니다. 실온에서 벤치에 10 분 동안 둡니다.
  6. 실온에서 부드럽게 교반 5 분 동안 2 배 SSPE 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오. 간단히 종이 휴지로 부드럽게 세포를 포함하는 우물을 터치하여 초과 액체를 제거합니다.
  7. 37 ° C (매우 중요한 단계에서 2 분에 0.01 M HCL에 0.01 %의 펩신과 함께 슬라이드를 커버). 상온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻으십시오.
  8. 10 μg / ML의 최종 농도에 RNase 솔루션을 희석. RNase 솔루션의 60 μl로 대조군의 얼룩을 다룹니다. 37 ° C에서 30 분 동안 배양 한 후 실온에서 5 분을 위해 2 배 SSPE에 슬라이드를 씻어.
  9. 하이브 리다이 제이션 단계로 바로 진행합니다.

4. 고정 슬라이드로 RNA 프로브의 하이브리드

1 일

  1. 이러한 ThermoStar 100 HC4 또는 RNase 해치와 함께 분사하고 종이 휴지로 깨끗이 닦고하여 깨끗한 오븐에 넣어 빈 피펫 팁 상자 하이브 리다이 제이션 챔버을 준비합니다. 하이브 리다이 제이션 챔버 또는 슬라이드가 하이브리드 동안 밖으로 건조하지 않도록하기 위해 DEPC - 처리 물 상자 하단의 채널을 입력합니다. 48 챔버 및 예열을 닫으 ° C.
  2. 12 NG / μl의 최종 농도에 하이브 리다이 제이션 용액에 프로브를 희석. 가열 블록의 5 분에 65에서 프로브 솔루션 ° C를 변성. 즉시 얼음에 진정 하라구.
  3. 간단히 공기는 2 배 SSPE 세척 후 슬라이드를 건조. 조심스럽게 종이 휴지로 우물 주변에 초과 액체를 제거합니다.
  4. 하이브 리다이 제이션 챔버를 열고 챔버에 슬라이드를 놓습니다. 하나 또는 잘 60 μl의 총 볼륨의 두 프로브를 적용 할 수 있습니다. 조심스럽게 무균 집게를 사용하여 RNase 무료 커버 슬립이있는 액체 방울을 다룹니다.
  5. 챔버를 닫고 밤 동안 적어도 16 시간 48 ° C에서 슬라이드를 잡종을 만들다.

5. 항체 활용 및 형광 증폭

2 일

다음 단계는 Perkin 엘머에서 TSA 플러스 형광 팔레트 시스템을 기반으로합니다. 모든 단계는 실온에서 이루어집니다.

  1. 부드러운 교반 5 분 동안 TNT 버퍼에 슬라이드에게 3 번 씻으십시오.
  2. 30 분에 TNB 버퍼 150 μl에 우물을 차단.
  3. 1:500의 비율로, TNB 버퍼에 1:100의 비율과 HRP-복합 α-비오틴 항체에 TNB 버퍼에 HRP-복합 α-파의 항체를 희석. 종이 조직과 슬라이드에서 초과 TNB 버퍼를 제거합니다. 동시에 두 스크립트를 감지하면, 두 항체는 한 번에 이동할 수 있습니다. 물론 당 항체 - TNB 솔루션 100 μl의 총 금액을 적용하고 신중하게 커버 슬립을 다룹니다. 2 시간에 슬라이드를 품다.
  4. 조심스럽게 커버 용지를 제거합니다. 5 분에 3 회 TNT 버퍼에 슬라이드를 씻으십시오.
  5. 1:500의 비율에 tyramide 증폭 시약에 FITC-형광을 희석하여 각도에 대한 해결책의 100 μl를 적용 할 수 있습니다. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다.
  6. 조심스럽게 커버 미끄러를 제거하고 부드러운 교반에 의한 TNT 버퍼의 5 분의 슬라이드에게 3 번 씻는다.
  7. 1:500의 비율로 tyramide 증폭 시약의 Cyan3 - 형광을 희석. 100 μl를 추가합니다이 솔루션의 잘. 커버 용지로 우물을 커버하고 12 분에 품다.
  8. 커버를 제거주의 깊게 미끄러 후 TNT 버퍼에 빠져 신속하게 슬라이드를 씻어.
  9. 5 분을위한 TNT 버퍼로 슬라이드에게 3 번 씻으십시오.
  10. DEPC - 처리 물에 빠르게 슬라이드를 빠져.
  11. 건조 방송에 슬라이드를 둡니다. DAPI를 포함하는 안티 - 페이드 시약으로 슬라이드를 탑재합니다. 매니큐어와 커버 용지의 모서리를 밀봉합니다.
  12. 슬라이드 이제 현미경을위한 준비가되어 있습니다. 계속 4에 알루미늄 호일 및 매장으로 덮여 슬라이드 ° C 실험 다음 날 완료 될 경우. 슬라이드의 측면의 완전한 밀폐는 안티 - 페이드 시약을 적용한 후 24 시간을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토콜이 완료 된 후 슬라이드가 일주일에 이미징 될 수 있습니다.

6. Hybridized 프로브의 시각화

  1. 현미경을 사용합니다. 표준 immunofluorescence 현미경 suffic입니다당신은 공 촛점 현미경에 대한 액세스 권한이있는 경우 실험이 종류의 ient,하지만 당신은 또한 3D 이미지이를 사용할 수 있습니다 또는 귀하의 스테인드 세포의 비디오를 얻을 수 있습니다. 현미경은 15-30 분에 따뜻하게 할 수 있습니다. 컴퓨터와 소프트웨어에 전환합니다.
  2. immunofluorescence 현미경에 착색의 품질을 확인합니다. 몇 기생충을 포함하는 장소를 선택합니다.
  3. 수동으로 각 레이저의 게인을 조정합니다. 픽셀이 4-6m -1의 -1과 512 X 512 픽셀의 단계에 머물러 조정합니다.
  4. 프레임 람다를 사용하여 테스트 사진을보세요. 레이저 게인을 다시 조정.
  5. 형광 단일 세포의 20 좋은 사진 최소보십시오. 5-20 기생충을 포함하는 필드의 적어도 2-5 사진은 긍정적 인 기생충의 비율 공정 개요를 얻기 위해 필요합니다.

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Representative Results

그림 1은 주요 단계와 RNA 물고기 방법론의 시간 기간의 순서도를 보여줍니다.

단일 P.를 사용하여 잘하고 제대로 보존 스테인드 mRNA 생선 실험을 대표하는 일련의 이미지 falciparum IE는 그림 2에 표시됩니다. 이 세포 protozoan는 DAPI와 푸른 물들어있는 작은 (1-1.5 μm 직경) 핵이 있습니다. 배란 후 24 시간 P.의 적혈구 침공 후 falciparum은 schizogony, 핵분열의 과정이 시작됩니다. VAR 유전자 전사의 최적 생선 검색이 48 시간 간 erythrocytic lytic주기를 10-22 주위에 시간에 발생합니다. 프로브는 일반적으로 아마도 핵 봉투 - 관련 endoplasmic 소포체 무엇에, 주요 핵 몸 옆에 표시 종을 mRNA에 잡종을 만들다. 행에서 좋은 품질의 이미지 쇼 FITC-(녹색)와 PFD1235w와 P에 해당하는 Cyan3 - (적색) 표시 프로브이중 선택 P.에서 각각 F11_0008 VAR 유전자, falciparum 하위 라인, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. 유전자의 공동 현지화은 명백하지만, 절대하지 않습니다. 행 B 중 하나 저하 또는 크게 VAR mRNA 해석을 중단해야 기생충에 두 프로브의 가난한 하이브리드을 보여줍니다. 행 C에서 좋은 생선 하이브리드가 얻어되어 있지만 나쁘게 확산과 기생충을 집계하여 그림과 같이 세포 보존은 가난이다.

그림 1
1 그림. RNA 물고기 실험 순서도는. 순서도는 물고기 절차의 주요 포인트와 타이밍을 보여줍니다.

그림 2
그림 2. 더블 선택 P.의 RNA - 물고기의 공 촛점 이미지 simultanous 씨를 나타내는 falciparumFITC (녹색) 또는 Cyan3 (적색) 신호 중 하나가 표시된 두 개의 서로 다른 VAR 유전자의 NA 스크립트. DAPI의 얼룩 (파란색)은 기생충 핵 DNA를 나타냅니다. 수직 행 A1, B1과 C1은 기생충의 전송 이미지를 보여줍니다. 스케일 바 5 μm.

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Discussion

RNA 물고기 분석 등 북부 blotting과 RT-PCR 등의 방법에 대조적으로, 단일 세포 수준에서 특정 mRNA의 성적 차별을 할 수 있습니다. 이 P.,이 예에서는이 가능 transcriptionally 운영 중 및 운영 중지 세포 구별 할 수 있습니다 falciparum은 기생 인간의 적혈구 내부 원생 동물. 이러한 모든 세포 관찰은 종종 필요하고 중요하고 새로운 전사 패턴에게 1 낼 수 있습니다.

다른 RNA 물고기 방법은 4-10에 설명 된 있지만, P.의 동시 VAR mRNA 전사의 연구에 대한 새로운 세련된 프로토콜의 개발을위한 필요가있다 falciparum. 검색 도구로 asRNA 프로브를 사용하여 mRNA 활동의 특별한 시간적 패턴은 쉽게 셀에 지역화 할 수 있습니다. 또한, asRNA 프로브들은 구체적인 일을 지원하는 다른 실험 시스템에서도 사용할 수 있습니다. 기타 crit새로운 프로토콜을 개발 중요합니다 ICAL 매개 변수는 고정 및 세포의 permeabilzation이 포함되어 있습니다. 이 단계는 경험적으로 5 기타 저자가 제안 등 다양한 화학 시약을 테스트에 의해 정의되었다. 우리는 응고제 정착액 아세트산과 함께 느린 행동 크로스 링커 paraformaldehyde를 결합하여 우리가 조직 형태의 좋은 보존을 얻을 수 있다는 결론을 내렸다. 또한 사전 차단 프로브를 추가하기 전에 전지하면 비슷하게 다른 설명 RNA 물고기 프로토콜 5, 필요하지 였다는 걸 알게되었습니다. 또한, 현재 프로토콜에서 우리는을 최소화 프로브 및 핵으로 무마 ER에 붙어있는 mRNA와 잡종을 만들다 할 수있는 항체을 할 수 있도록 부드러운 세차, 낮은 양의 온난 한 단백 분해 효소 (펩신)과 짧은 잠복기를 사용하여 주변 멤브레인 (그림 2a1-2a4)에 손상.

또한, RNA의 생선과 높은 해상도 이미지는 camer에 의해 생성 된공 촛점 현미경에 연결된는 특정 셀 착색 여부에 대해 긍정적인지 여부를 알 수 있으며, 스테인드 안티센스 RNA와 DAPI의 스테인드 핵 사이의 공간 관계에 대한 중요한 정보를 제공합니다. 그림 2a4의 이미지에서 해결, mRNA는 DNA - 물고기 이미지 11-12에서 예상되는, 아마도 endoplasmic 소포체에 가지 말고 상단에있는 핵 옆에 부착 것 같습니다.

단일 세포의 연구는 수많은 기생충과 다른 시간 지점에서 관측 통계적으로 의미있는 결과를 얻을 필요합니다. 따라서, RNA 생선 분석 기법을 보정 양해와 상당한 시행 착오 실험을 요구 다소 시간이 소요 기술입니다. RNA의 물고기는 많은 매개 변수의 기법이다이 프로토콜의 주요 단계에 대한 문제 해결 가이드는 표 1에 주어집니다.

문제 가능한 cauSE 추천
신호가 약한 또는 전혀 신호
  • 낮은 mRNA의 표현.
  • 저하 mRNA.
  • 프로브 내에는 효율적으로 표시된거나 너무 낮은 농도로, 성능이 저하됩니다.
  • 너무 높은 하이브리드 온도.
  • 너무 긴 펩신 처리.
  • 세포는 충분한 permeabilized되지 않습니다.
  • FACS에 의해 단백질 식을 확인합니다.
  • RNAse 무료 조건에서 동작하며 신선하게 조리 된 솔루션을 사용합니다.
  • 젤에 표시된 프로브의 품질 검사를 수행하고 표시된 제어 RNA를 비교합니다. 물고기의 프로브 농도의 적정 시리즈를합니다.
  • 하이브리드 온도가 stepwise 줄일 수 있습니다.
  • 펩신 치료의 길이를 줄입니다.
  • 펩신 trea을 연장tment의 길이 또는 다른 세제를 사용해보십시오.
나쁨 세포 보존
  • 너무 높은 parasitaemia이나 스트레스 기생충.
  • 너무 두꺼운 필름.
  • 나쁘게 슬라이드를 청소.
  • 슬라이드에 세포는 deattached 있습니다.
  • 10%에서 parasitemia을 유지하고 매일 세포 미디어를 변경하여 건강한 기생충 문화를 사용합니다.
  • 기생충 문화를 희석.
  • 술과 함께 슬라이드를 깨끗하고 건조 할 수있는 슬라이드에 적어도 10 분 기다립니다.
  • 사용 갓 파라 포름 알데히드 및​​ / 준비하거나 paraformaldehyde 부화 길이를 늘리십시오.
높은 배경
  • 너무 높은 프로브 농도.
  • 의 부족 세탁기생충.
  • shizonts을 파열.
  • 부족 포스트 하이브리드 washings.
  • 차단 버퍼 훼손이나 비효율적입니다.
  • 물고기의 프로브 농도의 적정 시리즈를합니다.
  • 얇은 필름을 준비하기 전에 두 번 기생충을 씻으십시오.
  • 더 단단히 문화를 동기화합니다.
  • 세차의 수 및 / 또는 길이를 늘립니다.
  • 새로운 차단 버퍼를 준비합니다. 다른 차단 시약, 집중력을 시도하거나 차단 기간을 연장
RNase 처리 제어 긍정적이다
  • Rnase 솔루션은 비활성화되어 있습니다.
  • 너무 낮은 RNase 농도.
  • 부화가 너무 짧습니다.
  • 새로운 Rnase solu 준비기.
  • 농도를 높입니다. 적정 시리즈를합니다.
  • RNAse 처리 기간을 연장.
부정적인 제어 기생충 거짓 긍정적 검출
  • 프로브는 특정하지 않습니다.
  • 기생충은 프로브에 의해 감지 mRNA을 표현하지 않습니다.
  • 프로브의 특이성을 확인합니다.
  • 사용 기생충 줄 오른쪽 하나이며 신선한 선택되어 있는지 확인합니다.

표 1. Troobleshooting 안내.

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Disclosures

관심 없음 충돌이 선언 없습니다.

Acknowledgments

저자는 우수한 기술 지원을 위해 기생충과 크리스티나 Holm이의 genotyping을 위해 마이클 Alifrangis과 Ulla Abildtrup 감사드립니다. 이 작품은 하워드 휴즈 의학 연구소 (보조금 55,005,511), Lundbeck 재단 (부여 R9-A840)와 닐스 Bohr 국제 교류 재단이 지원되었습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

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