Author Produced

RNA Floresan tarafından Tek hücreli Gen Transkripsiyon Analizi

JoVE Journal
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Floresan

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Sıtma enfeksiyonları sırasında insan endotel reseptörlerine Plasmodium falciparum enfekte eritrositler (IE) Yapışma var genler tarafından kodlanan PfEMP1 protein varyantları ifade aracılık etmektedir.

Haploid P. falciparum genom tek bir enfeksiyonun kan aşaması sırasında her defasında hücre başına transkribe olduğu düşünülmektedir edilmiş olan yaklaşık 60 farklı var genler barındırır. Nasıl var gen transkripsiyonu gibi birbirini dışlayan düzenleme elde edilir belirsizdir, bireysel var genleri veya P. klinik sonuçlar üzerinde farklı reseptörleri ve diferansiyel bağlama sonucu ile ilişkili var genlerin alt gruplarının tanımlanmasıdır falciparum enfeksiyonlar. Son zamanlarda, birbirini dışlayan transkripsiyon paradigması bireysel P. esas transkripsiyon analizleri ile şüphe içine adı olmuştur Tek inf içinde falciparum transkript tespitiP. bireysel çekirdeklerinde parazit var gen transkripsiyonu in situ hibridizasyon RNA floresan kullanarak ected eritrotik hücreleri (FISH) analizi falciparum IE 1.

Burada, P. tek-çekirdekleri var in gen transkripsiyonu analizi için RNA FISH yöntemi gerçekleştirmek için bir protokol ayrıntılı sunmak falciparum insan eritrosit etkilemiştir. Yönteminin kullanımını esas digoxigenin-ve TSA Artı Flüoresans Palet Sistemi 2 (Perkin Elmer), mikroskopik analiz ile taze seçilmiş S. antisens RNA probları kullanılarak biyotin-etiketli falciparum IE. In situ hibridizasyon metodu ile de P. farklı aşamaları sırasında ifade edilen genlerin transkripsiyonu ve çeşitli düzenleme izlemek için kullanılabilecek falciparum yaşam döngüsü ve diğer sıtma parazit türlerinin ve diğer organizmalar ve hücre tipleri uyarlanabilir.

Protocol

1. Taze Seçilen Enfekte Eritrositler Nesil

PfEMP1 proteininin yüzeyde ekspresyonu için seçilen taze kültür kullanılarak, bu test için, en iyi sonuçlar elde edilir. Bu özel deney 3D7 P. falciparum soyu önce 1 açıklandığı gibi spesifik antikorlar kullanılarak seçildi.

1. Gün

  1. Bir S. dan paketlenmiş kan hücrelerinin hasat 200 ul falciparum kültürü oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 x g'de santrifüj ile% 2-5 geç safha IE içeren.
  2. 37. 2 ml kan pelet yeniden askıya ° C sıcak% 0.75 jelatin bir steril 14 ml tüp içinde çözelti ve tortu ile enfekte olmamış ve halka-aşamalı IE izin vermek için 37 ° C sıcaklıkta 15-20 dk için bırakın.
  3. Son aşama IE hasat etmek, yeni bir 14 ml tüp içine, üst faz, yani, 37 ° C sıcak RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır.
  4. Belirli bir anti-PfEMP 50 ul seyreltin37 2 ml ° C sıcak RBC yıkama medya ve steril filtre 1 antikorları.
  5. 37, 30 dakika boyunca 14 ml steril tüp ile inkübe steril seyreltilmiş antiserumlar ° hafif ajitasyon ile C ile yıkanmış son aşama IE karıştırın.
  6. Oda sıcaklığında 8 dakika boyunca 800 xg'de aşağı Spin, ve 37 ° C'de sıcak bir RBC-yıkama ortamı 10 mL ile iki kez yıkanır.
  7. Bir DynaMaq-15 mıknatıs kullanarak RBC-yıkama medya ile bir süspansiyon kez Dynabead Protein 50 ul yıkayın.
  8. 300 ul RBC yıkama medya Dynabeads süspanse ve yıkanmış geç evre IE ekleyebilirsiniz. Nazik çalkalama ile 37 ° C 'de 30 dakika süre ile inkübe edin.
  9. DynaMaq-15 mıknatıs tüp aktarın. 1-2 dakika bırakın ve tüm sıvı kaldırmak.
  10. RBC-yıkama ortamı 4-5 ml Dynabeads yeniden süspanse edin. Mıknatıs üzerine tüpü geri aktarın ve tüm sıvı çıkarmadan önce 1-2 dakika bekletin. Kez yıkama adımı yineleyin.
  11. 25 cm 2 steril kültür f yıkanmış boncuklar aktarın200 ul taze paketlenmiş kırmızı kan hücreleri içeren LASK. Kültürün içine Albumax medyanın 5-6 ml ekleyin. 37% 5 CO2 de bir gece ° C'de saklayın

2. Gün

  1. Seçilen IE bir steril 14 ml tüp için tüm kültür aktararak taze kırmızı kan hücreleri reinvaded olan kültürden Dynabeads çıkarın. DynaMaq-15 mıknatıs üzerine tüpü koyun ve 1-2 dakika bekletin. Daha sonra, bir kültür şişesine tüm sıvı geri dökülür.
  2. Olduğunca az% 5-10 parazitemi kadar mümkün olduğunca döngüleri ve parazitler için Kültür ringstage altındadır.
  3. IE doğru yüzey fenotipini ya PFD1235w and/orPF11_0008 yani protein ekspresyonu 1 elde edilmiştir emin olmak için FACS tarafından analiz edilmelidir.

2. Sondalar hazırlanması

Antisense RNA probları PFD1235w ve PF11_0008 var olan en değişken bölgelerin elde edildi <P. den / em> genler falciparum 3D7 genomik DNA. DNA, üreticinin tanım (Roche) 'ye göre, sırasıyla, PCR ile amplifiye edilir ve transkripsiyon için pSPT18 vektör ya da 19 içine klonlandı. Sondalar (580 baz çifti (bp) ve uzunluğu 590 bp) sırasıyla DIG RNA etiketleme Kiti veya Biyotin RNA etiketleme Mix kullanarak digoxigenin (DIG) veya Biyotin ile işaretlendi. İkimiz de Northern blot analizleri ile ve tek etiketli FISH analizi 1 ile probların özgüllüğü doğruladı.

3. İn Situ Hibridizasyon İnce Smear ve öncesinde Parazitler Fiksasyon

1. Gün

Tüm adımlar RNase içermeyen bir ortamda gerçekleştirilir ve tüm reaktifler RNase içermeyen ya da dietil pyrocarbonate (DEPC) ya da RNaz Zap (Invitrogen) ile önceden tedavi edilen vardır. Slaytlar ve kapak camları artık üretim gres kaldırmak için alkol ile temizlenmelidir. Bu adımlar arasında herhangi bir duraklama olmadan protokolü gerçekleştirmek için önemlidirnükleaz kontaminasyon riskini en aza indirmek için.

  1. Standart yayma yöntemi 3 ile ince bir kan film yapın. Mikroskop 100x yağı objektif lens kullanarak IE saymak ve kültür IE yüzdesi hesaplanır. Parazit aşamalarını halka ve IE döngüsünün erken trofozoit aşamalarında, yaklaşık senkronize olduğunu kontrol edin. Bu ön-çoğaltma, tek çekirdekli aşamaları, ifade var gen mRNA ve bu tip tek bir hücre FISH transkripsiyon testleri için de uygundur.
  2. 1.5 ml RNaz ücretsiz Eppendorf tüp,% 5-10 parazitemi de, parazitin kültür 50 ul aktarın. Oda sıcaklığı altında 2.000 rpm hızında 1 dakika için santrifüjleyin.
  3. Ortamı çıkarın ve DEPC-işlenmiş su 50 ul PBS pH 7.2 ekleyin. Tüpü yavaşça çalkalayın. Medya ve hücre artıkları ücretsiz hücreleri yıkamak için iki santrifüj sedimantasyon adımı yineleyin.
  4. Dört kaliteli ince smear olun. Her smear için, üzerine bir karalama yapmakiyi bir RNaz ücretsiz kaputu bir 4 sıra slayt, toplam yani dört cam slaytlar, (önemli bir adım) biri 11 mm çapında. Dalga kuru havaya kısaca kayar. Belirli bir prob, RNaz tedavi ve ilgilenilen genin ifade IE içeren üçüncü bir slayt için başka bir slayt kullanarak başka alakasız gen için tek prob boyama için kontroller-bir negatif slayt için üç ekstra slaytlar olun. 10-20 dakika tezgah üzerinde kurumasına slaytlar bırakın.
  5. Kuyu içine% 4 paraformaldehid ve% 5 asetik asit içeren, tespit solüsyonu 60 ul ilave edilerek ince filmlerin düzeltildi. Oda sıcaklığında, tezgah üzerinde 10 dakika bekletin.
  6. , Oda sıcaklığında nazik çalkalama ile 5 dakika için 2 x SSPE tampon içinde slaytlar yıkayın. Kısaca bir kağıt mendille hafifçe hücreleri içeren kuyular dokunarak aşırı sıvı kaldırmak.
  7. 37 ° C'de (çok önemli bir adım 2 dakika süreyle, 0.01 M HCl içinde% 0.01 pepsin ile slaytlar Kapak). Oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın.
  8. 10 ug / ml 'lik nihai bir konsantrasyona kadar, RNaz çözeltisi ile seyreltilir. RNaz solüsyonu 60 ul ile negatif kontrol yayma kaplayın. 37 ° C de 30 dakika inkübe ve daha sonra da oda sıcaklığında 5 dakika için 2 x SSPE, slaytları yıkayın.
  9. Hibridizasyon adımı hemen geçin.

4. Sabit Slaytlara RNA problar Hibritleşmesi

1. Gün

  1. Böyle bir Thermostar 100 HC4 veya RNaz Zap ile püskürtme ve bir kağıt mendille silerek temizleyin, temiz bir fırın koymak boş bir pipet ucu kutusu olarak hibridizasyon odasının, hazırlayın. Hibridizasyon odasının veya slaytlar hibridizasyon sırasında kurumasına olmayacak emin olmak için DEPC-işlenmiş su ile kutunun alt kanalları doldurun. 48 odası ve ön ısıtma kapatın ° C.
  2. 12 ng / ul nihai konsantrasyon için hibridizasyon probları çözelti içine seyreltilir. Bir ısıtma bloğu içinde 5 dakika için 65 ° C sonda çözelti denatüre. Hemen buz üzerinde soğutun.
  3. Kısaca hava 2x SSPE yıkamadan sonra slaytları kurulayın. Dikkatlice bir kağıt mendille kuyu çevresinde aşırı sıvı kaldırmak.
  4. Hibridizasyon odasının açın ve odasında slayt yerleştirin. Bir ya da kuyu başına 60 ul toplam hacim içinde, her iki sensör uygulanır. Dikkatlice steril forseps kullanarak bir RNaz içermeyen kapak kayma ile sıvı damlası kapsamaktadır.
  5. Oda kapatın ve gece boyunca en az 16 saat süreyle 48 ° C 'de slaytlar melezleşir.

5. Antikor Konjugasyon ve Floresans Amplifikasyon

2. Gün

Aşağıdaki adımları Perkin Elmer dan TSA Artı Flüoresans Palet sistemi dayanmaktadır. Tüm adımlar oda sıcaklığında yapılır.

  1. Nazik ajitasyon ile 5 dakika boyunca TNT tampon slaytlar 3 kere yıkayın.
  2. 30 dakika için TNB tampon 150 ul kuyu Blok.
  3. 1:500 oranında, TNB tamponu içinde 1:100 'lük bir oran ile HRP-eşlenikli α-biotin antikor de TNB tampon içinde HRP-eşlenikli α-DIG antikoru seyreltilir. Bir kağıt mendille slaytlar emdiği TNB tampon çıkarın. Aynı anda iki transkript tespit edildiğinde her iki antikor seferde gidebilirsiniz. Kuyu başına antikor-TNB çözeltisinden 100 ul toplam miktar uygulanır ve dikkatli bir şekilde bir kapak slipi ile kaplayın. 2 saat için slaytlar inkübe edin.
  4. Dikkatle kapak camları çıkarın. 5 dakika boyunca 3 kez TNT tampon slaytlar yıkayınız.
  5. 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif içinde FITC-fluorofor seyreltilir ve her oyuğa 100 ul çözelti uygulanır. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir.
  6. Dikkatlice kapağı fişleri çıkarın ve yavaşça sallanarak TNT tamponu içinde 5 dakika boyunca slaytlar 3 kere yıkayın.
  7. 1:500 oranında tyramide amplifikasyon reaktif olarak Cyan3-fluorofor seyreltilir. Başına 100 ul ekleyinBu çözüm de. Kapağı makbuzları ile kuyu örtün ve 12 dakika inkübe edilir.
  8. Kapağını çıkarın dikkatli kayıyor ve sonra TNT tampon batırılarak hızla slaytlar durulayın.
  9. 5 dk için TNT tampon ile slaytlar 3 kere yıkayın.
  10. DEPC-işlenmiş su hızlı bir şekilde slaytlar daldırın.
  11. Kurumaya slaytlar bırakın. DAPI içeren anti-solmaya reaktifi ile slaytlar monte edin. Oje ile kapak camları köşelerinde mühürleyin.
  12. Slaytlar artık mikroskopi için hazırız. Ol 4'te alüminyum folyo ile kaplanmış ve mağaza slaytlar ° C deney ertesi gün tamamlanması için ise. Slaytlar iki tam bir sızdırmazlık solmaya karşı reaktif uygulamadan sonra 24 saat üzerinden gerçekleştirilebilir. Bu protokol tamamlandıktan sonra, slaytlar bir hafta için yansıma sağlar.

6. Melezleşmiştir Sondalar Görselleştirme

  1. Mikroskop açın. Standart bir immünofloresan mikroskop suffic olduğunuEğer bir konfokal mikroskop erişiminiz varsa deney bu tür ient, ama aynı zamanda 3D görüntüleri için kullanabilirsiniz ya da boyanmış hücrelerin videolar elde etmek. Mikroskop 15-30 dakika ısınmasını bekleyin. Bilgisayar ve yazılım açın.
  2. Immünofloresan mikroskop boyama kalitesini kontrol edin. Birkaç parazitler içeren bir nokta seçin.
  3. Elle her lazerin kazanç ayarlayın. Piksel 4-6 m -1 s -1 ve 512 x 512 piksel adımları yaşamak ayarlayın.
  4. Çerçeve Lambda kullanarak bir test resim çekin. Lazer kazanç yeniden ayarlayın.
  5. Floresan tek hücre 20 iyi resimler en az atın. 5-20 parazitler içeren bir alanda en az 2-5 fotoğraf pozitif parazitlerin yüzdesi adil bir bakış elde etmek için gereklidir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 1, büyük adımlar ve RNA FISH yöntemin zaman süresinin bir akış şeması gösterilmektedir.

Tek P. kullanarak iyi ve kötü korunmuş lekeli mRNA BALIK deneyler temsili görüntüleri bir dizi falciparum IE Şekil 2 'de gösterilmiştir. Bu intrasellüler protozoon DAPI ile mavi lekeli bir küçük (1-1.5 mikron çapında) çekirdeğe sahip. Yirmi dört saat P. eritrosit işgalinden sonra falciparum schizogony, yani nükleer bölünme süreci başlar. Var gen transkripsiyonu Optimal BALIK algılama bu 48 hr içi eritrosit litik döngüye 10-22 etrafında saatte gerçekleşir. Problar genellikle muhtemelen nükleer zarf ilişkili endoplazmik retikulum nedir, ana nükleer vücuda bitişik görünen türler mRNA'ya melezleşme. Satırdaki kaliteli görüntüler bir gösteri FITC (yeşil) ve PFD1235w ve P karşılık Cyan3-(kırmızı) işaretli problarÇift seçilmiş P. sırasıyla F11_0008 var genlerin falciparum alt-çizgi, 3D7 PFD1235w/PF11_0008. Genlerin Co-lokalizasyonu belirgin ama mutlak değildir. Satır B ya bozulmuş ya da büyük ölçüde var mRNA transkripsiyonu kesildiği tarih var parazitler hem problar zayıf hibridizasyon gösterir. Sıra C, iyi bir FISH hibridizasyon elde edilir ama kötü yayılır ve parazitleri toplayarak tarafından gösterildiği gibi hücresel koruma, kötüdür.

Şekil 1
Şekil 1. RNA BALIK deney akış şeması. Akış şeması FISH prosedürünün ana noktaları ve zamanlama göstermektedir.

Şekil 2,
Şekil 2. Çift seçilen P. RNA-FISH Konfokal görüntüler simultanous mR belirten falciparumFITC (yeşil) ya da Cyan3 (kırmızı) sinyal ya ile etiketlenmiş iki farklı var genin transkripsiyon NA. DAPI boyama (mavi) parazit nükleer DNA gösterir. Dikey satır a1, b1 ve c1 parazitlerin iletim görüntüleri göstermek. Ölçek çubuğu 5 mikron.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

RNA FISH analizi, bu gibi Northern blot ve RT-PCR gibi yöntemlerin tersine, tek bir hücre düzeyinde spesifik mRNA transkriptlerinin ayrımı izin verir. Bu, P., bu örnekte, bu mümkün transkripsiyonel olarak aktif ve aktif olmayan hücreler arasında ayrım yapan falciparum parazitik insan kırmızı kan hücreleri içinde protozoa. Böyle tam hücreli gözlemler genelde gereklidir ve önemlidir ve roman transkripsiyonel desenler 1 çözülmeye olabilir.

Diğer RNA FISH yöntemler 4-10 tarif edilmiş olmasına rağmen, P. eşzamanlı var mRNA'nın transkripsiyonunu çalışma için bir yeni ve rafine protokol geliştirilmesi için bir ihtiyaç vardır olmuştur falciparum. Tespit araçları olarak asRNA problar kullanılarak, mRNA aktivitesinin özel zamansal modelleri kolaylıkla hücrelerde lokalize edilebilir. Buna ek olarak, asRNA probları özgüllük 1 destekleyecek diğer deney sistemlerinde de kullanılabilir. Diğer crityeni bir protokol geliştirirken önemli ical parametrelerin tespiti ve hücrelerin permeabilzation içerir. Bu adımlar ampirik 5 diğer yazarlar tarafından önerilen gibi çeşitli kimyasal reaktifler test ederek belirlendi. Biz koagülant fiksatif asetik asit ile birlikte yavaş hareket çapraz bağlayıcı paraformaldehid birleştirerek biz doku morfolojisi iyi bir koruma elde sonucuna varıldı. Buna ek olarak, önceden bloke probları eklemeden önce hücreler benzer bir şekilde tanımlanan diğer RNA FISH protokolleri 5, gerekli olmadığını bulduk. Ayrıca, mevcut protokol de bu en aza indirerek, sonda ve çekirdeğin içine nüfuz ederler ve ER bağlı mRNA ile hibridleşmek için antikorlar için izin vermek üzere hafif yıkama sıvıları, düşük miktarlarda hafif bir proteaz (pepsin) ve kısa bir kuluçka süresi kullanmak zarlarında (Şekil 2a1-2A4) zarar.

Buna ek olarak, RNA FISH ve yüksek çözünürlükte görüntü camer tarafından oluşturulankonfokal mikroskop için ekli belirli bir hücre boyama veya pozitif olup olmadığını ortaya çıkarır ve ayrıca lekeli antisens RNA ve DAPI boyalı çekirdek arasındaki mekansal ilişkileri hakkında değerli bilgiler verir. Gibi şekil 2A4 yılında görüntülerde çözüldü, mRNA gibi bir DNA-FISH görüntü 11-12 beklenen, muhtemelen endoplazmik retikulumda değil, bunun üstüne nükleus, yanına takılacak görünüyor.

Tek hücre çalışmaları birçok parazit ve farklı zaman noktalarında gözlemler istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç elde etmek için gereklidir. Böylece, RNA FISH analizi tekniği kalibre sabır ve önemli deneme-yanılma deneme talep oldukça zaman alıcı bir tekniktir. RNA BALIK birçok parametre bir tekniktir olarak bu protokolün ana adımları bir sorun giderme rehberi Tablo 1'de verilmiştir.

Sorun Olası cause Tavsiye
Zayıf sinyal veya hiç sinyal
  • Düşük mRNA ekspresyonu.
  • bozulması mRNA.
  • Prob in verimli etiketli veya çok düşük konsantrasyonda düşer.
  • Çok yüksek hibridizasyon sıcaklığı.
  • Çok uzun pepsin tedavi.
  • Hücreler yeterli permeabilize değildir.
  • FACS tarafından protein ekspresyonu kontrol edin.
  • RNAse özgür koşullar altında çalışma ve sadece taze hazırlanmış çözümleri kullanın.
  • Jel üzerinde etiketli prob kalite kontrolü yapın ve etiketli bir kontrole RNA karşılaştırın. BALIK yılında prob konsantrasyon titrasyonu seri olun.
  • Hibridizasyon sıcaklığı kademeli olarak azaltın.
  • Pepsin tedavi süresini azaltın.
  • Pepsin Trea uzatmaktment uzunluğu veya başka deterjan deneyiniz.
Kötü hücresel koruma
  • Çok yüksek parasitaemia veya stresli parazitlerdir.
  • Çok kalın filmler.
  • Badly slaytlar temizlenmelidir.
  • Slaytlarda hücreleri deattached edilir.
  • % 10 altında parazitemi tutmak ve her gün hücre medya değiştirerek sağlıklı bir parazit kültürü kullanın.
  • Parazit kültürü seyreltin.
  • Alkol ile slaytlar temizleyin ve kuruması için slaytlar için en az 10 dakika bekleyin.
  • Kullanın taze para-formaldehit ve / hazırlanmış veya paraformaldehid kuluçka süresini artırır.
Yüksek Arkaplan
  • Çok yüksek prob konsantrasyonu.
  • Yetersiz yıkamaparazitler.
  • Shizonts Patlama.
  • Yetersiz yazılan hibridizasyon yıkama.
  • Engelleme tampon kirlenmiş veya verimsiz edilir.
  • BALIK yılında prob konsantrasyon titrasyonu seri olun.
  • Ince filmler hazırlamadan önce iki kez parazitler yıkayın.
  • Daha sıkı kültürü eşitleyin.
  • Yıkar numarası ve / veya uzunluğunu artırın.
  • Yeni engelleme tampon hazırlayın. Diğer engelleme reaktif, konsantrasyon deneyin veya engelleme süresinin uzatılması
RNaz tedavi kontrolü pozitif
  • Rnaz çözümü etkin değil.
  • Çok düşük RNaz konsantrasyonu.
  • Inkübasyon çok kısaydı.
  • Yeni bir solüsyonu hazırlayın Rnaztion.
  • Konsantrasyonu artırır. Bir titrasyon serisi olun.
  • RNAse tedavi dönemi Prolong.
Negatif kontrol Parazitlerin Yanlış pozitif algılama
  • Sonda spesifik değildir.
  • Parazitler prob tarafından algılanır mRNA ifade etmezler.
  • Probların özgüllüğü kontrol edin.
  • Kullanılan parazit hattı doğru olanıdır ve taze seçilmiş olduğunu kontrol edin.

Tablo 1. Troobleshooting rehberlik.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar mükemmel teknik yardım için parazit ve Christina Holm genotipleme için Michael Alifrangis ve Ulla Abildtrup teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Howard Hughes Tıp Enstitüsü (hibe 55005511), Lundbeck Vakfı (hibe R9-A840) tarafından ve Niels Bohr Vakfı tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
  2. Pinaud, R., Mello, C. V., Velho, T. A., Wynne, R. D., Tremere, L. A. Detection of two mRNA species at single-cell resolution by double-fluorescence in situ hybridization. Nat. Protoc. 3, 1370-1379 (2008).
  3. Cheeseborough, M. District Laboratory Practice in Tropical Countries. Cambridge University Press. Cambridge. (2006).
  4. Brolin, K. J., Ribacke, U., Nilsson, S., Ankarklev, J., Moll, K., Wahlgren, M., Chen, Q. Simultaneous transcription of duplicated var2csa gene copies in individual Plasmodium falciparum parasites. Genome Biol. 10, R117 (2009).
  5. Epp, C., Li, F., Howitt, C. A., Chookajorn, T., Deitsch, K. W. Chromatin associated sense and antisense noncoding RNAs are transcribed from the var gene family of virulence genes of the malaria parasite Plasmodium falciparum. RNA. 15, 116-127 (2009).
  6. Freitas-Junior, L. H., Hernandez-Rivas, R., Ralph, S. A., Montiel-Condado, D., Ruvalcaba-Salazar, O. K., Rojas-Meza, A. P. Telomeric heterochromatin propagation and histone acetylation control mutually exclusive expression of antigenic variation genes in malaria parasites. Cell. 121, 25-36 (2005).
  7. Obernosterer, G., Martinez, J., Alenius, M. Locked nucleic acid-based in situ detection of microRNAs in mouse tissue sections. Nature Protoc. 2, 1508-1514 (2007).
  8. Li, F., Sonbuchner, L., Kyes, S. A., Epp, C., Deitsch, K. W. Nuclear non-coding RNA are transcribed from the centromeres of Plasmodium falciparum and are associated with centromeric chromatin. J. Biol. Chem. 283, 5692-5698 (2008).
  9. Thompson, J., Sinden, R. E. In situ detection of Pbs21 mRNA during sexual development of Plasmodium berghei. Mol. Biochem. Parasitol. 68, 189-196 (1994).
  10. Thompson, J. In situ detection of RNA in blood- and mosquito-stage malaria parasites. Methods Mole Med. 72, 225-235 (2002).
  11. Arnot, D. E., Ronander, E., Bengtsson, D. C. The progression of the intra-erythrocytic cell cycle of Plasmodium falciparum and the role of the centriolar plaques in asynchronous mitotic division during schizogony. Int. J. Parasitol. 41, 71-80 (2011).
  12. Osborne, C. S., Chakalova, L., Brown, K. E., Carter, D., Horton, A., Debrand, E., Goyenechea, B., Mitchell, J. A., Lopes, S., Reik, W., Fraser, P. Active genes dynamically colocalize to shared sites of ongoing transcription. Nat. Genet. 36, 1065-1071 (2004).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please sign in or create an account.

    Usage Statistics