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RNAの蛍光による単一細胞遺伝子転写の解析

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Biology

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Summary

蛍光灯

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Ronander, E., Bengtsson, D. C., Joergensen, L., Jensen, A. T. R., Arnot, D. E. Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH). J. Vis. Exp. (68), e4073, doi:10.3791/4073 (2012).

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Abstract

マラリア感染時のヒト内皮受容体に熱帯熱マラリア原虫感染赤血球(IE)の接着 、var遺伝子によってコードされたPfEMP1タンパク質変異体の発現によって媒介される。

ハプロイドP.熱帯熱マラリア原虫のゲノムは1つだけですが、感染症の血液の段階で一度にセルごとに転写されると考えられていたそのうちの約60種類のvarの遺伝子を抱いている。 varの遺伝子転写のような相互に排他的な規制がどのように実現されるか、個々の遺伝子やvarの異なる受容体とPの臨床転帰の差動結合の結果に関連付けられているvarの遺伝子のサブグループの識別があるので、不明である熱帯熱マラリア原虫感染症。最近では、相互に排他的な転写のパラダイムは、個々のPに基づいて転写アッセイによって疑問に呼ばれてきたシングルinfに熱帯熱マラリア原虫の転写産物の同定Pの個々の核内寄生虫によるvarの遺伝子転写のin situハイブリダイゼーション(FISH)分析蛍光RNAを用いてected赤血球細胞熱帯熱マラリア原虫 、IE 1。

ここでは、Pの単核 var遺伝子転写の解析のためのRNA-FISH法を実施するための詳細なプロトコルを提示熱帯熱マラリア原虫は、ヒト赤血球に感染した。方法はジゴキシゲニンとTSA Plusの蛍光パレットシステム2(パーキンエルマー)、顕微鏡分析と新たに選択されたPを使用してビオチン標識アンチセンスRNAプローブの使用に基づいています熱帯熱マラリア原虫のIE。 in situハイブリダイゼーション法Pのさまざまな段階で発現している遺伝子の多様性の転写および規制を監視するために使用することができます熱帯熱マラリア原虫のライフサイクルとは、他のマラリア原虫種と他の生物や細胞のタイプに適応可能です。

Protocol

1。たての選択感染赤血球の生成

PfEMP1タンパク質の表面発現のために新たに選択したカルチャを使用しているときは、このアッセイのために、最良の結果が得られる。この特定の実験3D7 Pにおける熱帯熱マラリア原虫の系統は、前述の1と特異的な抗体を用いて選択した。

1日目

  1. Pから満員の血液細胞の収穫を200μl 熱帯熱マラリア原虫の培養は室温で8分間800×gで遠心分離することにより2から5パーセント後期IEを含む。
  2. 37 2mlの血液ペレットを再懸℃の暖かい0.75パーセントゼラチン14ミリリットル滅菌チューブ内の溶液、土砂に感染していないとリングステージIEを可能にするために37℃で15〜20分放置します。
  3. 後期IEを収穫、新しい14 mlチューブに、上相、 すなわち 、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。
  4. 特異的な抗PfEMP50μlの希釈37℃暖かいRBC-ウォッシュメディアおよび滅菌フィルタ2ml中1抗体。
  5. 37℃で30分間、14ミリリットル滅菌チューブとインキュベートし、穏やかに攪拌しながらCの滅菌希釈血清で洗浄後期IEを混ぜる。
  6. 室温で8分間800 xgでスピンダウンして、37℃の温かいRBC-ウォッシュメディアの10mlで2回洗浄する。
  7. DynaMaq-15磁石を使用してRBC-ウォッシュメディアとサスペンション倍Dynabeadタンパク質の50μlを洗います。
  8. 300μlのRBC-ウォッシュメディアでのDynabeadsを再懸濁し、洗浄された後期のIEに追加します。穏やかに撹拌しながら37℃で30分間インキュベートします。
  9. DynaMaq-15磁石にチューブを転送します。 1〜2分放置し、すべての液体を除去。
  10. RBC-ウォッシュメディアの4-5 mlのダイナビーズを再懸濁します。磁石の上に戻ってチューブを転送し、すべての液体を除去する前に、1〜2分間放置します。一度洗浄工程を繰り返します。
  11. 25cm 2の無菌培養fに洗浄したビーズを転送200μlの新鮮な濃厚赤血球を含むラスク。文化にAlbumaxメディアの5-6 mlを加える。 37℃、5%CO 2℃で一晩保存する

2日目

  1. 選択されたIEが14ミリリットル滅菌チューブにすべての文化を転送することによって、新鮮な赤血球をreinvadedた培養液からのDynabeadsを削除します。 DynaMaq-15磁石の上にチューブを入れて、1〜2分間放置します。その後、培養フラスコに、すべての液体の背中を注ぐ。
  2. 5-10%の寄生虫血症まで、できるだけ少ないサイクルの文化や寄生虫はringstageにあります。
  3. IEが正しい表面表現型、どちらPFD1235wのand/orPF11_0008 すなわちタンパク質の発現は1が得られいることを確認するために、FACSによって分析されるべきである。

2。プローブの調製

アンチセンスRNAプローブはPFD1235wとPF11_0008 varのほとんどの可変領域から生成された<Pから/ em>の遺伝子熱帯熱マラリア原虫 3D7ゲノムDNA。 DNAは、製造元の説明(Roche社)によると、それぞれPCRで増幅し、転写のためpSPT18または19ベクターにクローニングした。プローブ(580塩基対(bp)で、長さは590 bp)をそれぞれDIG RNAラベリングキットまたはビオチンRNA標識ミックスを使用して、ジゴキシゲニン(DIG)またはビオチンで標識した。我々は両方のノーザンブロット分析により、単一ラベルのFISH解析1によるプローブの特異性を確認した。

3。 in situハイブリダイゼーションの前に寄生虫の薄層塗抹標本および固定

1日目

すべての手順は、RNaseフリーの環境で実行されて、すべての試薬はRNaseフリーまたはジエチルピロカーボネート(DEPC)またはRNase ZAP(Invitrogen)を用いて前処理されています。スライドとカバースリップ残留製造グリースを除去するためにアルコールで洗浄してください。ステップ間で途切れることなく、プロトコルを実行することが重要ですヌクレアーゼの混入の危険性を最小にするために。

  1. 標準拡散法3により細い血管映画を作る。顕微鏡の100倍の油浸対物レンズを使用して、IEを数え、文化の中でIEの割合を計算する。寄生虫段がリングとIEサイクルの早期栄養体段階で、おおよその同期であることを確認します。これらは、事前に複製、単核生成段階、発現しているvarの遺伝子のmRNAとこのタイプの単一細胞のFISH転写アッセイに適しています。
  2. 1.5ミリリットルRNaseフリーのエッペンドルフチュー​​ブに、5〜10%の寄生虫で、原虫の培養液50μlを転送します。室温で2,000 rpmで1分間遠心します。
  3. メディアを取り出し、DEPC処理水に50μlのPBSのpHは7.2を追加します。優しくチューブを攪拌。メディアや細胞の破片から遊離細胞を洗浄するために二回遠心沈降ステップを繰り返します。
  4. 4良質薄い塗抹標本を作成します。各スメアについては、上に1スミアを作るよくRNaseフリーフードで合計4ウェルスライド、 すなわち 4スライドガラス、( 重要なステップ )のいずれか11ミリメートルの直径。波は乾燥するために空気中に簡単にスライドします。特定のプローブ、RNase処理のために別のスライドと、目的の遺伝子を発現していないIEを含む3枚目のスライドを使用して、他の無関係な遺伝子のための単一のプローブ染色に陰性コントロール-1のスライドの3つの余分なスライドを作成した。 10〜20分間ベンチに乾燥するスライドのままにしておきます。
  5. ウェルに4%パラホルムアルデヒド、5%氷酢酸を含む固定液の60μlを添加して薄膜を修正します。室温でベンチで10分間のままにしておきます。
  6. 室温で穏やかに撹拌して5分間2×SSPEバッファでスライドを洗浄します。簡単に言えばティッシュペーパーで軽く細胞を含むウェルに触れることにより、過剰な液体を除去。
  7. 37℃( 非常に重要なステップで2分間、0.01M HCl中で0.01%のペプシンでスライドをカバー)。室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄します。
  8. 10μg/ mlの最終濃度までのRNase溶液を希釈。のRNase溶液60μlをネガティブコントロールスメアをカバーしています。 37℃で30分間インキュベートした後、室温で5分間、2×SSPEでスライドを洗浄してください。
  9. ハイブリダイゼーション工程に即座に進みます。

4。固定スライドへのRNAプローブのハイブリダイゼーション

1日目

  1. そのようなThermoStar 100 HC4またはRNaseザップを噴霧し、それはティッシュペーパーできれいに拭いて、クリーンオーブンに入れて空のピペットチップボックスとしてハイブリダイゼーションチャンバーを準備します。スライドはハイブリダイゼーション中に乾燥しないことを確認するためにハイブリダイゼーションチャンバーまたはDEPC処理水でボックスの下部のチャンネルを埋める。 48にチャンバーと予熱を閉じ℃に
  2. 12 ng /μlに、最終濃度のハイブリダイゼーション溶液中にプローブを薄める。加熱ブロック中で5分間65℃プローブ溶液°Cを変性。直ちに氷上で冷却する。
  3. 簡単に言えば空気は2x SSPEの洗浄された後はスライドを乾燥させてください。慎重にティッシュペーパーで井戸の周り過剰な液体を除去。
  4. ハイブリダイゼーションチャンバを開き、チャンバー内でスライドを配置します。 1またはウェルあたり60μlの総体積で両方のプローブを適用します。慎重に滅菌ピンセットを使用してRNaseフリーカバースリップで液滴をカバーしています。
  5. チャンバーを閉じて、一晩、少なくとも16時間48℃でスライドをハイブリダイズする。

5。抗体結合と蛍光増幅

2日目

次の手順は、パーキンエルマーから、TSAプラス蛍光パレットシステムに基づいています。すべてのステップは室温で行われています。

  1. 穏やかに攪拌しながら5分間スライドをTNT緩衝液で3回洗浄する。
  2. 30分間TNBバッファー150μlのウェルをブロック。
  3. 1:500の割合で、TNBバッファーで1:100の割合でTNBのバッファ内のHRP-結合のα-DIG抗体とHRP標識α-ビオチン抗体を希釈します。ティッシュペーパーを使用してスライドから余分TNBバッファを削除します。同時に2つの転写物を検出した場合、両方の抗体が一度行くことができます。ウェル当たり抗体-TNB溶液を100μlの合計額を適用し、慎重にカバースリップで覆う。 2時間スライドをインキュベートする。
  4. 慎重にカバースリップを取り外します。 5分間3回のTNT緩衝液中でスライドを洗浄します。
  5. 1:500の割合でチラミド増幅試薬には、FITC蛍光体を希釈し、各ウェルに溶液100μlを適用します。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。
  6. 慎重に滑ると穏やかに攪拌することにより、TNTのバッファーで5分間スライドを3回洗ってカバーを外します。
  7. 1:500の割合でチラミド増幅試薬でCyan3 - フルオロフォアを希釈します。当たり100μlを加えこのソリューションの井戸。カバースリップでウェルをカバーし、12分間インキュベートする。
  8. TNTのバッファ内に浸漬することにより素早くスライドを注意深くリンスしてからカバーガラスを外します。
  9. 5分間のTNT緩衝液を用いてスライドを3回洗浄します。
  10. DEPC処理水にすばやくスライドを浸す。
  11. 空気乾燥したスライドを残す。 DAPIを含む抗退色試薬でスライドをマウントします。マニキュアでカバースリップの四隅をシールします。
  12. スライドは現在、顕微鏡検査のための準備が整いました。実験は次の日に完成しなければならないならば4でアルミホイルや店舗で覆われたスライド℃で保管してください。スライドの側面の完全な密封は、抗フェード試薬を適用した24時間後に行うことができる。これはプロトコルが完了した後、スライドを1週間用に撮像することができるようになります。

6。ハイブリダイズしたプローブの可視化

  1. 顕微鏡の電源をオンにします。標準免疫蛍光顕微鏡はsufficです実験のこの種のientが、あなたはまた、3D映像のためにこれを使用するか、またはあなたの染色された細胞のビデオを得るために共焦点顕微鏡へのアクセスを持っている場合。顕微鏡は、15〜30分間ウォームアップしてください。コンピュータとソフトウェアのスイッチをオンにします。
  2. 免疫蛍光顕微鏡で染色の品質を確認してください。少数の寄生虫を含むスポットを選択してください。
  3. 手動で各レーザのゲインを調整します。ピクセルは4-6 M -1 s -1で 、512×512ピクセルへのステップに住む調整します。
  4. フレームラムダを使用してテスト撮影してください。レーザーゲインを再調整します。
  5. 蛍光単一細胞の20良い写真の最小値を取る。 5月20日の寄生虫を含むフィールドの少なくとも2月5日の画像は正寄生虫の割合の公正な概観を得るために必要とされている。

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Representative Results

図1に、主な手順やRNA FISH法の持続時間を示すフローチャートである。

シングルPを使用してよく、不十分保存ステンドmRNAのFISH実験の代表的な一連の画像熱帯熱マラリア原虫のIEを図2に示します。この細胞内原虫はDAPIで青色に染色されている小さな(1〜1.5μmの直径)は核を持っています。二十四時間Pの赤血球侵入後熱帯熱マラリア原虫増員生殖、 すなわち核分裂のプロセスが開始されます。 varの遺伝子転写の最適なFISHの検出は、この48時間内赤血球溶菌サイクルに10から22の周りの時間で行われます。プローブは、一般おそらく核膜関連小胞体であるもので、主要な核体の隣に表示され種をmRNAにハイブリダイズする。行の良い品質の画像を表示、FITC(緑)とCyan3-(赤)PFD1235wとPに対応する標識プローブダブル選ばPにおけるそれぞれF11_0008 varの遺伝子、 熱帯熱マラリア原虫サブライン、3D7 PFD1235w/PF11_0008。遺伝子の共局在が明らかしかし絶対ではありません。行Bのどちらか劣化しているか、大部分はvarの mRNAを転写やん寄生虫に両方のプローブの貧弱なハイブリダイゼーションを示す。 C列には、良い魚ハイブリダイゼーションが得られますが、ひどく広がりや寄生虫を集約することによって示されるように、細胞の保存は、貧弱です。

図1
図1。 RNA FISH実験フローチャートフローチャートは、魚の手順の主なポイントとタイミングを示しています。

図2
図2二重選択PにおけるRNA-FISHの共焦点画像による同時MRを示す熱帯熱マラリア原虫FITC(緑)またはCyan3(赤)信号のいずれかで標識された二つの異なるVARのNA遺伝子の転写。 DAPI染色(青)は寄生虫核DNAを示しています。縦の列A1、B1、C1は寄生虫の透過画像を表示します。スケールバーは5μm。

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Discussion

のRNA FISH分析は、例えば、ノーザンブロットおよびRT-PCRなどの方法とは対照的に、単一細胞レベルで特定のmRNA転写物の識別を可能にします。これにより、P.、この例では、転写活性および不活性細胞を区別することができ寄生原虫は、ヒト赤血球内原虫。このような全細胞の観察はしばしば必要であり、重要かつ新規な転写パターン1を解明することがあります。

他のRNA FISH法は4月10日に記載されいるが、Pの同時varの mRNAの転写の研究のための新しい、洗練されたプロトコルの開発が望まれてい熱帯熱マラリア 。検出ツールとしてasRNAプローブを使用することにより、mRNAの活動の特殊な空間パターンは容易に細胞に局在することができます。また、asRNAプローブはその特異性1をサポートする他の実験系でも使用することができます。他のクリティカル新しいプロトコルを開発する際に重要であるiCalのパラメータは、細胞の固定とpermeabilzationが含まれています。これらの手順は、経験的に5他の著者によって提案されるように様々な化学試薬をテストすることによって定義されていました。私たちは、凝固剤固定酢酸と一緒に遅効性のクロスリンカーホルムアルデヒドを組み合わせることにより、我々は組織形態の良好な保存を得ることができたと結論づけた。加えて、我々は事前にブロッキングプローブを追加する前に細胞が同様に他の記載のRNA FISHプロトコル5に、必要ではなかったことが分かった。また、本プロトコルでは、我々は最小限に、プローブと核内に拡散し、小胞体に付着したmRNAとハイブリダイズする抗体を可能にするために穏やかな洗浄、少量で軽度のプロテアーゼ(ペプシン)と短い潜伏期間を使用周囲の膜(図2A1-2A4)が破損する恐れがあります。

また、RNAの魚や高解像度の画像はcamerによって生成された共焦点顕微鏡に取り付けられた特定の細胞が染色陽性であるかどうかを明らかにし、またステンドアンチセンスRNAおよびDAPI染色された核の間の空間的関係に関する貴重な情報を得ることができます。図2A4の画像で解決、mRNAは、おそらく小胞体ではなく、その上に、核の横に取り付けられるように、DNA-FISHの画像11月12日に予想されます。

単一細胞の研究では、多数の寄生虫と異なる時点での観測は統計的に有意な結果を得るために必要です。したがって、RNAのFISH解析のテクニックを校正するために忍耐とかなりの試行錯誤の実験を要求するという時間のかかる技法です。 RNAの魚は多くのパラメータのテクニックであるように、このプロトコルの主なステップに、トラブルシューティングガイドを表1に示す。

問題 可能CAUSE 勧告
弱い信号または信号なし
  • 低いmRNA発現。
  • 劣化のmRNA。
  • プローブは標識または濃度であまりにも低効率で、劣化している。
  • 高すぎるハイブリダイゼーション温度。
  • 長すぎるペプシン処理。
  • 細胞が十分に透過処理されていません。
  • FACSによるタンパク質の発現を確認してください。
  • アーゼフリー条件の下で働くとだけ作りたてのソリューションを使用しています。
  • ゲル上の標識プローブの品質チェックを行い、ラベルの付いたコントロールRNAと比較します。魚類におけるプローブ濃度の滴シリーズを作る。
  • ハイブリダイゼーションの温度を段階的に減らすことができます。
  • ペプシン処理長さを短くします。
  • ペプシンtreaを延ばすtment長または別の洗剤を試してみてください。
悪い細胞の保全
  • 高すぎる原虫やストレス寄生虫。
  • あまりに厚いフィルム。
  • ひどくスライドを掃除した。
  • スライド上の細胞をdeattachedされています。
  • 10%以下で、寄生虫を保ち、毎日細胞培地を変更することにより、健全な寄生虫文化を使用します。
  • 寄生虫文化を希釈します。
  • アルコールでスライドをきれいにし、乾燥させるスライドのために少なくとも10分待ちます。
  • 使いたてのパラホルムアルデヒドおよび/またはホルムアルデヒドを準備し、インキュベーションを長くしてください。
高いバックグラウンド
  • 高すぎるプローブ濃度。
  • の不十分な洗浄は、寄生虫。
  • shizontsを破裂。
  • 不十分ポストハイブリダイゼーション洗浄。
  • ブロッキング緩衝液が汚れているか、または非効率的です。
  • 魚類におけるプローブ濃度の滴シリーズを作る。
  • 薄膜を準備する前に二回寄生虫を洗ってください。
  • もっとしっかりと文化を同期します。
  • 洗浄の回数および/または長さを増やしてください。
  • 新しいブロッキングバッファーを準備します。他のブロッキング試薬、濃度を試すまたはブロッキング期間を延長
アーゼ処理したコントロールは正である
  • RNaseのソリューションは、非アクティブになっています。
  • 低すぎるのRNase濃度。
  • インキュベーションが短すぎた。
  • 新しいRNアーゼソリューションを準備る。
  • 濃度を上げてください。滴シリーズを作る。
  • RNase処理期間を延長。
ネガティブコントロール寄生虫の誤検知
  • プローブは、固有のものではありません。
  • 寄生虫は、プローブによって検出したmRNAを発現していない。
  • プローブの特異性を確認してください。
  • 使用寄生虫ラインが正しいものであると新たに選択したことを確認してください。

表1。Troobleshootingガイダンス。

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Disclosures

特別な利害関係は宣言されません。

Acknowledgments

著者らは、優れた技術支援のために寄生虫やクリスティーナ·ホルムの遺伝子型のマイケルAlifrangisとウラAbildtrupに感謝したいと思います。この作品はハワードヒューズ医学研究所(助成55005511)、ルンドベック財団(助成R9-A840)およびニールス·ボーア財団によって資金を供給された。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Acetic Acid Sigma/Aldrich 338826-100ml
Albumax media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640
5 ml glutamine solution
Albumax media: Gentamycin sulphate Albumax-solution Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
50 ml Albumax-solution
Albumax-solution: Hypoxanthine Sigma-Aldrich H9377 0.8 g Hypoxanthine
Albumax-solution: AlbuMAX II Invitrogen 11021-037 200 g Albumax
Albumax-solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 4 liter RPMI 1640
Dissolve with magnet at max. 50 °C. Filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Amberlite Sigma A5710-110G Resin to deionize formamide.
Anti-biotin goat pAb Peroxidase Conjugate Calbiochem 203206
Anti-Dig antibody Novus biologicals NB100-41330
Anti-fade reagent with DAPI Invitrogen P36931 The mounting media has to cure for 24 hr before sealing the slide completely.
Biotin RNA Labeling Mix Roche 11685597910
Camera digital Nikon digital sight DC-F11
Coverslips Menzel-glaser 631-1570
culture flask 25 cm2 Nunclon surface Nunc 156340
DEPC Fluka/Sigma 32490-100ml 1 ml DEPC in 1000 ml deinonized water. Add a stir bar and stir for 12 hr. Autoclave for 30 min.
Digital camera Nikon digital sight DC-F11
Dynabeads Protein A Invitrogen 10002D
DynaMaq-15 Magnet Invitrogen 123-01D
Formamide bioultra 99 % Fluka/Sigma 47671-1l-F Deionized formamide: 5 g of ion exchange resin per 100 ml of formamide. Stir 30 min. Filter through Whatman paper.
Gelatine 0.75% solution: Gelatine Sigma-Aldrich G2500 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Gelatine 0.75% solution: RPMI 1640 Lonza BE12-115F 3.75 g gelatine in 500 ml RPMI 1640. Heat to 56 °C to dissolve. Filter sterilize when 56 °C. Store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: L-glutamin Sigma-Aldrich G3126 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Glutamine solution: HCl Sigma H1758 14.6 g L glutamine in 500 ml 0.9 % NaCl. Dissolve, filter sterilize and store at -20 °C in aliquots.
Hybridization solution: Formamide Bio ultra 99% SSC 20x Fluka/Sigma 47671-1l-F Total 20 ml, keep frozen at -20 °C in aliquots
10 ml deionized formamide
Hybridization solution: Denhardt's 50x concentrate Sigma D2532 5 ml 20xSSC
Hybridization solution: Yeast tRNARoche blocking reagent Sigma R-6750 2 ml 50x Denhardt's
250 μl 20 mg per ml yeast tRNA
Hybridization solution: Salmon sperm DNA Fluka/Sigma 31149-106GF 0.4 g Roche blocking reagent
1 ml of 10 mg per ml salmon sperm DNA (Critical: denature salmon spermDNA at 96 °C for 5 min before adding to the hybridization solution)
Hybridizer ThermoStar 100 HC4 Quantifoil Instruments GmbH 1004-0011 Can be replaced by hybridization oven and RNase free hybridization chambers padded with DEPC water.
Immersion oil UV transparent fluorescence free Sigma 10976-1EA
Immunofluorescence or confocal microscope Nikon D-Eclipse TE2000C
Nailpolish Available in any drugstore
PBS 20x:NaCl
KCl
Na2HPO4 x 2H2O
KH2PO4 DEPC deionized H2O
Ajust pH to 7.4
160 g
4 g
23 g
4 g
1 l
Paraformaldehyde 4 % Fluka/chemika 76240 4 g PFA in 80 ml PBS/DEPC. Heat to 65 °C until the PFA dissolves. Add 20 ml PBS, allow the solution to cool. Adjust the pH to 7.4. Filter. Store in aliquots at -20 °C.
Paraformaldehyde 4 %/ Acid acetic 5 % 950 μl paraformaldhyde + 50 μl Acetic acid
Pepsin Sigma/Aldrich P7000
Peroxidase-conjugated anti-biotin Calbiochem 203206
RBC-wash media: RPMI 1640 Glutamine solution Lonza BE12-115F 500 ml RPMI 1640 5 ml glutamine solution
RBC-wash media: Gentamycin sulfate Lonza BE02-012E 2.5 ml gentamycin sulphate
RNase Sigma/Aldrich Make a 10 mg/ml stock solution.
RNase free 1.5 ml tube Ambion AM12450
RNase Zap Ambion AM9780
Slides 4 wells 11 mm Thermo Scientific MENZXER306W
SSC 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSC 20x: Sodium citrate dehydrate Sigma/aldrich W302600 3 M NaCl (175 g/l) 0.3M Na3 citrate x H2O (88 g/l) Adjust to pH 7.0 with 1M HCl
SSPE 20x: NaCl Sigma/Aldrich S9625 175.3 g NaCl
SSPE 20x: NaH2PO4 Sigma/Aldrich S0751 27.6 g NaH2PO4.
SSPE 20x:4 EDTA powder 9.4 g EDTA powder
Add DEPC water, adjust pH 7.4. Autoclave for 20 min
TNB buffer: TNT buffer 10 ml TNT buffer
TNB buffer: Blocking reagent 0.05 g Blocking reagent
To dissolve the blocking reagent, heat the solution to 60 °C for one hour with stirring. Store at -20 °C. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TNT buffer: Tris/HCl Sigma T1503 1M Tris/HCl, pH 8.0
TNT buffer: NaCl Sigma Aldrich S9625 100 ml
TNT buffer: Tween20 Sigma 93773 5 M NaCl 30 ml
1 ml DEPC dH2O 869 Ml
Adjust pH to 7.5 at room temperature. (Derived from the Perkin Elmer TSA-protocol.)
TSA plus Cyanine3/ Fluorescein system Perkin Elmer NEL753000IKT Read the protocol from the TSA Plus Fluorescence Palette System carefully before starting the experiment.
Tubes 14 ml sterile Almeco - CM LAB Aps 91016

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References

  1. Joergensen, L., Bengtsson, D. C., Bengtsson, A., Ronander, E., Berger, S. S., Turner, L., Dalgaard, M. B., Cham, G. K., Victor, M. E., Lavstsen, T., Theander, T. G., Arnot, D. E., Jensen, A. T. Surface co-expression of two different PfEMP1 antigens on single Plasmodium falciparum-infected erythrocytes facilitates binding to ICAM1 and PECAM1. PLoS Pathog. 2, 1001083 (2010).
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