संयंत्र कोशिका दीवार पॉलिमर माइक्रोएरे का उपयोग कर के glycan रूपरेखा

Published 12/17/2012
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Biology

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Moller, I. E., Pettolino, F. A., Hart, C., Lampugnani, E. R., Willats, W. G., Bacic, A. Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays . J. Vis. Exp. (70), e4238, doi:10.3791/4238 (2012).

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Abstract

Protocol

1. ऊतक संग्रह और तैयारी

  1. संयंत्र के ऊतकों के 100 मिलीग्राम ताजा वजन (10 मिलीग्राम सूखी वजन की एक न्यूनतम) ब्याज की प्रत्येक ऊतक के लिए कम से कम तीन प्रतियों में ले लीजिए. निम्नलिखित कदम वनस्पति ऊतकों से कोशिका दीवार सामग्री की तैयारी का वर्णन करता है. भंडारण के ऊतकों के मामले में, संयुक्त राष्ट्र वांछित स्टार्च enzymatically कोशिका दीवार पॉलिमर की निकासी के साथ आगे बढ़ने के रूप में पहले 13 वर्णित से पहले हटा दिया है.
  2. तरल नाइट्रोजन के साथ एक ठीक पाउडर एक Qiagen TissueLyser द्वितीय 24 ट्यूब अनुकूलक सेट और 3 मिमी tungsten कार्बाइड मोती (30 हर्ट्ज, 2 x 30 सेकंड) के साथ, नमूने homogenize. वैकल्पिक रूप से अगर केवल कुछ नमूने संसाधित किया जा रहा है, एक मोर्टार और मूसल में प्रयोग किया जाता है.
  3. 10 मिलीलीटर प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब में homogenates स्थानांतरण.
  4. 10 मिलीलीटर आरटी पर 80% v / v इथेनॉल में homogenates धोने और 2 मिनट के लिए सख्ती vortexing कोशिका दीवार सामग्री तैयार है.
  5. 3500 XG पर नमूने अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला त्यागने. दोहराएँ 70% इथेनॉल कम से कम तीन बार या washes जब तक तैरनेवाला क्लोरोफिल युक्त ऊतकों के लिए विशेष रूप से स्पष्ट है.
  6. प्रदर्शन 100% एसीटोन के साथ एक अंतिम धोने और हवा शुष्क शराब अघुलनशील Residues (एआईआर) रातोंरात युक्त छर्रों छोड़.
  7. एक 0.4 मिमी 2 के लिए एक ठीक है, समरूप पाउडर को प्राप्त करने के लिए और बड़े निकालने के लिए, खराब जमीन कण जो कुछ समय homogenate के में रहते हैं जाल के साथ हवा के नमूनों. चलनी
  8. , एक 3 मिमी ग्लास मनका युक्त नमूनों का मिश्रण सहायता microtubes प्रत्येक में 10 मिलीग्राम आकाशवाणी नमूना वजन.

2. कोशिका दीवार glycans के निष्कर्षण

  1. प्रत्येक नमूने के 50 सुक्ष्ममापी CDTA (7.5 पीएच) के 500 μl जोड़कर, Pectins और पॉलिमर pectins साथ जुड़े नमूनों से निकाले जाते हैं.
  2. संक्षेप में भंवर ट्यूब को सुनिश्चित करने के लिए विलायक नमूना सामग्री के साथ संपर्क में है और फिर 3 घंटे के लिए 8 हर्ट्ज पर TissueLyser का उपयोग कर मिश्रण.
  3. 12,000 XG पर नमूने ध्यान अपकेंद्रित्र, r4 डिग्री सेल्सियस और supernatants दुकान emove
  4. De-ionized पानी की 1 मिलीग्राम कमजोर और किसी भी शेष विलायक है, और 13,000 x छ भंवर अपकेंद्रित्र को दूर करने में छर्रों धो लें. गोली को परेशान करने के बिना इस चरण को दोहराएँ और ट्यूब से अगले कदम के लिए आगे बढ़ने से पहले सभी तरल निकालने.
  5. पार से जोड़ने glycans sequentially 4M NaOH के 500 μl के साथ कर रहे हैं शेष सेल दीवार गोली से 0.1% के साथ निकाले w / NaBH4 वी, एक ही 2.1 चरणों में वर्णित प्रक्रिया का उपयोग कर - CDTA निकासी के लिए 2.4. 4 NaBH एक शराब जिससे polysaccharides के छीलने आधार को रोकने के लिए (या keto) polysaccharides के कम अंत में एल्डिहाइड समूह को कम करने के लिए जोड़ा गया है.
  6. Centrifugation के बाद, फिर से supernatants हटा रहे हैं 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत और छर्रों de-ionized पानी में अगले निकासी के लिए आगे बढ़ने से पहले दो बार धोया.
  7. वैकल्पिक कदम के रूप ऐसे सेलूलोज़ रूप में अवशिष्ट पॉलिमर, 500 μl cadoxen (31% v / v 1,2 diami से निकाले जाते हैं0.78 एम CDO के साथ noethane) एक ही प्रक्रिया का उपयोग कर के रूप में 2.1 चरणों में वर्णित - 2.4. वैकल्पिक रूप से, शेष छर्रों में पूर्ण cellulosic सामग्री एसिटिक / नाइट्रिक assays (चर्चा देखें) का उपयोग निर्धारित किया जा सकता है.

3. मुद्रण माइक्रोएरे

  1. अपकेंद्रित्र supernatants 13,000 XG पर सेल दीवार पॉलिमर निकाले किसी भी मामला particulate हटाने वाले.
  2. एक अच्छी तरह से 384 microtiter प्लेट का उपयोग कर एक पूर्व डिजाइन कस्टम लेआउट जहां ऊतक प्रकार और निकासी प्रकार के अनुसार नमूने की व्यवस्था कर रहे हैं polypropylene में प्रत्येक नमूने के 50 μl लोड.
  3. विआयनीकृत पानी के साथ एक 5 0, और 25 × धारावाहिक कमजोर पड़ने श्रृंखला में सेल दीवार बहुलक नमूना पतला.
  4. पिन ऊंचाई, संग्रह और समय ध्यान केन्द्रित करना, और कपड़े धोने के कदम के रूप में इस तरह के मानकों microarrayer को नियंत्रित सॉफ्टवेयर पर स्थापित कर रहे हैं.
  5. मुद्रण कक्ष की नमी 60% पर नियंत्रित किया जाता नमूना वाष्पीकरण को रोकने के.
  6. छपाई का काम LabNEXT softwa का उपयोग शुरू कर दिया हैफिर और एक कार्यक्रम है जो माइक्रोएरे लेआउट से मेल खाती है.
  7. रोबोट केशिका चैनल पिन का उपयोग करता है 20 x 20 सेमी nitrocellulose झिल्ली जो मशीन में एक फ्लैट प्लेट से जुड़ा हुआ है पर नमूना थाली से समाधान मुद्रित. सरणी पर हर जगह 15 nl का समाधान होते हैं और तीन प्रतियों में मुद्रित है.
  8. समान प्रोटीन एक दूसरे के बगल झिल्ली और व्यक्तिगत सरणियों में कटौती पर मुद्रित कर रहे हैं के बाद प्रिंट काम पूरा हो गया है.
  9. प्रत्येक प्रयोग में arrays क्रम में कम या ज्यादा नमूने, dilutions या replicates को समायोजित करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

4. Glycan माइक्रोएरे की जांच

  1. मुद्रण के बाद, 5% में व्यक्ति प्रोटीन को ब्लॉक w / v स्किम्ड दूध पाउडर फॉस्फेट में भंग खारा buffered (mpbs) 2 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर गैर विशिष्ट बंधन को कम.
  2. मोनोक्लोनल mpbs में 2 घंटे के लिए सेल दीवार glycan epitopes के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ जांच प्रोटीन. मोनोक्लोनल antib के बहुमतकोशिका दीवार glycans खिलाफ odies वाणिज्यिक तीन कंपनियों से उपलब्ध हैं, (Biosupplies www.biosupplies.com.au ), Carbosource सेवा ( www.carbosource.net ) और PlantProbes ( www.plantprobes.net ).
  3. एक नकारात्मक नियंत्रण, एक ही mpbs और कोई प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ incubated माइक्रोएरे शामिल.
  4. प्रोटीन धोने के फॉस्फेट में 3 बार खारा (पीबीएस) buffered 5 मिनट के लिए गैर विशिष्ट बंधन को हटाने.
  5. माध्यमिक 2 घंटा के लिए mpbs में हॉर्सरैडिश peroxidase (एचआरपी) संयुग्मित एंटीबॉडी के साथ प्रोटीन की जांच. कोशिका दीवार glycans के खिलाफ हाल मोनोक्लोनल एंटीबॉडी विरोधी माउस या विरोधी चूहा माध्यमिक एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है.
  6. गैर विशिष्ट बंधन को दूर करने के लिए 5 मिनट के लिए धोने PBS बफर के साथ 3 बार चरणों को दोहराएँ.
  7. (3,3 Diaminobenzidine) वर्णजनीय या chemil का उपयोग प्रोटीन का विकासuminecent substrates (luminol).

5. मात्रा का ठहराव

  1. विकास के बाद, व्यक्तिगत प्रोटीन का उपयोग कर एक (1200 डीपीआई) डेस्कटॉप स्कैनर उच्च संकल्प स्कैन और नकारात्मक, 16-bit झगड़ा फ़ाइलें (चित्रा 3) के रूप में छवियों को बचाने.
  2. प्रत्येक छवि प्रसंस्करण (LabNEXT) सॉफ्टवेयर एक स्वचालित ग्रिड उपकरण के साथ लगे Xplore स्थान का उपयोग कर के अभिन्न तीव्रता की गणना. अभिन्न जगह तीव्रता ग्रिड हर जगह के आसपास के क्षेत्र में पिक्सल के योग से प्राप्त होती है.
  3. प्रत्येक माइक्रोएरे के लिए ग्रिड डेटा एक txt फ़ाइल के रूप में निर्यात किया जाता है और स्वयं के विश्लेषण के लिए एक एक्सेल स्प्रेडशीट में आयात किया जा सकता है. एक ऑनलाइन उपकरण ( http://microarray.plantcell.unimelb.edu.au/ ) स्वचालित रूप से अनुवाद करने के लिए और व्यक्तिगत txt फ़ाइलें से डेटा की प्रक्रिया करने के लिए विकसित किया गया है.
  4. अभिन्न हाजिर तीव्रता मुद्रण replicates भर में औसत निकाला जाता है और लिए एक 'मतलब हाजिर प्राप्त dilutionsप्रत्येक नमूने के लिए 'तीव्रता मूल्य (2 चित्रा). वैकल्पिक रूप से, सिर्फ एक सरणी पर कमजोर पड़ने मूल्य के लिए इसी स्थान संकेतों प्रत्येक नमूने के लिए रिश्तेदार glycan मिलान बहुतायत यों के लिए किया जाता है.
  5. रिश्तेदार विभिन्न नमूनों के बीच का मतलब हाजिर तीव्रता (4 चित्रा) heatmap एक्सेल या ऑनलाइन heatmapper उपकरण (सशर्त स्वरूपण का उपयोग कर के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं http://bar.utoronto.ca/welcome.htm ). प्रत्येक एंटीबॉडी प्रकार के लिए डेटा 100 के लिए सही है और एक 5% cutoff मूल्य पृष्ठभूमि संकेत और झूठी सकारात्मक को दूर करने के लिए लगाया गया है.

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Representative Results

निकोटियाना alata फूलों से छह प्रकार के ऊतकों (filaments anther, पराग, अंडाशय, पंखुड़ी, sepals और कलंक) में glycans की रिश्तेदार बहुतायत CoMPP का उपयोग निर्धारित किया गया था. चित्रा 3A एक प्रतिनिधि माइक्रोएरे है कि आंशिक रूप से (कम) methylesterified (पारा) homogalacturonan एक मिलान pectic 14 polysaccharides पर होता JIM5 विशिष्ट MAB के साथ किया गया है की जांच से पता चलता है. एपीटोप JIM5 सभी फूल ऊतकों के CDTA अर्क में पता चला है, लेकिन और विर्तिका संबंधी ऊतक (चित्रा 3A और 4A) में पराग सबसे कम में सबसे अधिक है. दिलचस्प बात यह है कि, JIM5 का मिलान भी पराग में NaOH के अर्क में पता चला है, लेकिन (चित्रा 3A) अन्य ऊतकों में नहीं है.

ब्याज की एक glycan की घटना के बारे में मात्रात्मक जानकारी माइक्रोएरे पर आंतरिक मानकों (3B चित्रा) के रूप में शुद्ध polysaccharides की एक श्रृंखला सहित द्वारा प्राप्त की है. विभिन्न टी के अर्क का अभिन्न हाजिर तीव्रता हाजिर homogalacturonan (मिथाइल esterification के 25% डिग्री, डे) के एक धारावाहिक कमजोर पड़ने से प्राप्त संकेतों को JIM5 mAb जांच के साथ मुद्दों मिलान किया जाता है. अंडाशय ऊतक, homogalacturonan की लगभग 157 ग्राम JIM5 मिलान युक्त प्रत्येक नमूने में मौजूद था, कुल कोशिका दीवार अवशेषों (चित्रा 3C) के लगभग 1.5% (वजन) के द्वारा के लिए लेखांकन. 625 ग्राम JIM5 मिलान युक्त homogalacturonan जबकि पराग के ऊतकों में उपस्थित थे, कुल कोशिका दीवार के अवशेषों के लगभग 6.25% (वजन) के द्वारा के लिए लेखांकन.

15 glycan epitopes के रिश्तेदार बहुतायत 4 जहां रंग सलाखों की तीव्रता समायोजित प्रत्येक नमूने के लिए मतलब स्थान तीव्रता के लिए आनुपातिक है चित्र में एक heatmap के रूप में संक्षेप हैं. इस डेटा के एक सचित्र प्रतिनिधित्व भी 5 चित्रा में सचित्र है और हमें तेजी से glycan मिलान घटना में अलग फूल ऊतकों के बीच मतभेदों की व्याख्या करने के लिए अनुमति देता है.

हमारे परिणाम बताते हैं "ontent> व्यक्तिगत glycan epitopes विशिष्ट एन alata फूल ऊतकों के बीच वितरित कर रहे हैं कि उदाहरण के लिए, LM13 मिलान (15 (1-5) - α-एल arabinan linearised) anther filaments और सेपल ऊतकों में सबसे प्रचुर मात्रा में है. अन्य ऊतकों (चित्रा 5D) की तुलना में यह पैटर्न कम (1-5) श्रृंखला α-एल arabinan epitopes preferentially MAB LM6 (चित्रा 5E) 15 द्वारा पता लगाया. glycans पार से जोड़ने की है कि हड़ताली इसके विपरीत में है. भी अलग है एन alata फूल में घटना की LM10 मिलान (कम एवजी (1-4) β-D-xylan पैटर्न). कलंक ऊतक अन्य ऊतकों की तुलना में प्रचुर मात्रा में है, लेकिन से अंडाशय ऊतक (चित्रा 5G) अनुपस्थित है LM15. xyloglycan epitopes पत्ती और anther फिलामेंट अन्य ऊतकों (5H चित्रा) की तुलना में सबसे अधिक है, जबकि heteromannans anther filaments में सबसे अधिक कर रहे हैं (5J चित्रा).


चित्रा 1. एक सरल प्रवाह आरेख व्यापक माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (CoMPP) के पांच महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व.

चित्रा 2
चित्रा 2. व्यापक माइक्रोएरे पॉलिमर प्रोफाइलिंग (CoMPP) के महत्वपूर्ण कदम का एक उदाहरण है. (ए) के रूप में तीन संयंत्र के ऊतकों एकत्र कर रहे हैं replicates, homogenized और 70% EtOH और एसीटोन शराब अघुलनशील अवशेषों (एआईआर) में धोया. (बी) सेल दीवार glycans क्रमिक रूप से 50 मिमी CDTA और 4 एम NaOH के साथ हवा के नमूनों से निकाली गई. (सी) निकाली गई कोशिका दीवार glycans nitrocellulose पर मुद्रित एक माइक्रोएरे रोबोट का उपयोग कर रहे हैं. प्रत्येक नमूना तीन सांद्रता में और चार मुद्रण प्रतिकृति के एक श्रृंखला के रूप में प्रतिनिधित्व किया हैtes. (डी) मुद्रित arrays सेल दीवार glycans epitopes के लिए निर्देशित mAbs के साथ अलग - अलग जांच कर रहे हैं. (ई) हाजिर संकेतों माइक्रोएरे इमेजिंग सॉफ्टवेयर, txt फ़ाइलें और रिश्तेदार मतलब हाजिर तीव्रता मूल्यों स्वतः एक ऑनलाइन डाटा प्रोसेसिंग उपकरण का उपयोग कर की गणना के रूप में निर्यात का उपयोग मात्रा निर्धारित कर रहे हैं.

चित्रा 3
चित्रा 3 निकोटियाना alata फूल ऊतकों के glycan रूपरेखा. (ए) के एक प्रतिनिधि माइक्रोएरे मोनोक्लोनल (एमएबी) एंटीबॉडी के लिए JIM5 विशिष्ट homogalacturonan (आंशिक रूप से, कम methylesterification) जांच के साथ एक नकारात्मक, 16-bit झगड़ा फ़ाइल के रूप में संकेत दिया है. (बी) ब्याज की एक glycan मिलान युक्त polysaccharide की राशि polysaccharide मानकों की एक श्रृंखला मुद्रण द्वारा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. (सी) के हित के नमूने के इंटीग्रल हाजिर तीव्रता एमएबी द्वारा जांचJIM5 की गणना है और एक मानक वक्र polysaccharide (छ) मात्रा नमूने में इस का मिलान युक्त अनुमान करने के लिए मिलान.

चित्रा 4
चित्रा 4. Glycan निकोटियाना alata फूल ऊतकों की रूपरेखा एक heatmap के रूप में प्रतिनिधित्व किया. रंग तीव्रता रिश्तेदार मतलब हाजिर पहचान मूल्य (पैमाने बार) के लिए आनुपातिक है. 15 glycan मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (शीर्ष पर सूचीबद्ध) द्वारा पता लगाया epitopes के रिश्तेदार बहुतायत छह ऊतक CDTA और NaOH (बाएं हाथ की ओर) के साथ निकाली प्रकार के लिए विश्लेषण किया गया. के pectins, glycans और arabinogalactan प्रोटीन (AGPS) पार से जोड़ने, glycan epitopes polysaccharides के मोटे तौर पर तीन वर्गों में गिर जाते हैं. मुझे, मिथाइल esterification, डी पी, polymerization की डिग्री, MAB, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, अगप, arabinogalactan प्रोटीन.


5 चित्रा निकोटियाना alata फूल ऊतकों के glycan प्रोफाइलिंग pictorially का प्रतिनिधित्व किया. AL 12 glycan mAbs द्वारा अलग फूल ऊतकों में पाया epitopes के रिश्तेदार बहुतायत का प्रतिनिधित्व करता है. पैमाने बार रंग तीव्रता रिश्तेदार मतलब स्थान पहचान या तो CDTA या NaOH अर्क या दोनों की राशि से प्राप्त मूल्य के लिए आनुपातिक है. मुझे, मिथाइल esterification, डी पी, polymerization की डिग्री, MAB, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी, अगप, arabinogalactan प्रोटीन यहाँ क्लिक करें बड़ा आंकड़ा देखने .

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Discussion

CoMPP दिन के एक मामले में सैकड़ों संयंत्र व्युत्पन्न नमूने की glycan संरचना की रूपरेखा के लिए एक तेज और संवेदनशील तरीका है. इस विधि में पहले से ही उपलब्ध जीवाणु या स्तनधारी lectins, रिसेप्टर्स, और 16 एंटीबॉडी जैसे glycan बंधनकारी प्रोटीन के साथ कार्बोहाइड्रेट बातचीत के उच्च throughput स्क्रीनिंग के लिए glycan सरणी प्लेटफार्मों पूरक. कोशिका दीवार glycans का पता लगाने के लिए उपलब्ध जांच की एक बड़ी विविधता के साथ, यह संभव है glycan संयंत्र सेल दीवार 8,9 में polysaccharides के सभी प्रमुख वर्गों के लिए संबंधित epitopes के बारे में विस्तृत जानकारी हासिल करने के लिए. हालांकि इन glycan संरचनाओं कि 8,9 पहचान की गई है के केवल एक छोटे से अनुपात धरना, और कुछ परिस्थितियों में CoMPP की बोधगम्यता सीमा. फिर भी, इस क्षमता हाल ही में कार्बोहाइड्रेट बाध्यकारी मॉड्यूल का संयंत्र 17 glycans के खिलाफ (विश्वासोत्पादक उपायों) का उपयोग करें द्वारा बढ़ा दिया गया है, और भी गैर - glycosyl Res द्वारा विशेषता epitopes के खिलाफphenolics 18 और एसिटाइल 19 अवशेषों जो glycosyl अवशेषों संशोधित और glycan समारोह में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा के रूप में idues.

हालांकि CoMPP नमूनों का एक सेट भर glycans के रिश्तेदार का स्तर निर्धारित करता है, यह संभव है कि में जाना जाता मानकों (चित्रा 3B और सी) के लिए विशिष्ट नमूनों में बाध्यकारी संकेत तुलना करके अनुक्रमिक अर्क में मिलान स्तर यों. माइक्रोएरे आधारित एक मंच में कम नमूना संस्करणों के फायदे के बावजूद, सही glycan घटना यों क्षमता हाजिर या संकेत हाजिर की आकारिकी संतृप्ति में मतभेद द्वारा बाधा जा सकता है. इन समस्याओं (के रूप में अच्छी तरह से झूठी सकारात्मक) कोशिका दीवार सामग्री छंद extractant मात्रा की राशि का अनुकूलन, विश्लेषण करने के लिए पहले, और की एक श्रृंखला सहित replicates और dilutions के रूप में यहाँ और स्तनधारी glycan सरणी 16 तरीकों में उल्लिखित से परहेज कर रहे है. इसके अलावा हाजिर morphology में मतभेद (नमूनों के प्रसार की वजह सेसंपर्क के बिंदु से अलग दरों पर) गैर संपर्क स्याही जेट माइक्रोएरे 16 प्रौद्योगिकी का उपयोग करके दूर किया जा सकता है.

CoMPP अलगाव और सेल 20 दीवारों की तैयारी के लिए स्थापित प्रक्रिया के साथ संयोजन में किया जाता है. यह भी मौजूदा जैव रासायनिक, enzymatic और भौतिक तरीकों के साथ समानांतर में इस्तेमाल किया जा ब्याज के नमूने में glycan सामग्री के बारे में और अधिक जानकारी हासिल करने के लिए. Cellulosic पॉलिमर, एसिटिक / नाइट्रिक एसिड assays निकालने के बजाय उदाहरण के लिए 20 सेलूलोज़ (एमजी) पेक्टिन और CDTA और NaOH के साथ पार से जोड़ने glycans अनुक्रमिक निकासी के बाद शेष सामग्री यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. Glycan 21 प्रोटीन की एनजाइम उपचार भी नमूने के बीच glycan मिलान वितरण में आगे मतभेद प्रकट कर सकते हैं, या epitopes माइक्रोएरे पर पाया संरचनाओं की विशिष्टता की पुष्टि. glycan संरचना के हाल ही में वर्णित उन लोगों के रूप में स्वतंत्र विश्लेषणात्मक तकनीकों के द्वारा निर्धारण

हम दिखाना है कि glycans एक अंग या एन में ऊतक विशिष्ट तरीके में वितरित कर रहे हैं alata फूल. यह जानकारी glycan epitopes या glycan synthesizing या संशोधित इन विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में मौजूद एंजाइम की जैविक समारोह में जानकारी दे सकता है. CoMPP पहले कोशिका दीवार परिवर्तन है कि रिश्ते में होते हैं विकास के दौरान 23,24 या 10,25 उत्परिवर्तन के जवाब में 22 प्रकार के पौधे में अंतर्दृष्टि प्रदान की है. सारांश में, CoMPP glycans और संयंत्र सेल दीवार में glycan synthesizing और संशोधित जीन के विविध भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है.

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Disclosures

ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.

Acknowledgements

आईईएम के वित्त पोषण के लिए डैनिश अनुसंधान परिषद (एफ़टीपी और FNU) स्वीकार करना चाहते हैं. ERL एक एआरसी डीपी अनुदान के समर्थन को स्वीकार करता है. अटल बिहारी संयंत्र सेल दीवारों अनुदान में उत्कृष्टता के एआरसी सेंटर के समर्थन को स्वीकार करता है.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3 mm Tungsten Carbide beads Qiagen 69997
Collection microtubes (1.2 mm) Qiagen 19560 1.5 ml microfuge tubes can also be used
Qiagen TissueLyser II Qiagen 85300
3 mm glass beads Sigma Aldrich Z143928
CDTA Sigma Aldrich 34588
Cadmium oxide Sigma Aldrich 202894
1,2-diamin–thane Sigma Aldrich 03550
Nitrocellulose membrane (0.22 μm pore size) GE-water process technologies EP2HY00010 different pore sized membranes are suitable for different pin types
Xact II microarrayer robot Labnext 001A the Xact II robot was fitted with a custom 20 x 20 cm ceramic plate to which the nitrocellulose membrane is attached
Xtend RM microarray pins Labnext 0037-350 pins must be suitable for spotting on membranes
384 well microtiter plates (polypropylene) Greiner 781207
Anti-glycan monoclonal antibodies Plant Probes/
CarboSource/Biosupplies
Websites; PlantProbes (www.plantprobes.net), Carbosource (www.carbosource.net) and Biosupplies (www.biosupplies.com.au).
Anti-Rat IgG (whole molecule) - Peroxidase antibody produced in goat. Sigma A9037 the type of secondary antibodies depends on the primary antibody used (e.g. raised in rat, mouse, goat etc).
SIGMAFAST 3,3'-Diaminobenzidine tablets Sigma D4293 the type of developing reagent depends on the secondary antibodies used and the detection method (colourmetric, or chemiluminecent).
SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate Thermoscientific 34080 see above
Xplore Image Processing Software LabNext 008 many software types with automatic gridding tools are available to measure pixel value of microarray spots.
Plant polysaccharides Sigma/Megazyme

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References

  1. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. Plant J. 3, 1-30 (1993).
  2. Somerville, C. Biofuels. Curr. Biol. 17, 115-119 (2007).
  3. Willats, W. G., Orfila, C., Limberg, G., et al. Modulation of the degree and pattern of methyl-esterification of pectic homogalacturonan in plant cell walls. implications for pectin methyl esterase action, matrix properties, and cell adhesion. J. Biol. Chem. 276, 19404-19413 (2001).
  4. Doblin, M. S., Pettolino, F., Bacic, A. Plant cell walls: the skeleton of the plant world. Functional Plant Biology. 37, 357-381 (2010).
  5. Carpita, N., Tierney, M., Campbell, M. Molecular biology of the plant cell wall: searching for the genes that define structure, architecture and dynamics. Plant Molecular Biology. 47, 1-5 (2001).
  6. Sarria, R., Wagner, T. A., O'Neill, M. A., Faik, A., et al. Characterization of a family of Arabidopsis genes related to xyloglucan fucosyltransferase1. Plant Physiol. 127, 1595-1606 (2001).
  7. Somerville, C., Bauer, S., Brininstool, G. Toward a systems approach to understanding plant cell walls. Science. 306, 2206-2211 (2004).
  8. Willats, W. G. T., Knox, J. P. Molecules in context: probes for cell wall analysis. The Plant Cell Wall. Rose, J. K. C. Blackwell. 92-110 (2003).
  9. Pattathil, S., Avci, U., Baldwin, D., et al. A Comprehensive Toolkit of Plant Cell Wall Glycan-Directed Monoclonal Antibodies. Plant Physiology. 153, 514-525 (2010).
  10. Moller, I. E., Sørensen, I., Bernal, A. J., et al. High-throughput mapping of cell-wall polymers within and between plants using novel microarrays. The Plant J. 50, 1118-1128 (2007).
  11. Sørensen, I., Willats, W. G. T. Screening and characterization of plant cell walls using carbohydrate microarrays. Methods Mol. Biol. 715, 115-121 (2011).
  12. Moller, I. E., Licht, D. eF. ine, Harholt, H. H., J,, et al. The dynamics of plant cell-wall polysaccharide decomposition in leaf-cutting ant fungus gardens. PLoS One. 6, (3), e17506 (2011).
  13. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B. Chemical procedures for the determination of polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. In Press (2012).
  14. Clausen, M. H., Willats, W. G. T., Knox, J. P. Synthetic methyl hexagalacturonate hapten inhibitors of anti-homogalacturonan monoclonal antibodies LM7, JIM5 and JIM7. Carbohydrate Res. 338, 1797-1800 (2003).
  15. Verhertbruggen, Y., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. Developmental complexity of arabinan polysaccharides and their processing in plant cell walls. Plant J. 59, 413-425 (2009).
  16. Heimburg-Molinaro, J., Song, X., Smith, D. F. UNIT 12.10 Preparation and Analysis of Glycan Microarray. Current Protocols in Protein Science. (2011).
  17. McCartney, L., Blake, A., Flint, J., et al. Differential recognition of plant cell walls by microbial xylan-specific carbohydrate-binding modules. PNAS. 103, 4765-4770 (2006).
  18. Caño-Delgado, A. I., Metzlaff, K., Bevan, M. W. The eli1 mutation reveals a link between cell expansion and secondary cell wall formation in Arabidopsis thaliana. Development. 127, 3395-3405 (2000).
  19. Manabe, Y., Nafisi, M., Verhertbruggen, Y., et al. Loss-of-Function Mutation of REDUCED WALL ACETYLATION2 in Arabidopsis Leads to Reduced Cell Wall Acetylation and Increased Resistance to Botrytis cinerea. Plant Physiology. 155, 1068-1078 (2011).
  20. Updegraff, D. Semimicro determination of cellulose in biological materials. Anal. Biochem. 32, 420-424 (1969).
  21. 21Moller, I., Marcus, S. E., Haeger, A., et al. High-throughput screening of monoclonal antibodies against plant cell wall glycans by hierarchial clustering of their carbohydrate microarray binding profiles. Glycoconjugate Journal. 25, 37-48 (2007).
  22. Sørensen, I., Pettolino, F. A., Wilson, S. M., et al. Mixed linkage (1→3),(1→4)-β-D-glucan is not unique to the Poales and is an abundant component of Equisetum arvense cell walls. Plant J. 54, (13), 510-521 (2008).
  23. Domozych, D. S., Sørensen, I., Willats, W. G. T. The distribution of cell wall polymers during antheridium development and spermatogenesis in the Charophycean green alga, Chara. 2104, 1045-1056 (2009).
  24. Singh, B., Avci, U., Eichler Inwood, S. E. A specialized outer layer of the primary cell wall joins elongating cotton fibers into tissue-like bundles. Plant Physiol. 150, 684-699 (2009).
  25. Øbro, J., Sørensen, I., Derkx, P., et al. High-throughput screening of Erwinia chrysanthemi pectin methylesterase variants using carbohydrate microarrays. Proteomics. 9, 1861-1868 (2009).

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