Author Produced

Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis rotvekst med Rapid manipulering av Root miljøet ved hjelp av RootChip

Bioengineering
 

Summary

Denne artikkelen gir en protokoll for dyrking av Arabidopsis frøplanter i RootChip, en microfluidic tenkelig plattform som kombinerer automatisert kontroll av vekstforhold med mikroskopisk rot overvåking og FRET-basert måling av intracellulære metabolitter.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Grossmann, G., Meier, M., Cartwright, H. N., Sosso, D., Quake, S. R., Ehrhardt, D. W., Frommer, W. B. Time-lapse Fluorescence Imaging of Arabidopsis Root Growth with Rapid Manipulation of The Root Environment Using The RootChip. J. Vis. Exp. (65), e4290, doi:10.3791/4290 (2012).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

De grunnleggende funksjonene som den fysiske anker av anlegget og er det organ som har ansvar for opptak av vann og mineral næringsstoffer som nitrogen, fosfor, sulfat og sporstoffer som planter erverver fra jorda. Hvis vi ønsker å utvikle bærekraftige metoder for å produsere høy avling avkastning, må vi bedre forstå hvordan roten utvikler, tar opp et bredt spekter av næringsstoffer, og samhandler med symbiotiske og sykdomsframkallende organismer. For å oppnå disse målene, må vi være i stand til å utforske røttene i mikroskopisk detalj er over tidsperioder fra minutter til dager.

Vi utviklet RootChip, en polydimetylsiloksan (PDMS) - basert microfluidic enhet, som tillater oss å vokse og bilde røtter fra Arabidopsis frøplanter samtidig unngå enhver fysisk stress til røttene under forberedelse for avbildning 1 (figur 1). Enheten inneholder en todelt kanal struktur med mikromekaniske ventiler til å lede væskestrømfra løsningen innløpene til hver av de åtte observasjon kamre 2. Dette perfusjon systemet gjør roten mikromiljøet å bli kontrollert og modifisert med presisjon og hastighet. Volumet av kamrene er ca 400 nl, og dermed krever bare minimale mengder test løsning.

Her tilbyr vi en detaljert protokoll for å studere root biologi på RootChip hjelp bildebehandling tilnærminger med sanntid oppløsning. Røtter kan analyseres over flere dager med tid lapse mikroskopi. Røtter kan perfused med næringsinnhold løsninger eller hemmere, og opptil åtte frøplanter kan analyseres parallelt. Dette systemet har potensiale for et bredt spekter av bruksområder, inkludert analyse av rot vekst i nærvær eller fravær av kjemikalier, fluorescens-basert analyse av genuttrykk, og analyse av biosensorer, f.eks FRET nanosensorer tre.

Protocol

Merk: Utfør alle trinnene forberedende trinnene under sterile forhold.

1. Utarbeidelse av plast Cones for frø spiring

  1. Fyll en 10 cm petriskål med vekst medium som inneholder 1% agar til en tykkelse på 5 mm. Vi bruker en halv styrke modifisert Hoagland medium 4, men medium sammensetning bør velges for å passe individuelle eksperimentelle krav.
  2. Mens medium er likevel flytende, kan du bruke en flerkanals pipette til å fylle 10 mL pipettespisser med 5 mL av medium fra petriskål.
  3. Oppbevar fylte tips i pipettespissen boksen til mediet er solid, og deretter klippe til 4 mm lange plast kjegler og sted oppreist i en petriskål med solid vekst medium.

2. Seed spiring og Plantekvalitet Vekst

  1. Overflaten sterilisere frø i 5% NaOCl i 5 min, vask tre ganger med sterilt vann, deretter plassere en enkelt frø på toppen av hver av de mellomstore fylt kjegles.
  2. Tett fatet med Micropore tape (3M) og oppbevar ved 4 ° C for å synkronisere spiring.
  3. Etter tre dager, overføre platene til en vekst kabinett for å starte spiring. Våre vekstvilkår er 23 ° C med en 16h høy light/8h mørk syklus (Light intensitet: 100 μE m -2 s -1).
  4. Mellom 5 og 7 dager etter spiring, bør plantene være klar for overføring til RootChip. På denne tiden, bør root tips være nær bunnen utsalg av plast kjegler. Sjekk frøplante helse, rot lengde og eventuelt uttrykk for et fluoriserende fargestoff under et dissekere mikroskop.
  5. Marker individuelle frøplanter for overføring på brikken. Velg ti eller så frøplanter i tilfelle en blir skadet under overføringen.

3. Overføring av Seedlings på RootChip

  1. Å sterilisere RootChip for langvarige eksperimenter, pakkenheten i silkepapir, plass i et glass petriskål, og autoklav.
  2. Når RootChip er avkjølt, dekker den med flytende vekst medium. Den RootChip bør være helt neddykket, men væskenivået bør ikke være mer enn 3 mm over RootChip overflaten.
  3. Med en 20 mL pipette, trekk medium gjennom roten innløp og utløp kammer å fylle observasjon kammeret med medium.
  4. Plug plast kjegler valgt i trinn 2.5 i de RootChip inntakene. De kjegler bør passe godt i inntakene. Siden RootChip er montert på et tynt lag av optisk glass, gjelder ikke for mye press til brikken.
  5. Inkuber RootChip natten i flytende medium. For å hindre flytende, legger to glassplater på brikken. Legg til en magnetisk oppsikt bar og lukke fatet.
  6. Overfør forsamlingen til en magnetrører og forsiktig agitere mediet.
  7. Den RootChip sin viker skjærer kanalene på en 30 ° vinkel til enheten normalt å FACIlitate rotvekst inn kanalene (Figur 1a). For ytterligere å støtte vekst i ønsket retning, vippe forsamlingen litt ved å plassere et glass lysbilde under petriskål på siden av brikken motsatte av uttakene.
  8. For å opprettholde lys / mørke-syklusen, belyse seedlings med en ring lampe (Light intensitet: 100 μE m -2 s -1) koblet til et tidsur.

4. Koble RootChip til flyselskapet

  1. Dagen etter, fylle en forseglbar, pressurizable ampulle med væske vekst medium (Figur 1B).
  2. Vend chip transportør og legg den på et stabilt underlag. Fjern RootChip fra flytende medium, og sett det PDMS side ned i bunnen blenderåpningen av brikken transportør. Orient brikken slik at den siden som inneholder kontroll lags inntakene vender siden av trykket linje rør kontaktene i holderen sidevegg.
  3. Tørk glasset påbunnen av chip ved å forsiktig blotting med silkepapir. Fest RootChip til transportøren med tape og rett hele forsamlingen.
  4. Tubing kontaktene er laget ved å kutte fleksibel plast microbore tubing (Tygon, 0,20 "ID x 0,060" OD) i 5 cm lange biter og koble dem til rustfritt stål microbore rør (New England Small Tube, 0,025 "OD x 0.013" ID x 0,75 " lang). fylle sonden kontaktene med vann ved hjelp av en sprøyte og plugg hver slange pluggen tilsvarende kontroll laget vik på brikken. Vannet vil senere fylle kontroll laget kanaler og brukes til å overføre trykket til mikromekaniske ventiler.
  5. Plugg den motsatte endene av linjene i media / løsning hetteglass (s). Legge trykk løsningen hetteglasset med en sprøyte med luft. Den økte lufttrykket inne i løsningen hetteglasset vil tvinge væske inn i linjene.

5. Montere RootChip på Microscope

  1. Sett buret på microscope scene. For å redusere muligheten for forsamlingen skiftende i løpet av forsøket på grunn av vibrasjoner i rommet, bør transportøren passe nøyaktig inn i hakkene på scenen innsatsen.
  2. De chip ventiler og flyten av mediet gjennom brikken styres av lufttrykket. To linjer med regulatorer er forgrenet seg av en hovedbygning press linje - man er vant til å kontrollere medium flyten gjennom kanalene, og den andre er koblet til magnetventiler luftventiler som beveget Armhevninger ventiler i kontrollen laget. Magnetventilene drives fra datamaskinen via USB ventilstilleren (utviklet av Rafael Gómez-Sjöberg, Lawrence Berkeley National Lab). Lukk begge trykkregulatorer før du kobler til chip.
  3. Legg inn noen ml vann til magasinene på transportøren for å holde fuktigheten høy innenfor forsamlingen. Dette trinnet bør gjentas over kurs av lengre eksperimenter for å holde plantene tørker ut. Hold volumet lavt for å minimere tHan mengden væske som kan søles på mikroskopet. For langvarige eksperimenter, kan utstrømningen fra brikken uttakene bli guidet inn i reservoarer av transportøren ved å koble chip utsalgssteder til magasinene med microbore tubing (se trinn 4.4). Alternativt kan utstrømningen som samler seg på brikken overflaten hentes av pipettering.
  4. Forbered kvadrat ark med gjennomsiktig plast fra plastlommer (C-Line). Fest gjennomsiktig plast til transportøren ved dobbeltsidig tape for å holde høy luftfuktighet i forsamlingen.
  5. Plasser ringen lys over chip og vedlikeholde lys / mørke-syklusen. Ringen lyset skal slås av før starten av noe eksperiment som bruker fluoriserende markører, som direkte belysning vil forstyrre bildesamling.

6. Betjene RootChip bruke LabView Interface

Den RootChip Controller Interface for LabView programvareplattform kanlastes ned fra vår nettside http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip .

  1. Ventilene på chip er stengt med å trykke kontrollen laget, i dette tilfellet ved å åpne solenoiden luftventiler. Kontrolleren grensesnittet tillater aktivering av ventiler ved å klikke på knappen under ventilen nummer. Bright grønn indikerer anvendelse av press og lukking av en chip ventil (figur 2B). Aktiver alle tre løsningsorientert innløpsventiler i kontrolleren grensesnittet før du åpner de trykkregulatorer. Merk: Kontrolleren grensesnittet har en feedback loop, som tillater overvåking av systemets status. Denne funksjonen kan aktiveres ved å klikke på "Readback"-knappen i kontrolleren grensesnittet.
  2. Åpne trykkregulatoren for kontrollen laget og i utgangspunktet satt til 15 psi, da åpner regulatoren for flyten laget og i utgangspunktet satt til 5 psi. Avhengighet tilDing på ønsket vannmengde, kan presset bli justert senere.
  3. Åpne innløpsventilen for vekst medium av valget til å spyle kamrene med medium.
  4. Sjekk flyt stier under mikroskopet. Vanligvis er luft fanget i flyten kanaler og må fjernes. I tillegg er kanaler kontrollen laget fortsatt inneholde luft som må tvinges ut og erstattet med vann fra slangen kontaktene (dead-end fylling). Begge oppgavene er oppnådd ved å skylle hver av de åtte kamre flere ganger (5 psi) til all luften er tvunget fra kanaler inn i PDMS ("avgassing"). Merk: Controller Interface kan programmeres til å automatisere eksperimenter. Slike rutiner kan også brukes til Degas brikken.

7. Representative Resultater

Det viktigste formålet med RootChip er å kombinere en avbildning plattform og en perfusjon system i en enkelt enhet med høy grad av integrasjon. For å demonstrere manipulasjonav mikromiljøet av røtter spylt vi kamrene med mørk konditorfarge (01:04 fortynning i hydroponic medium) og målte utveksling av væske inne i kamrene. Ved anbefalte presset av 5 psi målte vi en full utveksling innen 10 sekunder ved en beregnet vannmengde på ca 1,5 mL / min (figur 3).

Vi observerte også rot vekst av frøplanter, i dette tilfellet vokst i mørket og leveres med 10 mm Glukose som en ekstern energikilde (figur 4). Avhengig av vekstforhold som lys og sammensetning av mediet, kan planter observeres i RootChip i inntil tre dager.

Den RootChip har blitt brukt til å overvåke intracellulær glukose og galaktose nivåer i røttene uttrykker genetisk kodet nanosensorer, basert på Förster Resonance Energy Transfer (FRET) 5-7. Røtter i brikken ble perfused med kvadratiske pulser av glukose eller galaktose løsning (

Figur 1
Figur 1. RootChip prinsipp.

  1. Den RootChip har åtte observasjon kamre for vekst og avbildning av røtter. Frøene første spire i plast kjegler - fremstille fra plast pipettespisser - som er fylt med fast medium. Rotspissen vokser gjennom mediet og når kammeret hvor en kontinuerlig strøm av flytende medium holder forholdene i kammeret konstant. Mikromekaniske ventiler (rød) kontrollere flyten. Brikken er montert på en optisk dekning glass.
    Tegning ikke å skalere. (Tilpasset med tillatelse fra Grossmann et al., 2011 Plant Cell.)
  2. SchEME av en pressurizable løsning hetteglass med membran (rød).

Figur 2
Figur 2. Koble til og montere RootChip.

  1. Top visning av fullt tilkoblet RootChip og bærer montert på en invertert mikroskop.
  2. Scheme illustrerer valving systemet og håndkontrollen grensesnittet. Et eksempel på en ventil innstilling for å veilede strømning til en enkelt kammer vises. Mens ventiler 4 til 8 fungere som enkle ventiler, 0 ventiler gjennom tre akt i grupper. Med dette systemet en individuell kammer kan løses ved å aktivere en kombinasjon av ventiler.

Figur 3
Figur 3. Utveksling av løsninger i observasjonen lmAmbers. Visualisering av utveksling av væske i en observasjon kammer bruker dye løsning. Bildet er en overlapping av lys felt og falsk-farget intensitet av fargestoff signal.

Figur 4
Figur 4. On-chip rotvekst. Observasjon av en enkelt voksende rot uttrykker en fluoriserende FRET Nanosensor for glukose / galaktose i løpet av 20h. Tidsformat: hh: mm; skala bar: 100 mikrometer.

Figur 5
Figur 5. Måle intracellulære sukker nivåer ved hjelp FRET nanosensorer.

  1. Mengden av sensoren er vist som citrin intensitet innenfor rotspissen (til venstre). Responsen av den intracellulære FRET Nanosensor til anvendelse av glukose eller galaktose løsning er vist som ratiometric bilder. (Tilpasset med tillatelse fra Grossmann et al., 2011 Plant Cell) Scale bar:. 100 mikrometer.
  2. Følge FRET ratio endringer som en reaksjon på tre gjentatte kvadrat pulser av glukose (grønn) og galaktose (rød).

Discussion

De viktigste fordelene ved RootChip enn konvensjonelle vekst metoder er det minimalt invasiv forberedelse for mikroskopi, evnen til å reversibelt og gjentatte ganger endre rotmiljøet, og kapasiteten for kontinuerlig observasjon av utviklingshemmede kompetent og fysiologisk friskt vev over en periode på flere dager. Tidligere ble frøplanter dyrket vertikalt på gelled media og overført til en perfusjon system umiddelbart før forsøket, noe som tillot bare måle enkle røtter på en tid 8. Microfluidic verktøy har blitt brukt til Arabidopsis, men på et lavt integrering nivå 9 eller uten perfusjon kontroll 10. Den RootChip kombinerer en høy grad av integrasjon med evnen til å automatisere eksperimenter gjennom presis flyt veiledning. En annen fordel med denne plattformen, karakteristisk for alle microfluidic enheter 11, er at bare minimale mengder væske er nødvendig for å forsyne rot med nødvendig mutterrients, selv om forsøk som spenner over flere dager. Den RootChip tiden utformet som en engangskode enhet, men siden produksjonskostnadene for chips er lav, gjør at små mengder av konsumert reagenser brikken fortsatt svært kostnadseffektiv.

Det er noen viktige skritt som må tas for å sikre helsen til seedlings:

Volumet i plast koner er bare 3-4 mL, som vil begynne å tørke når de utsettes for luft. Derfor er det avgjørende at kjeglene blir overført på brikken raskt og fuktighet holdes høyt inntil røttene har nådd observasjon kamre, som vil forsyne dem med tilstrekkelig vann. Trinn 4.2 til 4.5 skal utføres raskt og uten avbrudd for å hindre uttørking av frøplanter.

Steps 3.5 - 3.8 beskrive inkubasjon av brikken i flytende medier der røttene vokser inn i observasjon kamre. Dette trinnet kan bli hoppet over ved å montere chip inn i carrier umiddelbart og begynner konstant perfusjon med vekst medium. Vi anbefaler imidlertid soaking i vekst medium over natten, så den har noen fordeler: 1) Det skaper et fuktig miljø, så spirene er mindre sannsynlig å bli revet som de vokser til observasjon kammeret, 2) brikken er dynket i væske, så avgassing (steg 6,4) vil være raskere.

Det er viktig å bruke medier med lav stoff konsentrasjoner. Mer konsentrerte løsninger kan utløse og tette kanaler, spesielt hvis brikken brukes over flere dager.

Når enheten er koblet til lufttrykket linjen, er flyten av medium kontrolleres ved å endre hydraulisk trykk i ventilene. For å garantere riktig lukking av mikromekaniske ventiler, er det viktig å velge en kontroll trykk som er omtrent tre ganger høyere enn vanntrykk. Flyten trykket bør ikke overstige 15 psi som væske vil bli skjøvet ut av roten inntakene. Høyere presset may også forårsake delaminering av chip, som gjør brikken ubrukelig.

En begrensning av RootChip er at PDMS er porøs og hydrofobe. Mens materialet er praktisk talt inert til vandige løsninger, kan det absorbere organiske forbindelser 12. Dette kan forstyrre en rask utveksling av løsninger som organiske forbindelser kan lekke fra materialet, selv når tilførselen av denne forbindelsen har blitt stoppet ved innløpet. På grunn av porøsitet, kan bruke organiske løsemidler forårsake svelling av PDMS 12.

Vi fortsetter å optimalisere RootChip og utvide sin nytteverdi, for eksempel med røtter av planter. Vi tror at ved å forbedre tilgangen til roten for behandlinger og observasjon, vil microfluidic verktøy som RootChip åpner opp nye dimensjoner av rot forskning.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklært.

Acknowledgments

Vi takker Philipp Denninger for hjelp med video forberedelse og Bhavna Chaudhuri for å gi plante linjene uttrykker slite sensorer. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra National Science Foundation (MCB 1.021.677), Department of Energy (DE-FG02-04ER15542) til WBF, National Institutes of Health, og Howard Hughes Medical Institute til SRQGG ble støttet av en embo lang sikt fellesskap. MM ble støttet av Alexander von Humboldt Foundation.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chip carrier, software and other information. Carnegie Institution - DPB CAD and CNC files for carrier fabrication, controller software and further information are available for download from the website http://dpb.carnegiescience.edu/technology/rootchip Carriers can also be ordered from this website.
RootChip Stanford Foundry Mask designs and fabrication protocols are available upon request. Ready-to-use RootChips can be ordered from http://www.stanford.edu/group/foundry/
Chip controller Home-built The automated valve controller system was originally developed by Rafael Gómez-Sjöberg , Lawrence Berkeley National Lab. A detailed instruction how to build your own actuated valve controller can be found at https://sites.google.com/a/lbl.gov/microfluidics-lab/valve-controllers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Grossmann, G. The RootChip: An Integrated Microfluidic Chip for Plant Science. Plant Cell. 23, 4234-4240 (2011).
  2. Unger, M. A., Chou, H. P., Thorsen, T., Scherer, A., Quake, S. R. Monolithic microfabricated valves and pumps by multilayer soft lithography. Science. 288, 113-116 (2000).
  3. Okumoto, S., Jones, A., Frommer, W. B. Quantitative Imaging with Fluorescent Biosensors: Advanced Tools for Spatiotemporal Analysis of Biodynamics in Cells. Annu. Rev. Plant Biol. (2012).
  4. Loqué, D., Lalonde, S., Looger, L. L., von Wirén, N., Frommer, W. B. A cytosolic trans-activation domain essential for ammonium uptake. Nature. 446, 195-198 (2007).
  5. Okumoto, S. Imaging approach for monitoring cellular metabolites and ions using genetically encoded biosensors. Curr. Opin. Biotechnol. 21, 45-54 (2010).
  6. Fehr, M., Frommer, W. B., Lalonde, S. Visualization of maltose uptake in living yeast cells by fluorescent nanosensors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 99, 9846-9851 (2002).
  7. Takanaga, H., Chaudhuri, B., Frommer, W. B. GLUT1 and GLUT9 as major contributors to glucose influx in HepG2 cells identified by a high sensitivity intramolecular FRET glucose sensor. Biochim. Biophys. Acta. 1778, 1091-1099 (2008).
  8. Chaudhuri, B., Hörmann, F., Frommer, W. B. Dynamic imaging of glucose flux impedance using FRET sensors in wild-type Arabidopsis plants. J. Exp. Bot. 62, 2411-2417 (2011).
  9. Meier, M., Lucchetta, E. M., Ismagilov, R. F. Chemical stimulation of the Arabidopsis thaliana root using multi-laminar flow on a microfluidic chip. Lab Chip. 10, 2147-2153 (2010).
  10. Parashar, A., Pandey, S. Plant-in-chip: Microfluidic system for studying root growth and pathogenic interactions in Arabidopsis. Appl. Phys. Lett. 98, 263703-26 (2011).
  11. Whitesides, G. M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 442, 368-373 (2006).
  12. Lee, J. N., Park, C., Whitesides, G. M. Solvent Compatibility of Poly(dimethylsiloxane)-Based Microfluidic Devices. Anal. Chem. 75, 6544-6554 (2003).

Comments

2 Comments

  1. How can I get a chamber like that, can I buy it? where to ask for it?...Thanks a lot,
    Luis Cardenas

    Reply
    Posted by: luis c.
    September 3, 2012 - 5:28 PM
  2. Hi,
    chips can be ordered from the Stanford Microfluidics Foundry ( http://www.stanford.edu/group/foundry/). Select custom-made PDMS chips and refer to "RootChip Vs1". To set the system up in your lab you also need valves and controller for the pressure line. Instructions how to build these can be found under the links given in the article. Please feel free to contact me by email for further details.

    Guido

    Reply
    Posted by: Anonymous
    September 3, 2012 - 5:52 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics