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La endotelina-1 inducida por la arteria cerebral media oclusión Modelo para el ictus isquémico con Orientación flujometría láser Doppler en la rata

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Summary

Varios modelos animales de isquemia cerebral han sido desarrollados para simular la condición humana de accidente cerebrovascular. Este protocolo describe la endotelina-1 (ET-1) inducida por la oclusión de la arteria cerebral media (MCAO) modelo de accidente cerebrovascular isquémico en ratas. Además, las consideraciones importantes, ventajas y deficiencias de este modelo se discuten.

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Ansari, S., Azari, H., Caldwell, K. J., Regenhardt, R. W., Hedna, V. S., Waters, M. F., Hoh, B. L., Mecca, A. P. Endothelin-1 Induced Middle Cerebral Artery Occlusion Model for Ischemic Stroke with Laser Doppler Flowmetry Guidance in Rat. J. Vis. Exp. (72), e50014, doi:10.3791/50014 (2013).

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Abstract

El ictus es la primera causa de discapacidad y la tercera causa de muerte en el mundo, con un costo estimado de $ 70 mil millones en los Estados Unidos en 2009 1, 2. Varios modelos de isquemia cerebral se han desarrollado para imitar la condición humana de accidente cerebrovascular. Se ha sugerido que hasta el 80% de todos los accidentes cerebrovasculares resultado de daño isquémico en la arteria cerebral media (MCA) zona 3. En la década de 1990, la endotelina-1 (ET-1) 4 fue utilizado para inducir isquemia aplicándolo directamente adyacente a la superficie de la MCA después de la craneotomía. Más tarde, este modelo fue modificado 5 mediante el uso de una inyección estereotáxica de ET-1 adyacente a la MCA para producir isquemia cerebral focal. Las principales ventajas de este modelo incluyen la capacidad de realizar el procedimiento rápidamente, la capacidad de controlar la constricción de las arterias mediante la alteración de la dosis de ET-1 emitido, no hay necesidad de manipular los vasos extracraneales que suministran sangre al cerebro, así como gradual reperfusien las tarifas que más estrechamente imita la reperfusión en los seres humanos 5-7. Por otro lado, el modelo ET-1 tiene desventajas que incluyen la necesidad de una craneotomía, así como una mayor variabilidad en el volumen de eyección 8. Esta variabilidad se puede reducir con el uso de la flujometría láser Doppler (LDF) para verificar la isquemia cerebral durante la infusión de ET-1. Factores que afectan la variabilidad apoplejía incluyen precisión de la infusión y el lote de la ET-1 usado 6. Otra consideración importante es que a pesar de la reperfusión es una ocurrencia común en el ictus humano, la duración de la oclusión para ET-1 inducida por MCAO no puede imitar estrechamente la de apoplejía humana donde muchos pacientes tienen reperfusión parcial durante un período de horas a días después de la oclusión 9, 10. Este protocolo se describen en detalle la ET-1 inducida por MCAO modelo de accidente cerebrovascular isquémico en ratas. También se hará referencia a consideraciones especiales e inconvenientes potenciales durante el procedimiento.

Protocol

Este protocolo fue aprobado por el Cuidado de Animales institucional y el empleo Comisión (IACUC) de la Universidad de Florida y está en conformidad con la "Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio" (octava edición de la Academia Nacional de Ciencias, 2011).

Materiales

  1. Animales: Ocho semanas de edad, macho, Sprague Dawley (Charles River Farms, Wilmington, MA, EE.UU.) con un peso de 250-300 g en el momento de la cirugía.
  2. Anestesia
    1. Inhalación sistema de anestesia (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, EE.UU.)
    2. El isoflurano anestesia (Farmacia Baxter, Deerfield, IL, EE.UU.)
  3. Estereotáxica sistema (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, EE.UU.)
    1. Animal Pequeño sistema estereotáxico
    2. Para no romper los oídos barras para ratas
    3. Anestesia Gas cabeza titular para ratas
  4. Regulación de la temperatura
    1. BAT-12 microsonda termómetro (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
    2. T / PUMP, TP600 manta térmica (Industrias Gaymar, Inc., Orchard Park, Nueva York, EE.UU.)
  5. Los instrumentos quirúrgicos
    1. Mango de bisturí y la cuchilla # 11, iris pinzas, fórceps Graefe, retractores bulldog pinza, destornillador, jeringa de 10 ml con aguja de calibre 26 biselado (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, EE.UU.)
    2. Micromotor taladro y soporte estereotáxico, Quintessential inyección estereotáxica (Stoelting, Wood Dale, IL, EE.UU.)
    3. 1,0 mm fresa fresa redonda, 1,0 mm cono invertido taladro fresa (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.)
  6. Suministros Quirúrgicos
    1. Tornillos de montaje 0-80 x 3/32 de 2,4 mm de longitud del eje, 21-calibre cánula guía [4 mm de largo por debajo del pedestal] y maniquí cánula (un plástico, Roanoke, VA, EE.UU.)
    2. Jet acrílico de la dentadura y líquidos (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Chicago, IL, EE.UU.)
    3. 3,0 nylon sutura (Oasis, Mettawa, IL, EE.UU.)
    4. Hisopos de algodón, pomada ocular Puralube (Fisher Científico, Pittsburgh, PA, EE.UU.)
    5. Máquinas de cortar el cabello (eléctricas Oster, Providence, Rhode Island, EE.UU.)
  7. Químicos
    1. La endotelina-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, EE.UU.)
    2. La clorhexidina al 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, EE.UU.)
    3. Buprenorfina HCl (Hospira Inc., de Lake Forest, IL, EE.UU.)
  8. Visualización de equipos
    1. Microscopio quirúrgico (Seiler Instrument and Manufacturing, St. Louis, MO, EE.UU.)
    2. Iluminador de fibra óptica (TechniQuip Corp., Livermore, CA, EE.UU.)
  9. Flujometría láser Doppler del sistema (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, EE.UU.)
    1. StPencil Probe Andard
    2. Probe titular
    3. Sangre FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 con LabChart 7
  10. Medición del volumen del infarto
    1. Rata cerebro matriz (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, EE.UU.)
    2. 2,3,5-trifeniltetrazolio (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, EE.UU.) diluido al 0,05% en PBS
    3. Escáner plano (Epson Perfection V30 de Epson America, Inc., Long Beach, CA, EE.UU.)
    4. Image J software (software ImageJ 1.42q, EE.UU. Institutos Nacionales de Salud, Bethesda, MA, EE.UU.)

1. Pre-quirúrgicos Pasos

  1. Antes de la cirugía, las ratas se alojaron en un 12:12 luz / oscuridad ciclo con acceso libre a comida y agua roedores.
  2. La anestesia se indujo con 4% de isoflurano en el 100% de mezcla gas O 2 en una cámara de inducción hasta que la rata ya no retiradas a pinch pata trasera.
  3. Latécnica séptica se debe mantener durante este procedimiento, incluyendo el uso de guantes estériles y estériles instrumentos quirúrgicos y un campo estéril quirúrgico 11.
  4. La corona de la cabeza rapada con cortar el pelo eléctricas.
  5. La rata se coloca en la posición de decúbito prono sobre una almohadilla absorbente tendido en una superficie de operación de temperatura controlada (manta térmica).
  6. La cabeza se coloca en el aparato estereotáctico de partida con la colocación de la máscara facial gas anestésico.
  7. A continuación, las barras del oído se inserta y se aprieta.
  8. Durante el procedimiento de anestesia se mantiene con 2% de isoflurano en 100% de mezcla de gas O 2.
  9. Ungüento oftálmico lubricante se aplica a ambos ojos y los párpados están cerrados para prevenir la desecación del ojo durante el procedimiento quirúrgico.
  10. Una sonda de temperatura rectal es insertado para mantener una temperatura constante animales núcleo de 37 ± 0,5 ° C.
  11. Con la cabeza mantiene firmemente en la estereotáxicodispositivo, el área quirúrgica se limpia con alternancia de clorhexidina al 2% y solución salina tres veces.

2. Pasos quirúrgicos

  1. Con un escalpelo, una incisión central se hace en la piel que cubre la bóveda craneal de los aspectos más caudales de los ojos (nasión) a entre las orejas (línea nucal superior).
  2. La piel se retrae lateralmente con 3 pinzas bulldog.
  3. El tejido conectivo está retirado del cráneo utilizando hisopos de algodón seco para que múltiples estructuras se pueden ver claramente. Estos incluyen bregma, la sutura coronal, y la cresta lateral derecha del cráneo. Bastoncillos de algodón se utilizan para eliminar la sangre del campo quirúrgico.
  4. El uso del microscopio quirúrgico, bregma se encuentra, y los manipuladores estereotáxica se ajustan hasta que la fresa 1,0 mm redondo taladro se pone a cero a bregma.
  5. La fresa de perforación se mueve entonces a 1,6 mm anterior y 5,2 mm lateral al bregma.
  6. Un agujero de fresa que penetra en el cráneo perforado por cannula colocación (Figura 1). El exceso de suciedad y la sangre están constantemente limpiado utilizando hisopos de algodón.

En este punto, una cánula de guía puede ser insertado (paso 7) o una directa ET-1 de inyección a través del orificio de fresa se puede realizar (vaya directamente al paso 16).

  1. Luego los agujeros, BUR 3 para los tornillos de montaje están perforados a través de espesor parcial del cráneo usando un cono invertido 1,0 mm taladro fresa (Figura 1). Un agujero es perforado en cada hueso frontal aproximadamente 1-2 mm por delante de la sutura coronal y 1-2 mm lateral a la sutura sagital. Un agujero es perforado en el hueso parietal de unos 2-3 mm posterior a la sutura coronal y 2-3 mm lateral a la sutura sagital ipsilateral al agujero de guía para cánula fresa. Tres 0-80 x 3/32 tornillos de montaje se colocan en los agujeros fresa y proporcionará apoyo para el cemento que en la cánula. Los tornillos deben ser avanzado 2 o 3 vueltas a fin de no dañar la duramadre. La cánula de guía se coloca en el soporte de cánula estereotáxico y se encuentra bregma.
  2. Los manipuladores estereotáxica se ajustan hasta que la cánula guía se pone a cero a bregma. La cánula se mueve en el orificio situado fresa de 1,6 mm anterior y 5,2 mm lateral al bregma.
  3. Finalmente, la cánula guía se introduce en el agujero de la fresa con la posición de la punta final de 4,5 mm ventral a la bregma.
  4. Laser Doppler sonda de colocación (opcional)
    1. Con el fin de controlar el flujo sanguíneo cerebral usando LDF, un soporte de la sonda se puede colocar en posición antes de la colocación de la cánula guía con cemento dental.
    2. La base de soporte de la sonda se recorta a ras con el pedestal a excepción de pestaña en forma de cuña pequeña.
    3. El soporte de la sonda se coloca posterior a la cánula guía y justo medial al canto lateral del cráneo con la pestaña orientado medialmente (Figura 1).
    4. El soporte de la sonda y guía cánula se fijan entre sí mediante cemento dental.
  5. Cemento dental se utiliza entonces para asegurar la cánula en su lugar. El cemento está en contacto con los tres tornillos y rodea toda la base de la cánula.
  6. El cemento debe estar completamente seca antes de la retirada del soporte de cánula. Esto toma alrededor de 5 min.

Después de estos pasos, la incisión quirúrgica se puede cerrar y el maniquí cánula se puede atornillar en la cánula guía. Alternativamente, ET-1 inducida por MCAO se puede realizar en la rata después de un período de recuperación de la cirugía de implante de la cánula. Para este método, el paso 19 se debe realizar próximo y pasos 14-18 se puede realizar en un momento posterior. Para llevar a cabo la implantación cánula guía y la inyección de ET-1 durante la misma cirugía, el paso 14 se debe realizar después.

  1. La jeringuilla de infusión se carga con ET-1 (diluida a 80 mM en PBS) y luego se monta en el inyector estereotáxica.
  2. Lamanipuladores estereotáxicas se ajustan hasta que la punta de la aguja se pone a cero en el borde de la cánula guía.
  3. La punta de la aguja se baja a través de la cánula guía hasta una posición de 17,2 mm ventral a la llanta de la cánula guía. Si una cánula guía no se utiliza, la punta de la aguja se pone a cero al bregma y bajado a través del agujero de la fresa para una posición de 8,7 mm ventral a la bregma.
  4. 3 l de 80 mM ET1 se infunde a una velocidad de 1 l por min.
  5. La jeringa se deja en su lugar durante 3 min después de la infusión es completa y luego se extrae lentamente.
  6. La incisión se cierra con sutura de nylon 3,0 y el maniquí cánula se enrosca en la cánula.
  7. Una dosis de analgésico apropiado (es decir, la buprenorfina en 0.05-0.1 mg / kg) se debe utilizar después de la cirugía para minimizar el dolor y la incomodidad durante el período de recuperación.
  8. La rata se retira de la sala de operaciones y se coloca en un lugar caliente y seco recuperación para prevenir la hipotermia, con acceso libre y fácil a una alimentación suave y agua.

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Representative Results

1. Post-Op evaluación neurológica

Después de que el animal recobre el conocimiento, una amplia variedad de pruebas se puede utilizar para evaluar los déficits neurológicos, incluyendo el equilibrio, la fuerza de agarre, colocación pata, la asimetría postural y la escalera de escalada. La tarea de semilla de girasol es una evaluación bruto de la función motora y sensorial que tiene una correlación significativa con el volumen de infarto 7, 12. Durante esta tarea, las ratas son a tiempo al abrir y consumir 5 semillas de girasol. Las cinco semillas se colocan en una esquina de un vacío, caja seca, el plástico y el tiempo dedicado a la manipulación de las semillas se registra. Además, el número de trozos de concha en la jaula después de todas las semillas se han abierto y consumido se registra. Las ratas con mayor déficit neurológico se necesitará más tiempo para abrir y consumir las semillas y las cáscaras se romperá en pedazos más. Aunque no es una parte formal de esta tarea, es fácil observar frecuente mal manejo y la caída de la semilla de girasols por las ratas después del accidente cerebrovascular experimental. Esto incluye el uso de principalmente una pata delantera, y morder ineficaz del depósito durante los intentos de abrir.

2. Tinción y medición cuantitativa de volumen del infarto cerebral

Después de la oclusión y reperfusión de la ACM para establecer una isquemia cerebral transitoria, los animales son sacrificados y sus cerebros coronalmente seccionados se tiñen con cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) para evaluar el volumen del infarto (Figura 2) como se describe en nuestras publicaciones anteriores 7, 13.

Figura 1
Figura 1. Vista dorsal del cráneo de rata que representa la colocación de hardware. Esta vista dorsal del cráneo de rata con orientación anterior a la izquierda muestra la ubicación de bregma y lambda con respecto a las suturas que pueden ser visualizados después de la limpieza conectivotejido de la superficie del cráneo. La cresta del cráneo lateral, guía para cánula, sonda titular LDF y los tornillos de anclaje también se muestran en el diagrama de relaciones relativas a marcas de tierra del cráneo y de los demás.

Figura 2
Figura 2. TTC-manchado secciones en serie coronales del cerebro (2 mm) de rata sometido a ET-1 inducida por MCAO. Un representante cerebro de una rata después de ET-1 inducida por MCAO se muestra. Este cerebro se retiró y se enjuagó en PBS helado antes de ser seccionado coronalmente en secciones de 2 mm de espesor a partir justo caudal a los bulbos olfatorios. Las rebanadas se incubaron en 0,05% TTC diluyó en PBS a 37 ° C antes de ser enfriada en PBS y después se fijaron brevemente en formalina. Tejidos teñidos de rojo después de la exposición a la sustancia gris representa TTC viable. La materia gris viable en el hemisferio ipsilateral a la inyección de ET-1 se puede comparar con el m grisAtter del hemisferio contralateral para calcular el área del infarto cerebral.

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Discussion

La ET-1 inducida por MCAO es un modelo establecido de accidente cerebrovascular isquémico experimental que se utiliza regularmente en múltiples cepas de ratas. Muchas variables, como la cepa de rata, la edad del animal, la temperatura corporal, el método de anestesia, y la experiencia del operador puede conducir a una mayor variabilidad en los volúmenes de infarto cuando se utiliza este modelo de 5, 14. Sin embargo, varios investigadores han demostrado que las ventajas de este modelo incluyen el enfoque relativamente no invasivo, respuesta a la dosis del flujo sanguíneo cerebral a ET-1, y la capacidad de evitar la anestesia por completo mediante la infusión de ET-1 en ratas conscientes 14, 15. Es notable que hay muchas diferencias en la cepa de rata y de edad utilizado en la literatura y no es sorprendente que diferentes coordenadas estereotáxicas se reportan en función de estas variables. Las coordenadas utilizado en nuestro protocolo se han optimizado para 8 semanas de edad ratas macho Sprague Dawley. Cualquier desviación de esta cepa, el sexo o la edad es probable que requiera inyectar intracerebralion de colorante seguido de necropsia para identificar las coordenadas válidas para este procedimiento. Además, la reducción inducida por ET-1 en el flujo sanguíneo cerebral es dependiente de la dosis. El uso de la dosis en este método causa un infarto de aproximadamente un 30-40% de la materia gris en el hemisferio ipsilateral a la inyección con un error estándar de la media de alrededor de 4-5% en un experimento 7, 16. La visualización directa de las partes proximales de la MCA revela un diámetro luminal que se va a 0% de línea de base dentro de 3 min y vuelve a la línea base en aproximadamente 30 min 7. Uso de LDF, flujo máximo fue demostrado que disminuye a aproximadamente 10% del flujo de línea de base en 5-7 min con retorno gradual a 60% del nivel basal después de 1 hr de vigilancia que se interrumpió 16.

Otros detalles técnicos específicos que merecen una mención son los siguientes:

  1. Correctamente localizar y poner a cero el equipo estereotáxico a bregma (bajo la guía microscópica) es crucial para inducibleng un golpe exitoso. Las coordenadas estereotáxicas para la infusión de ET-1 debe ser verificada por el equipo específico experimental y cepa de rata antes de la experimentación. Es probable que ninguna lesión se producirá si la infusión no está dentro de 0,5 mm de la MCA 6.
  2. Tener cuidado de no causar daño al cerebro cuando se taladra el agujero fresa inicial para la cánula de guía. Se recomienda que una velocidad lenta de perforación se utiliza para iniciar el agujero de la fresa y de nuevo hacia el final con el fin de minimizar las posibilidades de penetrar en el cerebro.
  3. Al taladrar agujeros fresa para los tornillos de montaje, utilizar la fresa de cono invertido taladro para crear un agujero fresa que sólo penetra parcialmente en el cráneo. Sólo perforar suficientemente profunda para que los tornillos son estables.
  4. Cuando cementación la cánula en el lugar asegúrese de mantener el cemento claro de la piel, así como el brazo estereotáxica. El cemento puede ser manipulada antes de secar con un bastoncillo de algodón.
  5. Asegúrese de que el cemento es completamente dry y la cánula es estable antes de la retirada del soporte de cánula. Es crítico que la cánula no moverse antes de la inyección de ET-1.
  6. En nuestra experiencia, el modelo ET-1 tiene una carrera de aproximadamente 20% tasa de mortalidad debido a la intervención quirúrgica. Es importante comparar las tasas de mortalidad entre los grupos de tratamiento y también experimentos del plan para que los tamaños de las muestras suficientes se utilizan para los parámetros neurológicos e histológicos.
  7. Directrices para los ensayos preclínicos para la terapia de accidente cerebrovascular agudo recomiendan el monitoreo del flujo sanguíneo cerebral y de monitorización fisiológica de la presión sanguínea, la temperatura, la glucosa, y los gases sanguíneos para reducir la variabilidad en los experimentos 17. LDF es un método que puede ser utilizado para monitorización en tiempo real del flujo de sangre en diversas regiones anatómicas para verificar un umbral predeterminado para la reducción en el flujo que se ha logrado.
  8. Asegúrese de limpiar la jeringa y la aguja de infusión con etanol y la solución salina entre las inyecciones y etanol antes dealmacenamiento. Este procedimiento dará retirada consistente y la inyección de ET-1without burbujas de aire o bloqueos durante el funcionamiento.

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Disclosures

No hay conflictos de interés declarado.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas de la Asociación Americana del Corazón Afiliado Mayor Sudeste (09GRNT2060421), la American Medical Association, y de la Universidad de Florida Clínica y Traslacional Science Institute. Adán Meca es un compañero NIH / NINDS, NRSA predoctoral (F30 NS-060335). Robert Regenhardt recibido apoyo beca predoctoral de la Universidad de Florida Programa de Entrenamiento Multidisciplinario de Hipertensión (T32 HL-083810).

Materials

  1. Animals: Eight-week-old, male, Sprague Dawley rats (Charles River Farms, Wilmington, MA, USA) weighing 250-300 g at the time of surgery.
  2. Anesthesia:
    1. Inhalation anesthesia system (VetEquip Inc., Pleasanton, CA, USA)
    2. Isoflurane anesthetic (Baxter Pharmaceutics, Deerfield, IL, USA)
  3. Stereotaxic system (David Kopf Instruments, Tujunga, CA, USA):
    1. Small animal stereotaxic system
    2. Non-rupture ear bars for rats
    3. Gas anesthesia head holder for rats
  4. Temperature regulation:
    1. BAT-12 microprobe thermometer (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. T/PUMP, TP600 Thermal blanket (Gaymar Industries, Inc., Orchard Park, NY, USA)
  5. Surgical instruments
    1. Scalpel handle and #11 blade, iris forceps, Graefe forceps, bulldog clamp retractors, screwdriver, 10 μl syringe with 26 gauge beveled needle (World Precision Instruments, Inc., Sarasota, FL, USA)
    2. Micromotor drill and stereotaxic holder, Quintessential Stereotaxic Injector (St–lting, Wood Dale, IL, USA)
    3. 1.0 mm round drill bur, 1.0 mm inverted cone drill bur (Roboz Surgical Instrument Co., Inc., Gaithersburg, MD, USA)
  6. Surgical Supplies
    1. Mounting screws 0-80 X 3/32 with 2.4 mm shaft length, 21-gauge guide cannula [4mm long below the pedestal] and cannula dummy (Plastics one, Roanoke, VA, USA)
    2. Jet denture acrylic and liquid (Lang Dental Manufacturing Co., Inc., Wheeling, IL, USA)
    3. 3.0 nylon suture (Oasis, Mettawa, IL, USA)
    4. Cotton swabs, Puralube eye ointment (Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA)
    5. Electric hair clippers (Oster, Providence, RI, USA)
  7. Chemicals:
    1. Endothelin-1 (American Peptide, Sunnyvale, CA, USA)
    2. Chlorhexidine 2% (Agrilabs, St. Joseph, MO, USA)
    3. Buprenorphine HCl (Hospira Inc., Lake Forest, IL, USA)
  8. Visualization Equipment
    1. Surgical microscope (Seiler Instrument and Manufacturing; St. Louis, MO, USA)
    2. Fiber Optic illuminator (TechniQuip Corp., Livermore, CA, USA)
  9. Laser Doppler flowmetry system (ADInstruments, Inc., Colorado Springs, CO, USA)
    1. Standard Pencil Probe
    2. Probe holder
    3. Blood FlowMeter
    4. Powerlab 4/30 with LabChart 7
  10. Measurement of infarct volume:
    1. Rat brain matrix (Zivic-Miller Lab., Inc., Allison Park, PA, USA)
    2. 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride (Sigma-Aldrich Co., St Louis, MO, USA) diluted to 0.05% in PBS
    3. Flatbed scanner (Epson Perfection V30, Epson America, Inc., Long Beach, CA, USA)
    4. Image J software (ImageJ 1.42q software, U.S. National Institutes of Health, Bethesda, MA, USA)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Comments

1 Comment

  1. sir i have read your article. its a very gud work i want to understand it properly for that i need a pdf. of this work iam not able to get it from jove.kindly plz mail it to me at nhsoni44@gmil.com. i,ll be highly thankful to u

    Reply
    Posted by: neha s.
    August 1, 2013 - 6:14 AM

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