Super-resolution Imaging van de bacteriële Division Machinery

Published 1/21/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

We beschrijven een super-resolutie beeldvorming methode om de structurele organisatie van de bacteriële FtsZ-ring, een essentieel inrichting voor celdeling sonde. Deze methode is gebaseerd op kwantitatieve analyses van fotogeactiveerde lokalisatie microscopie (PALM) beelden en kan worden toegepast op andere bacteriële cytoskeleteiwitten.

Cite this Article

Copy Citation

Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bacteriële celdeling vereist de gecoördineerde verzameling van meer dan tien essentiële eiwitten op midcell 1,2. Centraal in dit proces is de vorming van een ringvormige suprastructuur (Z-ring) van de FtsZ eiwit op perceelsgrenzen 3,4. De Z-ring uit meerdere enkelstrengs FtsZ protofilamenten en begrijpen van de opstelling van de protofilamenten in de Z-ring inzicht in het mechanisme van Z-ringarmatuur en zijn functie als krachtgenerator 5,6. Deze informatie is moeilijk te realiseren vanwege huidige beperkingen in conventionele fluorescentie microscopie en elektronenmicroscopie. Conventionele fluorescentiemicroscopie staat is een hoge resolutie van de Z-ring door de diffractielimiet van licht (~ 200 nm) te verschaffen. Electron cryotomographic beeldvorming heeft gedetecteerd verspreid FtsZ protofilamenten in kleine C. crescentus cellen 7, maar is moeilijk toepasbaar op grotere cellen zoalsE. coli of B. subtilis. Hier de toepassing van een super-resolutie fluorescentie microscopie methode beschrijven, fotogeactiveerde Localization Microscopy (PALM) kwantitatief kenmerken de structurele organisatie van de E. coli Z-ring 8.

PALM beeldvorming biedt zowel een hoge ruimtelijke resolutie (~ 35 nm) en specifieke etiketteringsvoorschriften om eenduidige identificatie van doeleiwitten mogelijk te maken. We gelabeld FtsZ de fotoactiveerbare fluorescerend eiwit mEos2, die van groene fluorescentie (excitatie = 488 nm) schakelt rode fluorescentie (excitatie = 561 nm) bij activering bij 405 nm 9. Tijdens een PALM experiment, worden enkele FtsZ-mEos2 moleculen stochastisch geactiveerd en de bijbehorende zwaartepunt posities van de individuele moleculen worden bepaald met <20 nm precisie. Een super-resolutie afbeelding van de Z-ring wordt vervolgens gereconstrueerd door superpositie van het zwaartepunt posities van alle gedetecteerde FtsZ-mEos2 moleculen.

<p class = "jove_content"> Met deze methode is dat de Z-ring een vaste breedte van ~ 100 nm heeft en bestaat uit een losse bundel FtsZ protofilamenten die met elkaar overlappen in drie dimensies. Deze gegevens fungeren als aanknopingspunten voor verder onderzoek van de celcyclus afhankelijke veranderingen van de Z-ring 10 en kan worden toegepast op andere eiwitten van belang.

Protocol

1. Monstervoorbereiding

  1. Inoculeren LB media met een enkele kolonie van stam JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Groeien overnacht in een shaker bij 37 ° C.
  2. Verdun de kweek 1:1.000 in M9 minimaal medium + [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM aminozuren en vitaminen] en groeien tot mid-log fase (OD600 = 0.2 tot +0,3) in aanwezigheid van chlooramfenicol (150 ug / ml) bij kamertemperatuur (RT).
  3. Laten cultuur met 20 uM IPTG gedurende 2 uur (zie opmerking # 1).
  4. Korrelkweek in microcentrifuge (8.000 rpm, 1 min) en resuspendeer in een gelijk volume M9 +; repeat. Na de tweede resuspensie verder groei bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
  5. Fix geïnduceerde cultuur met 4% paraformaldehyde in PBS (pH = 7,4) bij kamertemperatuur gedurende 40 minuten. Korrelkweek en resuspendeer in een gelijk volume PBS; repeat. Als beeldvorming levende cellen, sla fixatie, pellet cultuur, en resuspendeer met een gelijk volumevan M9 - [M9 zouten, 0,4% glucose, 2 mM MgSO4, 0,1 mM CaCl2, MEM Amino Acids]; herhalen.
  6. Verdun gouden kralen 1:10 met geresuspendeerde cultuur. Breng monster aan geprepareerde beeldvorming kamer (zie stap 2.4).

[1] Opmerking: De bovenstaande inductie-protocol (stappen 1.1 tot 1.3) is geoptimaliseerd voor de expressie systeem van stam JB281. Gedetailleerde inductie voorwaarden kunnen verschillen voor andere expressiesystemen of eiwitten van belang.

2. Vergadering van de Imaging Kamer

  1. Een 3% (w / v) agarose oplossing M9 -. Smelt agarose bij 70 ° C in een bench-top warmte blok voor 40min. Store gesmolten agarose bij 50 ° C gedurende 5 uur.
  2. Een schone microaqueduct dia in de bovenste helft van de beeldkamer met de elektroden naar beneden. Lijn de onderste pakking op de dia microaqueduct teneinde de perfusie kanalen omvatten.
  3. Toepassing ~ 50 pi van het gesmolten agarose aan het midden van de ruitglijbaan. Onmiddellijk boven de agarosegel druppeltje met een schone, droge dekglaasje aan. Laat de gel bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten stollen.
    1. Om coverslips reinigen: regelen dekglaasjes in een keramische houder en ultrasone trillingen gedurende 20 min in roterende baden aceton, ethanol en 1M KOH in glazen potten. Herhalingscyclus drie keer voor een totaal van 9 sonications, gevolgd door een sonicatie in dH 2 O. Bewaar de gereinigde dekglaasjes in verse dH 2 O. Voor gebruik föhnen dekglaasjes met gefilterde lucht.
  4. Verwijder voorzichtig het dekglaasje en laat gel pad op de microaqueduct dia. Voeg onmiddellijk 1 ul celkweek monster (zie stap 1.6) naar de top van het gelkussen. Wacht tot 2 minuten, waardoor oplossing worden geabsorbeerd door het gelkussen. Top gel pad met een nieuwe, schone, droge dekglaasje aan. Monteer het geheel beeldkamer volgens instructies van de fabrikant.

3. Image Acquisition

  1. Zet de microscoop, camera en lasers. Open Metamorph zachtesoftware (Molecular Devices).
  2. Passende excitatie / emissie filters in de beeldvormende baan volgen (figuur 1).
  3. Dienovereenkomstig instellen laser bevoegdheden en overname-instellingen.
    1. 488-nm laser = 15 mW (zie opmerking # 2)
    2. 561-nm laser = 75 mW
    3. 405-nm laser = 2 mW ± grijsfilter (Zie noot # 3)
  4. Vergrendel beeldvorming kamer in het stadium via de complementaire fase adapter.
  5. Een passende beeldvorming regio (100x100 pixel) die homogeen wordt verlicht door alle drie lasers.
  6. Identificeer een monster gebied dat zowel cellen en de vaste markers (goud kralen) in de nabijheid, maar niet overlappen bevat.
  7. Richten op het oppervlak van cellen het dichtst bij het dekglaasje. Een aan te schaffen helderveld beeld met 50 ms integratietijd en de focus 0,5 micrometer in het monster (figuur 3Ai).
  8. Acquire ensemble groene fluorescentie beeld met excitatie van het 488-n m laser met behulp van een 50 ms integratietijd (Figuur 3Aii).
  9. Acquire streaming video in rode kanaal met continue verlichting van 405-nm en 561-nm lasers. Voor vaste cellen, wordt een 50 ms frame rate gebruikt voor een totaal van 20.000 frames (~ 17 min in totaal) met de 405-nm laser vermogen opgevoerd met ~ 10% per 1.000 frames (zie noot # 4). Voor levende cellen wordt een 10 ms frame rate voor een totaal van 3000 frames (~ 30 s totaal) bij een constante 405-nm laservermogen.
  10. Verplaats de focus naar het ondervlak van de cellen en verkrijgen een helderveld beeld als in stap 3.7.

[2] Opmerking: de geïntegreerde intensiteit van de groene fluorescentie van een cel is recht evenredig met het totale aantal FtsZ-mEos2 moleculen die in de cel. De 488-nm excitatie vermogen en ensemble fluorescentie verkrijging instellingen moeten worden constant gehouden voor alle cellen zodat de relatieve FtsZ-mEos2 expressieniveaus in verschillende cellen kunnen worden vergeleken.

NHOUD "> [3] Opmerking:. gefixeerde cellen worden afgebeeld met de neutrale densiteit (ND) filter (figuur 1, optische component # 5) in plaats om een langzame activering snelheid zodat elk molecuul nauwkeurig worden geïdentificeerd bereiken The ND filter wordt verwijderd bij beeldvorming levende cellen om de activering te verhogen met behoud van een lage waarschijnlijkheid van twee moleculen gelijktijdig geactiveerd in een buigingsbegrensde gebied. Hoe sneller tarief voor levende cellen beeldvorming nodig om de totale acquisitietijd verminderen, waarbij "bevriezen" van de Z-ring in tijd en beperken van het effect van zonbeschadigde de cel.

[4] Opmerking: Het aantal verkregen frames geoptimaliseerd voor ons systeem en zijn afhankelijk van de specifieke celstructuur, etikettering dichtheid activeringscijfer en of uitputting van de gehele pool van fluoroforen is belangrijk voor de analyse. In levende cellen, is het belangrijk om een ​​voldoende aantal gelokaliseerde verkrijgen als korte periode van time mogelijk aan de vervaging van het beeld door beweging van de celstructuur voorkomen.

4. PALM Afbeelding Bouw

  1. Bepaal zwaartepunt positie van elke gedetecteerde plek.
    1. Laad de afbeelding stapel in Matlab (MathWorks, Inc).
    2. Snijd de afbeelding stapel om een ​​gebied rond een cel die alle de vaste kralen uitsluit.
    3. Selecteer een intensiteitdrempel voor spot detectie die boven het achtergrondniveau, maar minder dan de gemiddelde intensiteit spot. We vertegenwoordigen de variatie in achtergrondniveau gedurende een experiment door berekening van het lopende gemiddelde van de maximale intensiteit met een 150 framevenster. De intensiteitdrempel voor elk frame wordt dan geïnterpoleerd uit de lopende gemiddelde waarden.
    4. Trek de drempel van elk frame. Toekomstige spots worden geïdentificeerd als drie aangrenzende pixels met intensiteit boven de drempel.
    5. Plaats de fluorescentie-intensiteit van elke potentiële plek voor een tweedimensionale Gaussian functie [Equation # 1] met een niet-lineaire kleinste kwadraten-algoritme (Figuur 2). De lokalisatie nauwkeurigheid van elke spot wordt berekend volgens het aantal gedetecteerde fotonen [Equation # 2]. Een slecht-fit spot met een lokalisatie nauwkeurigheid groter dan 20 nm (gefixeerde cellen) of 45 nm (levende cellen) wordt verwijderd (zie Note # 5). Elke vlek met een intensiteit groter dan twee maal de gemiddelde intensiteit, mogelijk als gevolg van overlappende emitters, ook weggegooid.
    6. Voor gefixeerde cellen verwijderen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul door zonder enige vlek waarvan zwaartepunt positie binnen 45 nm van andere plek die voorafgegaan door 6 frames of minder. Voor levende cellen zijn alle spots behouden.
  2. Kalibreer monster drift met referentiemerkteken beweging.
    1. Snijd een 10x10 pixel regio rond een referentiemerkteken.
    2. Trek de drempel bepaald in 4.1.3 van elk frame.
    3. Plaats de intensiteit profiel in elkeframe via kleinste kwadraten fitting algoritme uitgaande van een tweedimensionale Gauss vorm.
    4. Bereken verplaatsing tussen zwaartepunt posities ten opzichte van frame 1.
  3. Corrigeer het zwaartepunt positie van elke unieke molecuul geïdentificeerd in 4.1 met de juiste sample drift berekend in 4.2. Vergelijk de helderveld beelden verkregen in 3.7 en 3.10. Als cellen worden waargenomen ten opzichte van het referentiemerkteken markers, worden de gegevens weggegooid.
  4. Lijn alle gecorrigeerde zwaartepunt posities op een enkel beeld bestaat uit 15x15 pixels nm. Teken de unieke molecule als eenheid-gebied tweedimensionale Gaussische profiel gecentreerd op de centroïde positie met een standaarddeviatie gelijk aan de lokalisatie precisie [Equation # 2]. Dit resulteert in een waarschijnlijkheidsdichtheid kaart, waarbij een pixel intensiteit evenredig is het waarschijnlijk dat een molecuul dat pixel (figuur 3Aiv).
  5. Vergelijken PALM beelden naar ensemble beelden.
    1. Replot het centroid posities in 4.4, maar op een vliegtuig met 150x150 pixels nm en een standaarddeviatie gelijk aan 250 nm. Dit genereert een PALM beeld dat een buigingsbegrensd beeldveld dat kan worden gebruikt om te vergelijken met de buigingsbegrensde, ensemble beeld verkregen in 3.8 (figuur 3Aiii) nabootst.
    2. Om te bevestigen dat de gedetecteerde moleculen representatief zijn voor de hele bevolking, vergelijk de gereconstrueerde ensemble (Figuur 3Aiii, stap 4.5.1) met de experimentele ensemble fluorescentie beeld (Figuur 3Aii, stap 3,8) om te bevestigen dat de beide beelden structuren met een soortgelijke vorm geven , oriëntatie en relatieve intensiteit.

[5] Opmerking: De minimaal vereiste nauwkeurigheid lokalisatie werd empirisch bepaald voor elke beeldvormingswerkwijze getrokken waarbij de precisie van alle moleculen van een gegeven monster en selecteren van een geschikt cutoff.

5. PALM Beeldanalyse

  1. Het meten van Z-Ring Width en diameter.
    1. Draai de PALM beeld om verticaal oriënteren van de lengteas van de cel (Figuur 4A).
    2. Snijd de cellulaire gebied dat de Z-ring.
    3. Bereken de cumulatieve intensiteit door het projecteren van een intensiteit profiel langs lang de cel as.
    4. Monteer de intensiteit profiel naar een Gaussische verdeling. De ring breedte wordt gedefinieerd als de volle breedte half maximum (FWHM) van de gemonteerde Gaussische verdeling (figuur 4B).
    5. Project de cumulatieve intensiteit profiel van 5.1.2 langs korte van de cel-as. De ring diameter wordt gedefinieerd als de volledige lengte van het intensiteitsprofiel (Figuur 4C).
  2. Plotten FtsZ Dichtheid (zie noot # 6).
    1. Replot het zwaartepunt posities zoals in (4.4), maar zonder de Gaussian profiel zodat elke unieke molecule wordt een waarde van 1 gegeven en aan een enkele pixel op de centroïde positie. Op deze manier de intensiteit van elkepixel is het totale aantal moleculen ontdekt dat pixel. De Density PALM afbeelding kan ook worden gevisualiseerd als een contour plot (Figuur 5E).
  3. Het bepalen van Ruimtelijke resolutie.
    1. Theoretisch haalbare ruimtelijke resolutie: een vertegenwoordiger PSF voor het gehele monster met de gemiddelde precisie bepaald lokalisatie van alle ontdekte moleculen en bereken de FWHM (vergelijking # 3).
    2. Experimenteel ruimtelijke resolutie verkregen: bereken het gemiddelde verplaatsing tussen herhaalde waarnemingen van hetzelfde molecuul.

[6] Opmerking: Wij gebruikten totale interne reflectie PALM (TIR-PALM figuur 1 en 5) om de activering en excitatie een dunne laag (~ 200 nm) boven de cel / glas-interface beperken. zodat alleen FtsZ moleculen geassocieerd met de membraan die het dichtst bij het dekglaasje worden gedetecteerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In figuur 3Aiv een tweedimensionale superresolutie weergave van de Z-ring gegenereerd uit de PALM imaging hierboven beschreven werkwijze. Hieronder vatten we kwalitatieve en kwantitatieve informatie die kan worden verkregen van hen.

Kwalitatief we vast dat de Z-ring is een onregelmatige structuur die verscheidene configuraties (een band of spiraalvormige boog) die niet te onderscheiden in conventionele fluorescentiebeelden (vergelijk Figuur 3A-Dii en iv) vaststelt. Waarnemingen zoals deze kunnen worden gebruikt om het percentage van de celpopulatie die een bepaalde structurele configuratie weergegeven bepalen.

We kunnen ook kwantitatief meten van de afmetingen van de Z-ring. Onze benadering voor de bepaling van de ring breedte en diameter zijn beschreven in stap 5.1 en in figuur 4. Uit figuur 4B, de ring breedte was detmet hermelijn getooid om 113 nm (FWHM). Deze waarde is groter dan de verwachte breedte van een FtsZ protofilament (5-10 nm gebaseerd op in vitro EM 11). In Figuur 4C, is de ring diameter gemeten 1.050 nm. Deze diameter kan worden gebruikt om kwantitatief beschrijven vernauwingsgraad tijdens de celdeling.

Een kwantitatieve benadering is het molecuul dichtheid berekend door het tellen van het aantal moleculen gelokaliseerd binnen een bepaald gebied. De dichtheidsmeting geeft informatie over hoe dicht moleculen zijn verpakt in de structuur. Molecule dichtheid kan worden beschreven in zowel relatief als absoluut. Relatieve dichtheid (bijv. fractie van moleculen in de Z-ring ten opzichte van de hele cel) geeft informatie over de verdeling van moleculen in verschillende cellulaire regio. Absolute dichtheidsmeting wordt bemoeilijkt door het feit dat de PALM (Figuur 3Aiv) eigenlijk een 2D-projectievan een 3D-object. Om deze complicatie te omzeilen, maken we gebruik TIR-PALM, waarbij de detectie vliegtuig beperkt tot een enkele zijde van de Z-ring. De resulterende gegevens worden weergegeven in Figuur 5E. Aangezien de uitgezette moleculen vertegenwoordigen een deel van de totale bevolking FtsZ bepaald de dichtheid is een ondergrens van de werkelijke dichtheid. De maximale dichtheid waargenomen in de TIR beelden van de Z-ring suggereren dat sommige delen bevatten overlappende protofilamenten 10.

Figuur 1
Figuur 1. Een vereenvoudigd schema van onze microscoop setup. Alle drie lasers worden bestuurd door een aangepaste beeldvorming ontwikkeld in Metamorph die nauwkeurige controle over de juiste excitatiegolflengte maakt. De donkere grijze lijn geeft het excitatielicht pad, terwijl de lichtgrijze lijn geeft de emissie-pad. Voor totale interne reflection (TIR) ​​microscopie wordt de instelbare platform loodrecht vertaald naar het lichtpad zodat de invalshoek te veranderen.

Figuur 2
Figuur 2. Een samenvatting van de PALM methode. In eerste instantie zijn alle FtsZ-mEos2 moleculen zijn in de groene fluorescentie staat. Bij blootstelling aan continue belichting door de lasers 405 en 561, zijn enkele moleculen stochastisch omgezet in de rode fluorescentie staat. De snelheid van dit proces wordt bepaald door de kracht van de laser 405, terwijl het fotobleken wordt bepaald door het vermogen van zowel de 405 en de 561 laser. Idealiter wordt de mate van activering en fotobleken evenwicht zodanig dat slechts een molecuul wordt gedetecteerd per frame. Zodra voldoende aantal frames worden verkregen, worden de beelden verwerkt door het plaatsen Matlab elk bepaald punt als beschreven in stap 4.1. Elke unique molecuul wordt vervolgens uitgezet (stap 4.4) op een vlak, waardoor het genereren van een PALM beeld hier in pseudo-rode kleur zijn. Het frame rode omtrek werd bepaald herhaling spot bevatten van dezelfde molecule als het voorgaande frame en is derhalve niet tijdens de bouw van de PALM beeld.

Figuur 3
Figuur 3. Representatieve beelden van vaste (A en B) en live (C en D) cellen die FtsZ-mEos2. Voor alle cellen, kunnen de omtrek en algemene vorm worden gevisualiseerd in de helder veldbeeld (i). Ensemble fluorescentiebeelden (ii) worden met excitatie van de laser 488 (stap 3,8) en vertegenwoordigen de distributie van de gehele pool van FtsZ-mEos2. Het ensemble beeld gereconstrueerd uit de PALM gegevens (iii, stap 5.4) geeft een kwalitatieve controle voor trouwe van de methodevoorstelling van de werkelijke ensemble structuur. De gegenereerde PALM beeld (iv) is de som van alle unieke FtsZ-mEos2 lokalisaties en vertegenwoordigt een kansdichtheid kaart voor FtsZ-mEos2. De cel omtrek wordt weergegeven door de stippellijn in gele beelden iii en iv. Cellen A en C tonen FtsZ in een band conformatie, terwijl cellen B en D tonen FtsZ aanneming spiraalvormige conformatie boog, die detecteerbaar is in de buigingsbegrensde ensemble beeld (iii). Scale bars, 500 nm.

Figuur 4
Figuur 4. A. Een PALM beeld geeft schematische voorstellingen van Z-ring breedte (rood) en Z-ring diameter (groen). B. Ringbreedte wordt berekend door het aanbrengen van de geprojecteerde intensiteitsprofiel (blue X) langs de lange as van de cel met een Gaussische functie (gray lijn) en vervolgens het bepalen van de FWHM (rode stippellijn). Hier werd de ring breedte bepaald op 113 nm. C. Ring diameter wordt bepaald door de eerste uitstekende intensiteitsprofiel langs de korte as van de cel en het bepalen van het volledige lengte (groene stippellijn) van het intensiteitsprofiel boven nul. De diameter van de Z-ring werd bepaald op 1050 nm.

Figuur 5
Figuur 5. TIR-PALM de nauwkeurige telling van moleculen. Zoals in figuur 3 zijn de helder veldbeeld (A), ensemble fluorescentiebeeld (B), gereconstrueerde ensemble fluorescentiebeeld (C) en PALM beeld (D) geïllustreerd voor een bepaalde cel die FtsZ-mEos2. Dezelfde gegevens die worden gebruikt om D te construeren wordt opnieuw geplot als een contour plot van molecuul density (moleculen per pixel) in E. Van deze dichtheid analyse werd FtsZ-mEos2 bepaald maximaal aanwezig in 8 moleculen per pixel. Omdat een enkele laag FtsZ protofilamenten zou leiden tot een maximale dichtheid van 5 moleculen per pixel 10, deze analyse blijkt dat de Z-ring bestaat uit meerdere lagen FtsZ protofilamenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PALM beelden bevatten informatie over molecule telt en posities binnen een cel, waardoor gedetailleerde analyse van de verdeling en plaatsing van doeleiwit moleculen die moeilijk te bereiken met andere middelen. Hieronder geven we een overzicht van voorzorgsmaatregelen die moeten worden genomen om accurate kwantitatieve informatie halen met behoud van de biologische relevantie van PALM beelden. We verkennen ook de informatie die het best kan worden verkregen met behulp van live vs vaste cellen. Tot slot raden we mogelijkheden voor het verkrijgen van aanvullende super-resolutie informatie over de celdeling machines.

De hierboven beschreven werkwijze werd geoptimaliseerd om accurate PALM beelden bij de volgende manieren. Eerste en geoptimaliseerd kenmerk we de functionaliteit van het fusieproteïne te zorgen dat het dient als een betrouwbare marker van Z-ringstructuur 10. Tweede afgestemd we de expressie van het fusie-eiwit omdat zowel over-en onder-expressieresultatenin afwijkende structuurvorming 10,12,13. Ten derde hebben we gekozen drempels voor unieke molecuul bepalen (stap 4.1.5) op basis van fluorofoor photoblinking eigenschappen 14. Photoblinking bemoeilijkt het bepalen van de unieke moleculen en bij niet-inachtneming, leidt tot overcounting van afzonderlijke moleculen. Hoewel overcounting laat dimensie metingen, is het versterken absolute dichtheidsmetingen en het uitzicht van valse clusters maken. Al deze factoren moeten zorgvuldig worden overwogen bij de toepassing van deze methode om andere eiwitten van belang.

De selectie van levende of gefixeerde cellen imaging afhankelijk van de gewenste informatie en verwerkingscapaciteit. Live-cell imaging is snel (30 s), maar alleen rapporten over lokaliseerbare (dwz traag) moleculen. Dit betekent gewoonlijk dat alleen membraangebonden moleculen waargenomen in levende cellen, terwijl gefixeerde cellen informatie over alle gemerkte moleculen. Live-cell imaging provides hoge resolutie dagmaat en morfologie, maar kan geen accurate molecule densiteitsmetingen door de beweging van individuele moleculen. Vaste cel afbeeldingen kunnen bieden al deze informatie, maar vereisen lage UV-activering niveau, zodat unieke moleculen kunnen worden geïdentificeerd. Dit leidt tot langere tijden imaging (> 15 min). Bovendien kan fixatie tot structurele afwijkingen. Al deze factoren moeten worden afgewogen bij het kiezen van welk monster typen te gebruiken.

De werkwijze PALM wij hebben beschreven biedt superresolutie details van de Z-ring structuur die kan worden vergeleken tussen verschillende stammen, celcyclus staten en groeiomstandigheden. Implementatie van recente technologische ontwikkelingen kunnen een toegevoegde inzicht in de cytokinetische mechanisme van de Z-ring. Bijvoorbeeld bij invoering astigmatisme in het detectiepad is de eenvoudigste manier om driedimensionale vermogen (~ 100 nm resolutie z) aan de optische opstelling illustbeoordeeld in Figuur 1 15. Ook gelijktijdig afbeelden van twee of meer eiwitten tegelijkertijd is een realistische optie met de snelle opkomst van spectraal-activeerbare verschillende fluorescerende eiwitten. Tenslotte de ontwikkeling van een fluorescent eiwit dat photoactivates in een UV-onafhankelijke wijze zou langdurige controle van een cel mogelijk maken zonder het genereren van DNA schade geïnduceerd door 405 nm verlichting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen belangenconflicten verklaard.

Acknowledgements

Grant: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 x MEM Amino Acids Sigma M5550
100 x MEM Vitamins Sigma M6895
IPTG Mediatech 46-102-RF
16% Paraformaldehyde Electron Micrsocopy Sciences 15710-S
SeaPlaque GTG Agarose Lonzo 50111
50 nm Gold Beads Microspheres-Nanospheres 790113-010
FCS2 Imaging Chamber Bioptechs
Stage Adaptor ASI I-3017
Inverted Microscope Olympus IX71
1.45 NA, 60x Objective Olympus
IXON EMCCD Camera Andor Technology DU897E
488-nm Sapphire Laser Coherent
561-nm Sapphire Laser Coherent
405-nm CUBE Laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
  2. de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
  3. Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
  4. Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
  5. Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
  6. Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
  7. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  10. Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. (2010).
  11. Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. (2007).
  12. Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
  13. Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
  14. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats