Super-upplösning avbildning av de bakteriella Division Maskin

Published 1/21/2013
0 Comments
  CITE THIS  SHARE 
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





By clicking "Submit", you agree to our policies.

 

Summary

Vi beskriver en super-upplösning avbildningsmetod att sondera den strukturella organisationen av bakteriella FtsZ-ringen, en väsentlig anordning för celldelning. Denna metod är baserad på kvantitativa analyser av fotoaktiverade (Palm) lokalisering mikroskopi bilder och kan tillämpas på andra bakteriella cytoskelettproteiner.

Cite this Article

Copy Citation

Buss, J., Coltharp, C., Xiao, J. Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery. J. Vis. Exp. (71), e50048, doi:10.3791/50048 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bakteriell celldelning kräver samordnade montering av mer än tio viktiga proteiner vid midcell 1,2. Centralt för denna process är bildandet av en ringliknande suprastructure (Z-ring) av FtsZ protein vid delningsplanen 3,4. Z-ringen består av flera enkelsträngade FtsZ protofilament, och förstå arrangemanget av protofilament inuti Z-ringen kommer att ge insikt i mekanismen av Z-ringenheten och dess funktion som en kraft generator 5,6. Denna information har varit svårfångade på grund av rådande begränsningar i konventionell fluorescensmikroskopi och elektronmikroskopi. Konventionell fluorescensmikroskopi inte kan tillhandahålla en högupplöst bild av Z-ringen på grund av diffraktionsgränsen ljus (~ 200 nm). Elektron cryotomographic avbildning har upptäckt spridda FtsZ protofilament i små C. crescentus celler 7, men är svår att tillämpa på större celler såsomE. coli eller B. subtilis. Här beskriver vi tillämpningen av en super-upplösning fluorescensmikroskopi metod för fotoaktiverade Lokalisering Mikroskopi (PALM), karakterisera kvantitativt den strukturella organisationen av E. E. coli Z-ringen 8.

PALM avbildning erbjuder både hög rumslig upplösning (~ 35 nm) och särskild märkning för att möjliggöra entydig identifiering av målproteiner. Vi märkt FtsZ med fotoaktiverbara fluorescerande proteinet mEos2, som växlar från grön fluorescens (excitation = 488 nm) till röd fluorescens (excitation = 561 nm) vid aktivering vid 405 nm 9. Under en PALM experiment är enkla FtsZ-mEos2 molekyler stokastiskt aktiveras och motsvarande centroid positioner enstaka molekyler bestäms med <20 nm precision. En super-upplösning av Z-ringen sedan rekonstrueras genom att lägga de centroida positioner alla upptäckta FtsZ-mEos2 molekyler.

<p class = "jove_content"> Med denna metod fann vi att Z-ringen har en fast bredd på ~ 100 nm och består av en lös bunt av FtsZ protofilament som överlappar varandra i tre dimensioner. Dessa data ger en språngbräda för fortsatta undersökningar av de osjälvständiga cellcykeln förändringar av Z-ringen 10 och kan tillämpas på andra proteiner av intresse.

Protocol

1. Provberedning

  1. Inokulera LB medium med en enda koloni av stam JB281 [BW25113 / pJB042 (P Lac: FtsZ-mEos2)]. Odla över natten i en skakapparat vid 37 ° C.
  2. Späd kulturen 1:1000 i M9 + minimala media [M9 Salter, 0,4% glukos, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaCl 2, MEM aminosyror och vitaminer] och växa till mitten av log-fasen (OD 600 = 0,2-0,3) i närvaro av kloramfenikol (150 | ig / ml) vid rumstemperatur (RT).
  3. Inducera kultur med 20 M IPTG under 2 timmar (se not # 1).
  4. Pellet kultur i mikrocentrifug (8.000 rpm, 1 min) och återsuspendera i en lika stor volym av M9 +; upprepa. Efter den andra resuspension fortsätta växa vid RT under 2 timmar.
  5. Fix inducerade kulturen med 4% paraformaldehyd i PBS (pH = 7,4) vid RT under 40 minuter. Pellet kultur och återsuspendera i en lika volym av PBS, upprepa. Om avbildning levande celler, hoppa fixering, pellets kultur och återsuspendera med lika stor volymav M9 - [M9 Salter, 0,4% glukos, 2 mM MgSO 4, 0,1 mM CaClz 2, MEM Aminosyror], upprepa.
  6. Späd guld pärlor 1:10 med återsuspenderade kultur. Applicera prov berett avbildning kammare (se steg 2,4).

[1] Observera: Ovanstående induktion protokollet (steg från 1,1 till 1,3) har optimerats för uttryck systemet stam JB281. Detaljerade induktionsbetingelser kan variera för andra uttryckssystem eller proteiner av intresse.

2. Montering av Imaging avdelningen

  1. Gör en 3% (vikt / volym) agaroslösning i M9 -. Smält agaros vid 70 ° C i en bänkbaserade värmeblock för 40 min. Lagra smälte agaros vid 50 ° C i upp till 5 timmar.
  2. Placera en ren microaqueduct bild i den övre halvan av det bildgivande kammaren med elektroderna nedåt. Rikta den nedre packningen på microaqueduct bilden för att täcka perfusionen kanalerna.
  3. Applicera ~ 50 | il av den smälta agarosen till mitten av glasetbild. Omedelbart topp agarosgelen droppen med en ren, torr täckglas. Låt gelén stelna vid rumstemperatur under 30 minuter.
    1. För att rengöra täckglas: ordna täckglas i en keramisk hållare och sonikera under 20 minuter i roterande bad aceton, etanol och 1 M KOH i glasburkar. Upprepa cykeln tre gånger, för totalt 9 sonications, följt av en enda sonikering i dH 2 O. Förvara de rengjorda täckglasen i färskt dH 2 O. Före användning, föna täckglas med filtrerad luft.
  4. Ta försiktigt bort täckglas, vilket gel pad på microaqueduct bilden. Omedelbart tillsätt 1 pl cellkultur prov (se steg 1,6) till toppen av gelén dynan. Vänta på ~ 2 minuter, så att lösningen absorberas av gelplattan. Topp gelplattan med en ny ren och torr täckglas. Montera hela avbildning kammaren enligt tillverkarens anvisningar.

3. Bild Förvärv

  1. Slå på mikroskop, kamera och laser. Öppna Metamorph mjukware (Molecular Devices).
  2. Lämpliga excitation / emission filter i bildbehandling vägen (figur 1).
  3. Ställ lasereffekter och inställningar förvärv därefter.
    1. 488-nm laser = 15 mW (se not nr 2)
    2. 561-nm laser = 75 mW
    3. 405-nm laser = 2 mW ± neutral densitet filter (Se not nr 3)
  4. Lås avbildning kammare i scenen via den kompletterande fas-adaptern.
  5. Utse en lämplig avbildning område (100x100 pixel) som homogent belyses av alla tre lasrar.
  6. Identifiera ett prov område som innehåller både celler och referenspunkter markörer (guld pärlor) i omedelbar närhet men inte överlappande.
  7. Fokus på ytan av celler närmast täckglaset. Förvärva en brightfield bild med 50 ms integreringstid och flytta fokus 0,5 um i provet (Figur 3Ai).
  8. Förvärva ensemble grön fluorescens bild med excitering från 488-N m laser med hjälp av en 50 ms integreringstid (Figur 3Aii).
  9. Förvärva strömmande video i röd kanal med kontinuerlig belysning från 405-nm och 561-nm lasrar. För fasta celler, en 50 ms ram som används för totalt 20.000 ramar (~ 17 min totalt) med 405-nm lasereffekt ramped med ~ 10% var 1.000 ramar (se not nr 4). För levande celler, är en 10 ms ram som används för totalt av 3.000 ramar (~ 30 s totalt) vid en konstant 405-nm lasereffekt.
  10. Flytta fokus tillbaka till den undre ytan av cellerna och förvärva ett annat brightfield bild såsom i steg 3,7.

[2] Observera: Den integrerade intensiteten av den gröna fluorescensen av en cell är direkt proportionell mot det totala antalet FtsZ-mEos2 molekyler som uttrycks i cellen. Den 488-nm excitation kraft och ensemble fluorescens inställningar förvärv bör hållas konstant för alla celler så att den relativa FtsZ-mEos2 kan uttrycksnivåer i olika celler jämföras.

ontent "> [3] Obs:. Fasta celler avbildas med Neutral Density (ND)-filter (figur 1, optisk komponent # 5) på plats för att uppnå en långsam aktiveringsgraden så att varje enskild molekyl exakt kan identifieras Den ND-filtret tas bort när avbildning levande celler för att öka aktiveringsgraden, samtidigt som en låg sannolikhet för två molekyler aktiveras samtidigt i en diffraktionsbegränsad område. tillämpas för live-cell imaging Den snabbare behövs för att minska den totala förvärvet tiden, därigenom "frysa" Z-ringen i tid och begränsa effekten av fotoskador till cellen.

[4] Observera: Antalet förvärvade ramar optimerades för vårt system och är beroende på den speciella cellulära strukturen, märkning densitet, aktiveringsgraden och huruvida ansträngande hela pool av fluoroforer är viktig för analys. I levande celler, är det viktigt att få ett tillräckligt antal lokaliseringar på så kort tid TImig som möjligt för att undvika suddiga i bilden på grund av förflyttning av den cellulära strukturen.

4. PALM Bild Konstruktion

  1. Bestäm centroid positionen för varje upptäckt plats.
    1. Ladda bildstapel i Matlab (MathWorks, Inc.).
    2. Beskära bilden stacken till ett område runt en cell som utesluter alla referenspunkter pärlor.
    3. Välj en intensitet tröskel för spot upptäckt som ligger över bakgrundsnivån, men under genomsnittet plats intensitet. Vi står för variationen i bakgrundsnivån under ett experiment genom att beräkna det löpande medelvärdet av maximal intensitet med en 150 ram fönster. Intensiteten Tröskeln för varje ram därefter interpoleras från de löpande medelvärdena.
    4. Subtrahera motsvarande tröskelvärde från varje bildruta. Blivande fläckar identifieras som tre angränsande pixlar med intensiteter över tröskeln.
    5. Montera fluorescensintensiteten hos varje blivande plats till en tvådimensionell GaussiaN-funktionen [Ekvation # 1] med användning av en ickelinjär minsta kvadrat-algoritmen (figur 2). Lokaliseringen precision varje fläck beräknas med användning av det totala antalet detekterade fotoner [Ekvation # 2]. Varje dåligt fit plats med en lokalisering precision som är större än 20 nm (fixerade celler) eller 45 nm (levande celler) kastas (se not # 5). Varje plats med en intensitet som är större än två gånger den genomsnittliga intensitet, möjligen på grund av överlappande sändare, är också kasseras.
    6. För fasta celler, ta bort upprepade observationer av samma molekyl genom att bortse från någon plats som centroida position inom 45 nm någon annan plats som föregick den med 6 ramar eller mindre. För levande celler, alla fläckar kvar.
  2. Kalibrera prov avdrift med förankringsmarkör rörelse.
    1. Skär bort en 10x10 pixel region runt en förankringsmarkör.
    2. Subtrahera motsvarande tröskelvärde bestäms i 4.1.3 från varje ram.
    3. Montera intensiteten profilen i varjeramen via minst kvadrat passande algoritm antar en tvådimensionell Gauss form.
    4. Beräkna förskjutningen mellan centroiden lägen i förhållande till ram 1.
  3. Korrigera tyngdpunkten positionen för varje unik molekyl identifierats i 4,1 med lämpligt prov drift beräknas 4,2. Jämför brightfield bilderna förvärvade 3,7 och 3,10. Om celler observeras att röra sig relativt till de referenspunkter markörerna, data utkastad.
  4. Överlagra alla korrigerade centroid positioner på en enda bild som består av 15x15 nm pixlar. Rita varje unik molekyl som en enhet-område, tvådimensionell Gaussisk profil centrerad vid centroiden position med en standardavvikelse lika med lokalisering precisionen [Ekvation # 2]. Detta resulterar i en sannolikhet densitet karta, där en pixels intensitet är proportionell mot sannolikheten för att finna en molekyl i detta bildelement (figur 3Aiv).
  5. Jämföra PALM bilder till ensemble bilder.
    1. Replot Centroid positioner som i 4,4, men på ett plan med 150x150 nm pixlar och en standardavvikelse lika med 250 nm. Detta genererar en PALM bild som efterliknar en diffraktionsbegränsad bild, som kan användas för att jämföra med diffraktionsbegränsad, ensemble bild förvärvades 3,8 (figur 3Aiii).
    2. För att bekräfta att de detekterade molekylerna är representativa för hela befolkningen, jämföra den rekonstruerade ensemble bilden (Figur 3Aiii, steg 4.5.1) med den experimentella ensemblen fluorescens bild (figur 3Aii, steg 3,8) för att bekräfta att båda bilderna visar strukturer liknande form , orientering och relativ intensitet.

[5] Observera: Det minsta lokalisering precision bestämdes empiriskt för varje avbildningsmetod genom att plotta att precisera alla molekyler för ett givet prov och välja en lämplig cutoff.

5. PALM bildanalys

  1. Mätning Z-Ring Width och diameter.
    1. Rotera PALM bilden så att vertikalt orientera längdaxel cellen (figur 4A).
    2. Beskär ut den cellulära regionen med Z-ringen.
    3. Beräkna den kumulativa intensiteten genom att projicera en intensitet profil längs cellens längdaxel.
    4. Montera intensiteten profil till en normalfördelning. Ringen Bredden definieras som den fulla bredden halv maximal (FWHM) i den monterade Gaussfördelning (figur 4B).
    5. Projekt den kumulativa intensiteten profil 5.1.2 längs cellens korta axel. Ringen diametern definieras som den fulla längden av intensiteten profilen (figur 4C).
  2. Plottning FtsZ Densitet (se not # 6).
    1. Replot de centroida positioner som i (4,4), men utan gaussprofil så att varje unik molekyl ges ett värde av 1 och tilldelas till en enda pixel som motsvarar dess centroid läge. På detta sätt kan intensiteten för varjepixel representerar det totala antalet molekyler detekteras i detta bildelement. Den Densitet PALM bilden kan också visualiseras som en konturkurva (figur 5E).
  3. Bestämma rumslig upplösning.
    1. Teoretiskt-uppnåeliga spatial upplösning: skapa ett representativt PSF för hela provet med den genomsnittliga bestämd lokalisering precision alla upptäckta molekyler och beräkna FWHM (ekvation # 3).
    2. Experimentellt uppnått spatial upplösning: beräkna den genomsnittliga förskjutningen mellan upprepade observationer av samma molekyl.

[6] Observera: Vi använde total inre reflektion PALM (TIR-PALM, figur 1 och 5) för att begränsa aktivering och excitation till ett tunt lager (~ 200 nm) över cellen / glas gränssnitt. så att endast FtsZ molekyler associerade med membranet närmast täckglaset kommer att detekteras.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Illustreras i figur 3Aiv är en tvådimensionell, super-upplösning rendering av Z-ringen genereras från PALM avbildningsmetod beskrivits ovan. Nedan sammanfattar vi kvalitativa och kvantitativa uppgifter som kan erhållas från dem.

Kvalitativt, observerade vi att Z-ringen är en oregelbunden struktur som antar flera konfigurationer (enda band eller spiralformad båge) som inte kan särskiljas i konventionella fluorescensbilder (jämför figur 3A-Dii och iv). Iakttagelser som dessa kan användas för att bestämma procent av cellpopulationen som uppvisar en viss strukturell konfiguration.

Vi kan också kvantitativt mäta dimensionerna av Z-ringen. Vårt tillvägagångssätt för bestämning av ringen bredd och diameter beskrivs i steg 5,1 och visas i fig 4. Av figur 4B, var ringbredd DETermined vara 113 nm (FWHM). Detta värde är större än den förväntade bredden av en enda FtsZ protofilament (5-10 nm baserade på in vitro-EM 11). I figur 4C, är ringen diametern mätt som 1.050 nm. Denna diameter kan användas för att kvantitativt beskriva graden av sammandragning under celldelning.

En annan kvantitativ metod är att beräkna molekylen tätheten genom att räkna antalet molekyler lokaliserade inom ett definierat område. Densiteten mätning ger information om hur tätt molekylerna packas i strukturen. Molecule densitet kan beskrivas i både relativa och absoluta termer. Relativ densitet (t.ex. fraktion av molekyler i Z-ringen mot den hela cellen) ger information om fördelningen av molekyler i olika cellulära regioner. Absolut densitetsmätning kompliceras av det faktum att PALM bilden (figur 3Aiv) är faktiskt en 2D-projektionav ett 3D-objekt. För att kringgå denna komplikation, använder vi TIR-PALM, vilket begränsar detektionsplanet till en enda sida av Z-ringen. Resulterande data visas i fig 5E. Eftersom de plottade molekylerna utgör en delmängd av den totala FtsZ befolkningen är densiteten bestämd en lägre gräns av den faktiska densiteten. Den maximala densiteten observerades i TIR bilder av Z-ringen antyder att vissa sektioner innehåller överlappande protofilament 10.

Figur 1
Figur 1. En förenklad schematisk bild av vår mikroskop installationen. Alla tre lasrar styrs av ett anpassat bildprogrammet utvecklats i Metamorph som möjliggör exakt kontroll över den lämpliga excitationsvåglängden. Den mörkgrå linjen indikerar sökvägen excitationsljus, medan den ljusgrå linjen anger utsläpp banan. För total inre RefleInsatser (TIR) ​​mikroskopi, är den justerbara plattformen översätts vinkelrätt mot ljusbanan, så att ändra infallsvinkeln.

Figur 2
Figur 2. En sammanfattning av PALM metoden. Inledningsvis alla FtsZ-mEos2 molekyler i det gröna-fluorescens tillstånd. Vid exponering till kontinuerlig belysning av de 405 och 561 lasrar är enstaka molekyler stokastiskt omvandlas till röd fluorescens staten. Graden av denna process bestäms av kraften hos 405 lasern medan fotoblekning hastigheten bestäms av makt både 405 och 561 laser. Idealt är graden av aktivering och fotoblekning balanseras på ett sådant sätt att endast en molekyl detekteras per ram. När ett tillräckligt antal ramar förvärvas är bilderna bearbetas i Matlab genom att passa varje identifierat plats som beskrivs i steg 4,1. Varje unique molekylen plottas sedan (steg 4,4) på ​​ett enda plan, vilket genererar en PALM bild, visas här i pseudo-röd färg. Ramen beskrivs i rött bestämdes innehålla en upprepning plats från samma molekyl som den föregående ramen och togs därför inte med under byggandet av PALM bilden.

Figur 3
Figur 3. Representativa bilder av fasta (A och B) och levande (C och D) celler som uttrycker FtsZ-mEos2. För alla celler, kan konturerna och allmänna form visualiseras i brightfield bilden (I). Ensemble fluorescens bilder (ii) förvärvas med excitation från 488 lasern (steg 3,8) och representerar fördelningen av hela poolen av FtsZ-mEos2. Ensemblen bilden rekonstrueras från PALM uppgifter (iii, steg 5,4) ger en kvalitativ kontroll av metodens trognarepresentation av den verkliga strukturen ensemble. Den genererade PALM bild (iv) är summan av alla unika FtsZ-mEos2 lokaliseringar och representerar en karta sannolikhetstäthet för FtsZ-mEos2. Den cellkontur representeras av den gula streckade linjen i bilderna III och IV. Celler A och C visar FtsZ i ett enda band konformation, medan cellerna B och D illustrerar FtsZ anta en spiralformad båge konformation, vilket är odetekterbart i diffraktionsbegränsad bild ensemble (iii). Skala barer, 500 nm.

Figur 4
Figur 4. A. En PALM bild som visar schematiska representationer av Z-ringens bredd (röd) och Z-ringdiameter (grön). B. ring bredd beräknas genom inpassning av projicerade intensitetsprofilen (blå X) längs den långa axeln av cellen med en Gaussisk funktion (gray linje) och sedan bestämma FWHM (röd streckad linje). Här var ringbredd bestämdes till 113 nm. C. ring diameter bestäms genom att först projicera intensitetsprofilen utmed den korta axeln av cellen och därefter beräkna full längd (grön streckad linje) av intensiteten profilen över noll. Diametern av Z-ringen bestämdes till 1.050 nm.

Figur 5
Figur 5. TIR-PALM möjliggör noggrann räkning av molekyler. Liksom i figur 3, är de brightfield bilden (A), ensemble fluorescens bild (B), rekonstruerad ensemble fluorescens bild (C) och Palm bild (D) illustreras för en viss cell uttrycker FtsZ-mEos2. Samma data som används för att konstruera D ritas som en kontur tomt på molekyl Densitet (molekyler per pixel) i E. Från denna densitet analys var FtsZ-mEos2 bedöms vara maximalt närvarande vid 8 molekyler per pixel. Eftersom ett enda skikt av FtsZ protofilament skulle resultera i en maximal densitet av 5 molekyler per pixel 10, denna analys tyder på att Z-ringen består av flera lager av FtsZ protofilament.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

PALM bilder innehåller information om molekyl räknas och befattningar inom en cell, så detaljerad analys av spridning och arrangemanget av molekyler målprotein som är svår att uppnå på annat sätt. Nedan redogör vi försiktighetsåtgärder som bör vidtas för att extrahera exakt kvantitativ information samtidigt som biologisk relevans PALM bilder. Vi utforskar också den information som kan bäst erhållas med levande kontra fasta celler. Slutligen föreslår vi vägar för att erhålla ytterligare super-upplösning information om celldelning maskiner.

Den ovan beskrivna metoden var optimerad för att åstadkomma korrekta PALM bilder på följande sätt. Först, kännetecknad vi och optimerat funktionaliteten hos fusionsproteinet att säkerställa att den fungerar som en tillförlitlig markör av Z-ringstrukturen 10. Andra vi finjustera uttrycket av fusionsproteinet eftersom både över-och under-uttryck resultati avvikande strukturbildning 10,12,13. Tredje valde vi trösklar för unik molekyl bestämning (steg 4.1.5) på grundval av fluoroforenheter photoblinking egenskaper 14. Photoblinking komplicerar bestämning av unika molekyler och om anvisningen inte följs, leder till overcounting av enstaka molekyler. Även overcounting inte påverkar dimension mätningar inte förstärker det absoluta densitetsmätningar och kan ge sken av falska kluster. Alla dessa faktorer bör övervägas noga vid tillämpningen av denna metod till andra proteiner av intresse.

Valet av levande eller fixerade celler för avbildning beror på den önskade informationen och genomströmning. Live-cell imaging är snabb (30 s), men endast rapporter om lokaliserbara (dvs. långsamma) molekyler. Det betyder oftast att endast membran-associerade molekyler observeras i levande celler, medan fixerade celler ger information om alla märkta molekyler. Live-cell imaging provides högupplösta strukturella dimensioner och morfologi, men kan inte ge exakta mätningar molekyl densitet på grund av förflyttning av enskilda molekyler. Fasta cellbilder kan ge all denna information, men kräver låg UV-aktivering, så att unika molekyler kan identifieras. Detta leder till förlängda imaging gånger (> 15 minuter). Dessutom kan fixering orsaka strukturella avvikelser. Alla dessa faktorer bör vägas när du väljer vilken provtyp använda.

PALM metod vi har beskrivit ger super-upplösning detaljer Z-ringstrukturen som kan jämföras mellan olika stammar, cell-cykel stater, och odlingsbetingelser. Genomförande av de senaste tekniska framstegen kan ge ökad insikt i cytokinetic mekanismen av Z-ringen. Till exempel, införa astigmatism i att upptäcka vägen är det enklaste sättet att lägga till tredimensionella kapacitet (~ 100 nm z-upplösning) till den optiska inställningar ILLUSTrankade i figur 1 15. Också samtidigt avbildning av två eller flera proteiner samtidigt blivit ett realistiskt alternativ med den snabba framväxten av spektralt-skilda fotoaktiverbara fluorescerande proteiner. Slutligen skulle utvecklingen av ett fluorescerande protein som photoactivates i en UV-oberoende sätt ge långsiktig övervakning av en enda cell utan att generera DNA-skador som induceras av 405 nm belysning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga intressekonflikter deklareras.

Acknowledgements

Grant: 5RO1GM086447-02.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
50 x MEM Amino Acids Sigma M5550
100 x MEM Vitamins Sigma M6895
IPTG Mediatech 46-102-RF
16% Paraformaldehyde Electron Micrsocopy Sciences 15710-S
SeaPlaque GTG Agarose Lonzo 50111
50 nm Gold Beads Microspheres-Nanospheres 790113-010
FCS2 Imaging Chamber Bioptechs
Stage Adaptor ASI I-3017
Inverted Microscope Olympus IX71
1.45 NA, 60x Objective Olympus
IXON EMCCD Camera Andor Technology DU897E
488-nm Sapphire Laser Coherent
561-nm Sapphire Laser Coherent
405-nm CUBE Laser Coherent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Buddelmeijer, N., Beckwith, J. Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center. Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).
  2. de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase. Nature. 359, 254-256 (1992).
  3. Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ). J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).
  4. Bi, E. F., Lutkenhaus, J. FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli. Nature. 354, 161-164 (1991).
  5. Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).
  6. Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes. Science. 320, 792-794 (2008).
  7. Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division. Embo J. 26, 4694-4708 (2007).
  8. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
  9. McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein. Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).
  10. Fu, G., et al. In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM). Plos One. (2010).
  11. Huecas, S., et al. Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments. Biophys. J. (2007).
  12. Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).
  13. Dai, K., Lutkenhaus, J. The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).
  14. Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy. Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).
  15. Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy. Science. 319, 810-813 (2008).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats