Author Produced

Enkel och effektiv teknik för framställning av Testicular cellsuspensioner

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Ett nytt protokoll för mekanisk framställning av testikelcancer cellsuspensioner från gnagare material, undvika enzymer och rengöringsmedel, beskrivs. Metoden är mycket enkel, snabb, reproducerbar, och gör goda suspensioner kvalitets celler, som är lämpliga för flöde sortering och RNA-extraktion.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Rodríguez-Casuriaga, R., Folle, G. A., Santiñaque, F., López-Carro, B., Geisinger, A. Simple and Efficient Technique for the Preparation of Testicular Cell Suspensions. J. Vis. Exp. (78), e50102, doi:10.3791/50102 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Mammaliska testiklar är väldigt komplexa organ som innehåller över 30 olika celltyper, inklusive somatiska testikelceller och olika stadier av könsceller celler. Denna heterogenitet är en viktig nackdel om studiet av grunderna för däggdjur spermatogenes, som rena eller anrikade cellpopulationer i vissa skeden av spermier utveckling behövs för de flesta molekylära analyser 1.

Olika strategier såsom Staput 2,3, centrifugal elutriation 1, och flödescytometri (FC) har 4,5 använts för att erhålla anrikade eller renade testikulära cellpopulationer för att möjliggöra differentierade genuttrycksstudier.

Det krävs att cellerna är i suspension flesta anrikning / rening metoder. Helst ska cellsuspensionen vara representativa för den ursprungliga vävnaden, har en hög andel av livsdugliga celler och några multinucleates - som tenderar att bildas på grund av densyncytial karaktär av seminiferiepitel 6,7 - och saknar klumpar cell 1. Tidigare rapporter hade bevisat att testikel cellsuspensioner framställda genom en uteslutande mekanisk metod clumped lättare än trypsinerade ettor 1. Å andra sidan, enzymatiska behandlingar med RNAs och / eller disaggregerar enzymer såsom trypsin och kollagenas leder till specifika makromolekyler nedbrytning, vilket inte är önskvärt för vissa tillämpningar i efterföljande led. Den ideala processen ska vara så kort som möjligt och involvera minimal manipulation, för att uppnå ett gott bevarande av makromolekyler av intresse såsom mRNA. Nuvarande protokoll för framställning av cellsuspensioner från solida vävnader är oftast tidsödande, starkt operatörsberoende, och kan selektivt skada vissa celltyper 1,8.

Protokollet presenteras här kombinerar fördelarna med en mycket reproducerbar och extremt korta mekanisk uppdelning med enbsence av enzymatisk behandling, vilket leder till god suspensioner kvalitet cell som kan användas för flödescytometrisk analys och sortering 4, och dolda gen studier uttryck 9.

Protocol

Ett. Framställning av cellsuspensioner

  1. Offra provet som skall användas i enlighet med rekommendationerna från de specialiserade utskotten såsom IACUC eller motsvarande (i Uruguay, Nationella kommissionen för djurförsöksnämnden [CNEA]). I vårt fall var en överdos av pentobarbital administreras.
  2. Dissekera testiklarna följande standard godkända förfaranden och placera dem i en 96 mm glas petriskål på is, innehållande 10 ml iskall DMEM kompletterat med 10% kalvfosterserum.
  3. Ta tunica albuginea och skär decapsulated testiklar i fyrkantiga bitar av 2 - 3 mm på varje sida.
  4. Dessa bitar behandlas sedan i en Medimachine, en automatiserad mekanisk kvarn där vävnaden är uppdelad inuti en disponibel enhet innehåller en perforerad rostfri skärm och en metall rötor. För att göra detta, plats 1 ml kall kompletterat DMEM och 4 - 5 i dessa bitar i en 50 pm engångsenhet, slå på disaggregator och process för 50 sek följa de enkla instruktionerna från tillverkaren.
  5. Återskapa den resulterande cellsuspensionen från disaggregeringen enheten med hjälp av en 3 - 5 ml spruta utan nål.
  6. Filtrera genom ett 50 um nylonnät, tidigare indränkt med 0,5 ml kompletterat DMEM.
  7. Filtrera suspensionen igen med en blöt 25 mesh um nylon, och lägg på is.
  8. Räkna i ett Neubauer kammare och justera cellulära koncentrationen till 1 - 2 x 10 7 celler / ml med kompletterat DMEM. Minst 4 x 10 7 celler / gram testikel material erhålles vanligtvis.
  9. Slutligen lägger NDA (2-naftol-6 ,8-disulfonsyra, dikaliumsalt) till en slutlig koncentration av 0,2% för att förhindra cellklumpning.
  10. Valfritt: Kontrollera cellviabiliteten av testikelcancer cellsuspensionerna med ett kommersiellt tillgängligt bärkraft kit för djurceller, enligt tillverkarens instruktioner.

2. Flödescytometrisk analys

ve_content "> Vi har använt en Becton-Dickinson FACSVantage flödescytometer utrustad med en Coherent argonjonlaser inställd att emittera vid 488 nm för analys av färgades cellerna med höga koncentrationer av propidiumjodid (PI). (Frågan om PI inträde i ofixerade celler under stress har behandlats någon annanstans 9,10).

  1. För PI färgning, tillsätt fluorokrom vid en slutlig koncentration av 50 ^ g / ml till cellsuspensionen, och inkubera under 10 min vid 0 ° C i mörker.
  2. Laser effekt sätts till 100 mW och ett 575/26 bandpassfilter används för att samla PI-emitterade fluorescensen i FL2.
  3. Vi utför FC mätningar med en 70 ìm munstycke. För sortering spermatocyte befolkningar, som sortering mode i Normal-R eller Normal-C, med hjälp av 3 sorterade droppar som kuvertet. Håll provet och rör insamling till 3 - 4 ° C med hjälp av ett kylaggregat. Anpassa provet differential för att analysera celler med en hastighet av 500 till 1500 per sekund.
  4. Använd CellQuest programvara (BD) för att analyseraföljande parametrar: Forward Scatter (FSC-H), sidospridning (SSC-H), total utsända fluorescens eller puls-område (FL2-A), och varaktigheten av fluorescensemission eller pulsbredd (FL2-W).

Alternativt har vi använt det vitala färgämnet Hoechst 33342 till en slutlig koncentration av 5 | ig / ml och inkuberades under 10 min vid 37 ° C i mörker. Cell analys utfördes med hjälp av en MoFlo Cytometer (DakoCytomation), utrustade med en UV excitationsvåglängd laser som arbetar vid 25 mW och med användning av en 70 | im munstycke. Data manipulation utfördes med Summit v4.3 programvara (DakoCytomation).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Ett exempel på en väl uppdelad cellsuspension från råtta testiklar framställda med det protokoll som beskrivs här visas i figur 1.

I jämförelse med enzymatiska behandlingar 6,8 och tidigare beskrivna mekaniska uppdelningsnivåer metoder 2, är det som presenteras här mycket snabbare, innebär mindre hantering, är lätt reproducerbar (ej operatörsberoende), och gör knappa cellsönderfall (särskilt jämfört med andra mekaniska metoder) och väldigt få multinucleates (som har beskrivits för att bilda som en följd av omfattande vävnad manipulation 1,2). Dessutom, i motsats till enzymatiska behandlingar, undviker det användningen av RNAs, trypsin och kollagenas, som skulle kunna gynna makromolekyler nedbrytning.

Å andra sidan, trots tidigare rapporter hade bevisat att testikel cellsuspensioner framställda genom en uteslutande mekanisk metod clumped lättare än trypsineras påes 1, framfört tillämpningen av föreliggande förfarande mycket lite clumping i de cellulära suspensioner, såsom kan ses i figur 1. I den meningen har vi funnit att införandet av NDA mycket effektiv i att förhindra cellklumpning, och undvika munstycket täpps under efterföljande flöde studier. Figur 1 visar också bristen på cellspillror, vilket också är tydligt i FC histogram som visas i figur 2.

Dessutom cellsuspensionerna framställda med denna metod visar en tillräcklig representation för de olika testikel celltyper. Detta avslutades genom att jämföra den cellulära sammansättningen av testikulära cellsuspensioner framställda genom den metod som presenteras här med dem som rapporteras från cellräkningar i tvärsektionerna av sädeskanalerna, och med cellsuspensioner framställdes med användning av andra metoder också (tabell 1).

FC histogram erhålls vid fjädring utarbetats av present protokoll och färgades antingen med Hoechst 33342 (Figur 2A) eller PI (Figur 2B) inte väsentligt skiljer sig från tidigare redovisade kära 8, stöder också antagandet att förfarandet inte selektivt skadar någon specifik celltyp.

Testicular celltyper baserade på DNA-innehåll Intakt testikel a (%) Medimachine - beredda suspensioner b (%) Trypsinerade suspensioner a (%)
A) Mus musculus
C 66,2 62,5 79,6
2C 16,4 18,4 7,3
4C </ Td> 17,9 18,7 8,7
Andra - - 4,6
B) Cavia porcellus
C 66,5 65,5 N / D
2C 11,0 11,5 N / D
4C 22,5 23,0 N / D
a Cellräkningar bedömdes av mikroskopisk observation.
Antalet B-celler bedömdes genom flödescytometri.

Tabell 1. Relativa procentsatser av vuxna testikulära cellpopulationer som skiljer sig i deras DNA-innehåll för cellsuspensioner från mus (A) och marsvin (B), framställt med presenteras härmed metod, jämfört med intakta testikel och - för mus - to trypsin-förberedda suspensioner (modifierad från Geisinger och Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010)). DNA-innehållet: C (runda och elongating spermatider, spermier), 2C (testikel somatiska celler, spermatogonier, sekundära spermatocyter), och 4C (primära spermatocyter och några förökande spermatogonier i G2 skede).

Figur 1
Figur 1. Del av en cell suspension från vuxen råtta testiklar som utarbetats av det nuvarande protokollet och visualiseras genom faskontrastmikroskopi. Som synes är cell cytoplasmor väl bevarad. Baren motsvarar 25 pm. Reproducerat från Rodriguez-Casuriaga, et al., Biol. Proced. Online. 11, 184 (2009).


Figur 2. FC DNA innehållsanalys av testikelcancer cellsuspensioner från vuxna råttor, möss, marsvin, och från 21 dagar post partum (DPP) råttungar, färgades med det vitala färgämnet Hoechst 33342 (A) eller med PI (B). I samtliga fall C, 2C och 4C cellpopulationer kan lätt avslöjas i histogrammen erhållna med båda färgämnena, liksom den till synes sub-haploida topp till vänster om C-populationen. Denna senare topp har visat sig innehålla de spermier, som visas som en separat, mindre färgade subpopulation grund av deras kondenserat kromatin tillstånd 12. Notera bristen på skräp i all grafik. Detta är särskilt tydligt i den 21 DPP (unga exemplar) profiler, som saknar spermatider och spermier. Modifierad från Geisinger och Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 3
Figur 3. 4C-cell population sorteras från en testikel cell suspension av vuxen råtta. Avsattes på rena poly-L-lysin-behandlade objektglas och observerades under faskontrastmikroskopi (A) eller ljusa fält efter Giemsa färgning (B) Sorterade celler. Streck = 20 um. Reproduceras från Geisinger och Rodríguez-Casuriaga, Cytogenet. Genome Res. 128, 46 (2010).

tp_upload/50102/50102fig4highres.jpg "/>
. Figur 4 A) FC analys av en vuxen marsvin testikelcancer cellsuspension beredd med det protokoll som beskrivs här (a), histogram,. (B), plotten. Notera de två subpopulationer i 4C cellpopulationen. B) Analys av sorterade celler från 4C R3 (a, b) och R4 (a ', b') regioner. (A, a '), epifluorescensmikroskop bilder av PI-färgade celler . Observera att kärnor från R3 region är jämförelsevis mindre. Bar: 10 m (b, b '), Laser konfokalmikroskopi av immunocytokemiska reaktioner på spridda celler med en antikropp mot Sycp3 (synaptonemal komplex [SC] protein 3, en tvärgående del komponent).. Bilden gör slutsatsen att R3 del motsvarar tidig (lepto / zygotene) meiocytes, där enkla axlar och korta sträckor av kaster kan ses, medan R4 innehåller pachytene meiocytes, med comhelt monterade SCS. Modifierad från Rodríguez-Casuriaga, et al., Cytometry A. 79, 625 (2011). Klicka här för att visa en större bild.

Figur 5
Figur 5. A) Agarosgelelektrofores av totala RNA extraherade från spermatogenesisk flow-sorterat cellfraktioner 2C, R3 och R4 (med förklaring till de båda senare fraktionerna är i figur 4). Cellsuspensioner framställdes med det protokoll som beskrivs här. B) Autoradiogram av en denaturerande polyakrylamidgelelektrofores visar differential cDNA band som erhållits med hjälp av "mRNA differential display" metoden (RNAimage, GenHunter Corporation, Nashville, TN) för en av de primerkombinationer ur satsen. mRNA från samma tre cellpopulationer som i et al., Cytometry A. 79, 625 (2011).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den optimerade här beskrivna metoden möjliggör framställning av cellsuspensioner från gnagare testikelvävnad på ett mycket snabbt och reproducerbart sätt som undviker enzym och detergentbehandling och bibehålla god cellernas integritet och proportioner typ. Den korta förfarandet (15 min span innehåller testiklarna dissektion, vävnad skärning och bearbetning), minimal hantering inblandade, och frånvaro av enzymatiska behandlingar är några av de viktigaste fördelarna. Alla dessa skulle stå för det goda bevarande av korta liv makromolekyler, vilket är avgörande när ett representativt urval av föreningar i den ursprungliga cellen befolkningen krävs.

När det gäller användningen av antingen PI eller Hoechst 33342, har vi observerade inga uppenbara skillnader i profilerna följer flödescytometrianalyser av testikelcancer cellsuspensioner med anställning av en eller annan färg. Färgen val kommer snarare att bero på användarens preferenser och tillgången, ochden planerade ytterligare användning. Å ena sidan, är PI billigare, och utbredd tillämpning som inte kräver användning av flödescytometrar och sorterare med en UV-laser. Å andra sidan kan även vi har framgångsrikt använt PI-färgade celler för bakomliggande sortering och differential gen studier uttryck (Figur 4), Hoechst 33342 eller annan vitala färgämnet med låg cytotoxicitet nivåer vara den bästa val för tillämpningar där fullt cellviabiliteten krävs, såsom könsceller kultur och / eller transplantation 4.

Vi har kunnat sortera specifika cellpopulationer uppnår över 95% renhet antingen för utvalda testikel populationer med olika DNA-innehåll 4 (figur 3), eller ens för subpopulationer med samma DNA-innehåll men olika kromatin nivåer kondens (Figur 4). Detta sistnämnda kan åstadkommas så länge de subpopulationer av intresse kan individualiseras i cytometrisk profiler, PArticularly i punktdiagram. Till exempel, fram till nu har vi kunnat sortera olika stadier av marsvin meiocytes I 9, men inte diskriminera och sortera delpopulationer inom 2C befolkningen helt enkelt genom färgning av DNA. Sorterat celler har gjort bra kvalitet RNA, vilket nedströms differentiella analyser genuttryck 9 (Figur 5).

Såsom kan ses i protokollbeskrivningen, är det mycket enkelt, lätt reproducerbar, och inte kräver särskilt utbildad personal. Vi anser att det kan antas för en mängd olika tillämpningar som omfattar flödescytometri eller inte. Den förstnämnda sträcker sig från enkla testikelcancer innehållsanalys för snabb kontroll av spermatogenesisk förskott, till andra med preparativ mål såsom flöde rening av specifika cellpopulationer för bakomliggande molekylära studier, som visas här.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes delvis av CSIC (I + D projekt C022) och PEDECIBA. Författarna vill tacka Mariela Bollati och Valentina Porro från cellbiologi Unit (Institut Pasteur de Montevideo) för deras generösa samarbete rörande MoFlo cellsorteraren och Merial-Montevideo för försiktigt ge alla marsvin prover som används i detta projekt. Figur 1 var reproducerad med tillstånd av BioMed Central, fig 2 och 3, och tabell 1 med tillstånd av S. Karger AG, Basel, och figurerna 4 och 5 var reproduceras eller anpassats med tillstånd av John Wiley & Sons, Inc. (copyright ägs av Wiley- Blackwell, 2011).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Medimachine system BD 340587
Medicon unit (50 μm) BD 340591
Filcon unit (50 μm) BD 340603
DMEM Gibco 430-2100
Fetal calf serum PAA A11-151
NDA Chemos BmbH 277081
H–chst 33342 Sigma-Aldrich 14533 Stock solution 5 mg/ml; used at a final concentration of 5 μg/ml
Propidium iodide Sigma-Aldrich 287075 Stock solution 1 mg/ml; used at a final concentration of 50 μg/ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Meistrich, M. L. Separation of spermatogenic cells and nuclei from rodent testes. Methods of Cell Biology. Prescott, D. M. 15, Academic Press. New York. 15-54 (1977).
  2. Lam, D. M. K., Furrer, R., Bruce, W. R. The separation, physical characterization, and differentiation kinetics of spermatogonial cells of the mouse. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 65, 192-199 (1970).
  3. Romrell, L. J., Bellve, A. R., Fawcet, D. W. Separation of mouse spermatogenic cells by sedimentation velocity. Dev. Biol. 19, 119-131 (1976).
  4. Geisinger, A., Rodríguez-Casuriaga, R. Flow cytometry for gene expression studies in mammalian spermatogenesis. Cytogenet. Genome Res. 128, 46-56 (2010).
  5. Getun, I. V., Torres, B., Bois, P. R. Flow cytometry purification of mouse meiotic cells. J. Vis. Exp. (50), e2602 (2011).
  6. Meistrich, M. L. Separation of mouse spermatogenic cells by velocity sedimentation. J. Cell Physiol. 80, 299-312 (1972).
  7. Meistrich, M. L., Bruce, W. R., Clermont, Y. Cellular composition of fractions of mouse testis cells following velocity sedimentation separation. Exp. Cell Res. 79, 213-227 (1973).
  8. Malkov, M., Fisher, Y., Don, J. Developmental schedule of the postnatal rat testis determined by flow cytometry. Biol. Rep. 59, 84-92 (1998).
  9. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., Santiñaque, F., López, B., Folle, G. High-purity flow sorting of early meiocytes based on DNA analysis of guinea pig spermatogenic cells. Cytometry A. 79, 625-634 (2011).
  10. Davey, H. M., Hexley, P. Red but not dead? Membranes of stressed Saccharomyces cerevisiae are permeable to propidium iodide. Environ. Microbiol. 13, 163-171 (2011).
  11. Rodríguez-Casuriaga, R., Geisinger, A., López-Carro, B., Porro, V., Wettstein, R., Folle, G. A. Ultra-fast and optimized method for the preparation of rodent testicular cells for flow cytometric analysis. Biol. Proced. Online. 11, 184-195 (2009).
  12. Spanò, M., Evenson, D. P. Flow cytometric analysis for reproductive biology. Biol Cell. 78, 53-62 (1993).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics