Mikrobiyal Tanımlama ve Karakterizasyonu için Pyrosequencing

Biology
 

Summary

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Bu videoda, mikrobiyal amplikon üretimi, amplikon pyrosequencing ve DNA dizi analizi için prosedür gösterilecektir.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Cummings, P. J., Ahmed, R., Durocher, J. A., Jessen, A., Vardi, T., Obom, K. M. Pyrosequencing for Microbial Identification and Characterization. J. Vis. Exp. (78), e50405, doi:10.3791/50405 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Pyrosequencing, bakteri türleri tespit bakteri suşları ayrım ve anti-mikrobiyal ajanlara karşı direnç kazandıran genetik mutasyonları tespit etmek için kullanılabilir mikrobiyal genom dizileme kolaylaştıran bir çok yönlü bir tekniktir. Mikrobiyoloji uygulamaları için pyrosequencing avantajları hızlı ve güvenilir yüksek verimli tarama ve mikropların ve mikrobiyal genom mutasyonlarının doğru tanımlama içerir. Pyrosequencing sentezi, reaksiyon sırasında dahil edilen özel bir nükleotid varlığının belirlenmesinde, tamamlayıcı dizi bir seferde tek bir baz sentez ile DNA sekanslama içerir. Reaksiyon dört deoksiribonükleotit (dNTP) arka arkaya ilave edildi ve adi dNTP sentez tepkimesi için bir sonraki dNTP eklenmesinden önce enzimatik olarak bozulmuş olan vardır immobilize tek sarmallı DNA şablonu üzerinde oluşur. Şablonu dahil belirli bir baz Algılama chemilum üretimi ile izlenirinescent sinyalleri. Kemilüminesan sinyalleri üretmek dNTP sırası şablon DNA dizisi belirlenir. Pyrosequencing teknolojinin gerçek zaman sıralaması özelliği tek bir tahlil hızla mikrobiyal tanımlanmasını sağlar. Buna ek olarak, pyrosequencing alet, SNP, nokta mutasyonları, eklemeler, silmeler ve yanı sıra, bazı anti-mikrobiyal direnç oluşabilir çoklu gen kopya miktar protein tipi dahil olmak üzere, bir anti-mikrobiyal ilaç direnci, genetik çeşitlilik, analiz desen.

Introduction

Pyrosequencing "sentez ile dizileme" ilkesine dayanmaktadır nükleik asit dizisi için hızlı ve hassas bir yöntemdir. "Sentez ile sıralama" bir anda tamamlayıcı bükümünü sentezlemek için bir baz tek iplikli DNA şablon kullanılarak yapılan, ve içinde yer alan baz (A, T, G veya C), bir kemilüminesan tespit sinyali tarafından her adımında tespit içerir. Pyrosequencing Reaksiyon DNA şablonu, dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP), DNA polimeraz, ATP sulfurylase, lusiferin, lusiferaz ve apyrase içerir. Sentez Reaksiyon dört dNTP ve tek sarmallı biyotinlenmiş şablon DNA'ya DNA polimeraz birinin ilave edilmesi ile başlatılır. DNA polimeraz pirofosfat daha sonra tahliye edilmesini (Şekil 1) ile, şablon üzerine tamamlayıcı dNTP kapsar. ATP sulfurylase orantılı ATP'ye pirofosfat dönüştürür. ATP hangi oxyluciferin için luciferase lusiferaz-aracılı dönüşüm için bir katalizör olarak hareket ederışığı (Şekil 2) üretir. Işığın şiddeti dahil nükleotidlerin sayısı ile orantılıdır ve bir veya daha fazla dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP veya) ardışık olarak şablon bükümü (Şekil 3) mevcut olup olmadığını tespit eder. Herhangi bir tüzel kişiliği olmayan dNTP önce sentez reaksiyon devamı için bir sonraki dNTP ilavesi için apyrase tarafından düşer. Tek sarmal kollu DNA şablonundan DNA dizisini tespit edilene kadar bu "sentez ile sekanslama" tepki dört dNTP, her biri sıra ile tekrarlanır.

Pyrosequencing reaksiyon bir animasyon görmek için filmi görmek için buraya tıklayın .

Protocol

Giriş: Tek bir bakteri kolonisi, bir gece boyunca inkübe edilir, uygun bir kültür et suyu aşılamak için kullanılır. Bir bakteriyel Topak daha sonra, bir ticari olarak temin edilebilen genomik izolasyon kiti kullanılarak genomik DNA arındırmak için işlenir. Saflaştırılmış genomik DNA 260/280 (nm) oranı örnek protein arındırılmış olduğundan emin olmak için> 1.8 olmalıdır. Pyrosequencing şablon üretimi için gerekli genomik DNA miktarı, 10-20 ng.

Şablon A. Amplifikasyon

(PyroMark PCR El Kitabı; www.qiagen.com / el kitapları 1)

PCR reaksiyonu ayarlama

Not: Bir astar, 5 'ucunda biotinlenmiş olmalı ve bu şablon hazırlanması için saf HPLC olması önerilir. Biz PCR ve se için PyroMark Testi Tasarım Yazılımı 2.0 tavsiyekısa okuma sıralama için optimize edilmiş sekans Primer tasarımı, ancak, Primer-BLAST ( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome NCBI itibaren) da yapabilirsiniz Primer tasarımı için kullanılabilir.

  1. Gerekli tüm çözümleri (Tablo 1'de) çözülme ve her iyice karıştırın. Tablo 1'e göre reaksiyon ayarlayın. Tüm çalışmalar, oda sıcaklığında yapılabilir.

Not: PCR Master Mix çoğu durumda tatmin edici sonuçlar verir 1.5 mM, nihai konsantrasyon için MgCl2 içerir. Daha yüksek bir Mg2 + konsantrasyonu gerekli ise, 25 mM MgCl2 kadar 3,5 ul bir reaksiyon eklenebilir.

  1. Iyice hafifçe aşağı yukarı pipetleme ve reaksiyon karışımı karıştırın, daha sonra PCR tüplerine uygun hacimde dağıtım.
  2. Templat ekleHer bir PCR tüpü E DNA. Biz genomik DNA 10 ng tavsiye ederiz.
  3. Tablo 2'ye göre termal döngü programlayın. 4 nihai bir tutma ° C kolaylık sağlamak için önerilir. 100 ul mineral yağ ile ısıtılmış bir kapaksız bir termal döngü kullanıyorsanız, bindirme reaksiyonlar.
  4. Cycler PCR tüpleri yerleştirin ve bisiklet programını başlatın.

B. Vakum İş İstasyonu Protokolü

Biyotinillenmiş PCR ürünleri hareketsizleştirici

  1. Şekil 4'e göre bir ana karışımı olun.

Not: pipetleme önce yavaşça homojen bir süspansiyon sağlamak için streptavidin kaplı Sepharose boncuklarının şişe çalkalanır.

  1. Kullanılan PCR ürününün hacmine bağlı olarak, oyuk başına 80 ul toplam hacim vermek için bir PCR plakanın her oyuğuna 60-75 ul ana karışımı dağıtın.
  2. Her bir kuyunun 5-20 ul biotinlenmiş PCR ürün ekleyin.
  3. Şerit ca ile kuyu Sealorbital çalkalayıcı kullanılarak, oda sıcaklığına (15-25 ° C) 5-10 dakika süreyle 1.400 rpm'de PCR plaka PS ve ajitasyon.

DNA denatürasyonu ve primer sekans ilavesi

  1. Tampon tavlama ile 0.3 uM sekanslama primerleri seyreltilir ve bir tepkime levhası, her kuyuya 25 ul dağıtın. Iş istasyonunda plaka yerleştirin.
  2. Şekil 5, şemasına göre iş istasyonu olukları doldurun.
  3. Vakum pompası açın ve vakum aracı anahtarı (Şekil 6) için ayarlanmış olduğundan emin olun. Yalak 5 yüksek saflıkta su (Milli-Q 18,2 MW x cm veya eşdeğeri) (Şekil 5) ile filtre probları yıkayın. 12. adımda kullanıma hazır ve taze yüksek saflıkta su ile doldurun çukur.
  4. Hızlı çalışan, iş istasyonunda boncuk ile PCR plaka yerleştirin. Iki tabak örnekleri yüklenen olduğu gibi aynı yönde olduğundan emin olun.
  5. ON vakum anahtarı ile, vakum alt20 saniye için ya da her birim aspire edilmiş kadar PCR plakanın gözleri içine aracı. Boncuk vakum aracı (Şekil 7) tarafından Çekilecek.
  6. Hala ON vakum ile, 20 saniye boyunca% 70 etanol (çukur 1) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar.
  7. ON vakum ile, 20 saniye boyunca denatürasyon solüsyonu (çukur 2) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar.

Not: Denatürasyon Çözüm bir göz ve cilt tahriş edici sodyum hidroksit içerir. Her zaman laboratuvar önlüğü, eldiven ve koruyucu gözlük takın.

  1. ON vakum ile, 20 saniye boyunca yıkama tamponu (çukur 3) ile aracı yıkayın veya tüm ses aspire edilinceye kadar.
  2. ON vakum ile tüm sıvı vakum aracı dışarı akmasını sağlamak için, 5 saniye 90 ° ötesinde dikey vakum aracı yükseltmek. Pompa KAPATIN ve reaksiyon plaka ile vakum aracı hizalayın. Içine vakum aracı Altkuyu ve yavaşça kuyu içeren sıralama astar içine boncuk serbest bırakmak için iki yana sallayın.
  3. Vakum aracı temizlemek için, 10 saniye boyunca yüksek saflıkta su (çukur 4) 'te, filtre probları ajitasyon.
  4. ON vakum açın ve tüm ses aspire edilinceye kadar 20 saniye veya için yüksek saflıkta su (çukur 5) ile aracı yıkayın.
  5. 5 saniye için 90 ötesinde ° C dikey vakum aracı kaldırın, sonra vakum durur, "Otopark" konumunda saklayın.

DNA ipliklerini için dizi astar tavlama

  1. Önceden ısıtılmış plaka tutucu reaksiyon plakası yerleştirin.
  2. 2 dakika 80 bir ısıtma bloğu ° C plaka ısıtın.
  3. 5 dakika boyunca oda sıcaklığında soğumaya sayaç üzerinde tutucu ve yerden plaka çıkarın.

Pyromark S24 Çalışma

Not: Güç kablosunu üzerinde bulunan güç düğmesini kullanarak cihazı açın. Startup 1 dakika kadar sürebilir.

  1. PyroMark Altın Q24 Reaktifler El Kitabı 2 verilen talimatlara göre bir kartuş doldurun. Cihaz yazılım bir çalışma dosyası kurmak, gerekli hacmi belirlemek ve Araçlar menüsünde Çalıştır Öncesi Bilgi seçmek için
  2. Cihazda zaten, bu bir çalışma performans sağlamak ve daha sonra kapağı açın. Bunu yapmak için güvensiz olduğunda kapak açıldığında sesli bir ikaz sinyali duyulur.
  3. Kartuşu girişini açın ve etiket (Şekil 8) öne gelecek şekilde kartuşu takın. Kartuşu doğru (bir çizgi ön görünür olmalıdır) takılı olduğundan emin olun ve kapıyı kapatın.
  4. Plaka tutma çerçeve açın ve cihazın içindeki örnekleri ile plaka yerleştirin.
  5. Plaka tutma çerçevesi ve araç kapağını (Şekil 9) kapatın.

Bir çalışma başlangıç

  1. Çalışma dosyası ile USB stick takıns cihazın ön USB portuna cihaz yazılımı ile yarattı.
  2. Ana menüdeki "Çalıştır" ı seçin ve "OK" tuşuna basın.
  3. İstenilen çalıştırma dosyayı seçin ve "Select" tuşuna basın kaydırma okları kullanın.

Not: Cihaz tüm önceden basınç ve sıcaklık seviyeleri (bu birkaç dakika sürebilir) ulaşıldığında reaktif dağıtım başlayacak. Bir çalışma sırasında, cihaz ekran gerçek zamanlı olarak seçilen kuyunun pyrogram görüntüler. Diğer kuyuların pyrogram görmek için kaydırma okları kullanın.

Bir çalışma Tamamlanıyor

  1. Cihazın çalışma bitmiş olduğunu doğrular ve çalışma dosyası USB belleğe kaydedildikten sonra, "Close" tuşuna basın.
  2. USB stick çıkarın. Çalışma bitmiş önce kaldırıldı, USB stick takın. "Yönetim" ve daha sonra "Kopyala kaydedilmemiş çalışır" seçin.
  3. Çalıştırmak dosya şimdi açıldı ve enstrüman yazılımı kullanılarak analiz ve karşılaştırılabilirIdentifire yazılımı kullanarak bilinen mikropların bir kütüphaneye.

Representative Results

Yazılımı kullanarak tipik bir pyrosequencing çalışma sonuçları amplikon üretimi için kullanılan ileri ve geri primerler yerini ve korunmuş 16S ribozomal dizisi (Şekil 10) içinde pyrosequencing reaksiyon için kullanılan sıralama astar gösterir. Astar arasındaki aşırı değişken dizisi Yer korunmuş dizileme primeri (5'-TACATGCAAGTCGA) kullanılarak bakteri türlerinin, çok sayıda bakteriyel belirlenmesi için olanak sağlar. bir iç kalite kontrol olarak, DNA dizisi parantez içi değişken bölge doğru DNA bölgesi analiz edilmiştir sağlamak için kontrol edilebilir . Pyrosequencing yazılım bakteri tanımlama için bakteriyel ribozomal dizileri bir iç veritabanı için oluşturulan dizisinin karşılaştırma ve uyum sağlar. Buna ek olarak, bir dizi antibiyotik ilaç direnci kazandıran mutasyonlar belirlemek için analiz edilebilir. Helicob arasında 23S ribozomal genlerdeki mutasyonların Örneğin, analizacter pylori antibiyotik direnci kazandıran iki mutasyon desen (GAA veya AGA) (Şekil 11) göstermektedir. Aynı hastada birden fazla izole analizi aynı zamanda mikrobiyal ilaç direnci salgınların epidemiyolojik araştırmalarda yardımcı olmak için zaman içinde ilaç direncinin ortaya çıkması izlemek için test edilebilir.

Şekil 1
Şekil 1. Biyotinillenmiş PCR ürünü, pirofosfat (PPi) üretimi yol açan DNA polimerazı ile dNTP dahil etmek için bir şablon olarak kullanılır.

Şekil 2,
Şekil 2. ATP sulfurylase orantılı yanlısı olduğunu ışık üretir oxyluciferin için luciferase lusiferaz aracılı dönüşüm için bir katalizör olarak ATP. ATP eylemleri pirofosfat dönüştürürATP miktarının orantılı olduğu. Işık pyrogram iz üzerinde zirve olarak kaydedilir ve nükleotid dahil belirtir. Bir sonraki dNTP sentezi devam etmesi için ilave edilmeden önce, adi dNTP apyrase tarafından bozulmuş.

Şekil 3,
Şekil 3,. Bir veya daha fazla dNTP (dATP, dTTP, dGTP, dCTP veya) ardışık olarak şablon bükümü üzerine kurulmuştur, oluşturulan ışığın yoğunluğunu gösterir.

Şekil 4,
Şekil 4. Biotinlenmiş PCR ürünü hareketsiz ana karışımı hazırlanması için akış şeması.

Şekil 5,

ge = "her zaman"> Şekil 5. PCR plaka, PyroMark plaka ve çukur yerleri ile PyroMark iş istasyonu,.

Şekil 6,
6 Şekil. Pozisyonları ve KAPAT Vakum anahtarı yerler.

Şekil 7
Şekil 7. Vakum aracı. Vakum aracı doğru kullanımı.

Şekil 8,
Şekil 8. Kartuş kapısı yerde kartuş ile açıldı.

Şekil 9,
9 Şekil. Kapı kapalı kartuşu doğru takılı.

"Fo: keep-together.within-page =" her zaman "> Şekil 10
10 Şekil. Tabanlı bakteri tanımlama sonuçlar Pyrosequencing. PCR primerleri, DNA şablonunun korunmuş bölgeler için tasarlanmıştır ve sekanslama primerine amplikon (mavi renkte gösterilmiştir) içinde iyi karakterize edilmiş DNA sekansının tanımlanması hiper-değişken bölgesinin hemen üst tarafından konumlandırılır.

Şekil 11
11 Şekil. Pyrosequencing kullanarak Helicobacter pylori antibiyotik ilaç direnci tespit. GAA veya AGA dizileri içeren Helicobacter pylori antibakteriyel direnç görüşmek 23S genlerinde mutasyon analizi. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

<td> Bileşen
Reaksiyon başına hacim Nihai konsantrasyon
Pyro PCR Master Mix, 2x 12.5 ul 1x
CoralLoad Konsantre, 10x 2.5 ul 1x
25 mM MgCl2 (isteğe bağlı) Değişken ≥ 1.5 mM
5x Q-Çözüm, (isteğe bağlı) 5 ul 1x
Astar A / Astar B Değişken / Değişken 0.2 μM/0.2 mcM
RNase içermeyen su Değişken -
Toplam Hacim (DNA ekledikten sonra) 25 ul

Tablo 1. PCR reaksiyon karışımının.

& Nbsp; Ek yorumlar
İlk PCR aktivasyon aşaması 15 dakika 95 ° C HotStartTaq DNA Polimeraz etkinleştirilir
3 adım bisiklet: Denatürasyon 30 sn 94 ° C
Tavlama 30 sn 60 ° C
56 ° C
Genomik DNA için
Bisülfit dönüştürülür DNA
Uzatma 30 sn 72 ° C
Döngü Sayısı 45
Son uzatma 10 dakika 72 ° C

Tablo 2'de. PCR Döngüsü Özellikleri.

Discussion

Birçok yeni nesil dizileme yöntemleri ticari edilmiştir. En yaygın olarak kullanılan yöntemler arasında üç Bu yöntemlerin her biri 3-11 sentez ile sekanslama bağlıdır. Iyon iletken dizi analizi, tek bir molekül gerçek zaman sıralaması ve sentezi (SBS) ile sıralama ama Incorporated nükleotid tespiti için yeni bir platform kullanır. Iyon yarı iletken sıralama içinde, tek bir DNA iplikçik sıralama iplikçik için bir şablon olarak hizmet vermektedir. 12 Polimeraz ve nükleotid sırayla pyrosequencing olarak eklenir. Bir nükleotid artan DNA sarmalı ilave edildiğinde, bir hidrojen iyonu serbest bırakılır. Hidrojen iyonu, bir saha etkili transistörün tabanlı sensör tarafından tespit edilir.

Tek bir molekül gerçek zamanlı sıralama sıfır modu dalga kılavuzu (ZMW) bağlıdır. 13 ZMW tek bir polimeraz molekül kuyunun dibinde bağlı küçük bir yapıdır. Bu, bir flore bir şekilde aydınlatılmışkoku molekülü tespit edilebilir. Her nükleotid bir floresan molekül ile etiketlenmiş. Bir floresan etiketli nükleotid dahil olarak, bir detektör nükleotid tanımlar. Aşağıdaki nükleotid eklendiğinde, floresan molekül yarılır. 14

Sentez ile Sequencing (SBS) eşsiz dizilerin kümeleri oluşturulan bu hedef DNA, yükseltmek için benzersiz bir yöntem kullanır. 15 tek sarmallı şablon oluşturulur ve daha sonra tamamlayıcı şeride sentezlenir. Her bir nükleotid, bir flüoresan molekül ile etiketlenir ve her bir baz ilave edildikten sonra ilave edilen baz floresan kaydedilir.

Disclosures

Bu makalenin Üretim ve Serbest Giriş Qiagen tarafından desteklenmektedir.
Yazarlar Ahmed, Durocher, Jessen ve Vardi Bu makalede kullanılan reaktifler ve aletleri üreten Qiagen Inc çalışanlarıdır.

Acknowledgments

Bu proje Johns Hopkins Üniversitesi, Ağ Geçidi Bilim Girişimi ve Qiagen A.Ş. aracılığıyla Provost Ofisi kısmen destek oldu

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PyroMark PCR Master Mix, 2x Qiagen 978703
CoralLoad Concentrate, 10x Qiagen 978703, 978705
Q-Solution, 5x Qiagen 978703, 978705
MgCl2, 25 mM Qiagen 978703, 978705
RNase-Free Water Qiagen 129112
Primers Qiagen 978776 or 978777 Primers should be purchased from an established oligonucleotide manufacturer (i.e. QIAGEN Pyromark Custom Assays, IDT, etc). Lyophilized primers should be dissolved in TE to provide a stock solution of 100 μM.
Pyromark Gold Q24 Reagents Qiagen 970802
High-purity water (Milli-Q 18.2 MΩ x cm or equivalent)
Streptavidin Sepharose High Performance Beads GE Healthcare 17-5113-07
PyroMark Annealing Buffer Qiagen 979009
PyroMark Denaturation Solution Qiagen 979007
PyroMark Wash Buffer Qiagen 979008
PyroMark Q24 Qiagen 9001514
PyroMark Q24 Cartridge Qiagen 979202
PyroMark Q96 HS Tip Holder Box Qiagen 979105
PyroMark Q24 Vacuum Workstation Qiagen 9001516
PyroMark Q24 Plate Holder Qiagen 9022273
Orbital shaker Fisher 11-675-297
Heat block Fisher 11-718Q

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. PyroMark PCR Handbook. [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2009).
  2. PyroMark Q24 User Manual. [about 27p.]. Available from: http://www.qiagen.com/handbooks (2012).
  3. Elahi, E., Ronaghi, M. Pyrosequencing: a tool for DNA sequencing analysis. Methods Mol. Bio. 255, 211-219 (2004).
  4. Fakhrai-Rad, H., Pourmand, N., Ronaghi, M. Pyrosequencing: and accurate detection platform for single nucleotide polymorphisms. Hum. Mutat. 19, (5), 479-485 (2002).
  5. Langaee, T., Ronaghi, M. Genetic variation analyses by pyrosequencing. Mutat. Res. 573, (1-2), 96-102 (2005).
  6. Liu, Z., Lozupone, C., Hamady, M., Bushman, F. D., Knight, R. Short pyrosequencing reads suffice for accurate microbial community analysis. Nucleic Acids Res. 35, (18), e120 (2007).
  7. Novais, R. C., Thorstenson, Y. R. The evolution of Pyrosequencing for microbiology: From genes to genomes. J. Microbiol. Methods. 86, (1), 1-7 (2011).
  8. J, Metagenomic pyrosequencing and microbial identification. Clin. Chem. 55, (5), 856-866 (2009).
  9. Quince, C., Lanzen, A., Curtis, T. P., Davenport, R. J., Hall, N., Head, I. M., Read, L. F., Sloan, W. T. Accurate determination of microbial diversity from 454 pyrosequencing data. Nat. Methods. (9), 639-6341 (2009).
  10. Ronaghi, M., Karamohamed, S., Pettersson, B., Uhlen, M., Nyren, P. Real-time DNA sequencing using detection of pyrophosphate release. Anal. Biochem. 242, 84-89 (1996).
  11. King, C., Scott-Horton, T. Pyrosequencing: A simple method for accurate genotyping. J. Vis. Exp. (11), e630 (2008).
  12. Rothberg, J. W., Heinz,, et al. An integrated semi-conductor device that enabling non-optical genome sequencing. Nature. 475, 348-352 (2011).
  13. Levene, M. J., Korlach, J., Turner, S. W., Foquet, M., Craighead, H. G., Webb, W. W. Zero-Mode Waveguides for Single-Molecule Analysis at high concentrations. Science. 299, 682-686 (2003).
  14. Eid, J., Fehr, A. Real-Time DNA Sequencing from Single Polymerase Molecules. Science. 323, 133-138 (2009).
  15. Sequencing Technology | Sequencing by Synthesis | Illumina [Internet]. Illumina. Available from: http://www.illumina.com/technology/sequencing_technology.ilmn (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics