Generatie van Human Cardiomyocytes: Een Differentiatie Protocol van Feeder-vrije Human geïnduceerde pluripotente stamcellen

1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Pluripotente stamcellen, hetzij embryonale of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen vormen een waardevolle bron van menselijke gedifferentieerde cellen, zoals cardiomyocyten. Hier zullen we ons richten op de cardiale inductie van iPS cellen, laten zien hoe ze te gebruiken om functionele menselijke hartspiercellen te verkrijgen via een embryoid lichamen-gebaseerd protocol.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Om de gebeurtenissen een hartontwikkeling onderzoeken en de moleculaire mechanismen die leiden tot myocardiale ziektes bij mensen te bepalen, is het noodzakelijk eerst functionele humane hartspiercellen (CM) genereren. Het gebruik van deze cellen in drug discovery en toxicologische studies ook zeer gunstig, waardoor nieuwe farmacologische moleculen voor de behandeling van cardiale stoornissen preklinisch gevalideerd op cellen van menselijke oorsprong. Van de mogelijke bronnen van CM, geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen behoren tot de meest veelbelovende, aangezien ze direct kunnen worden afgeleid uit gemakkelijk toegankelijk weefsel van de patiënt en bezit een intrinsieke vermogen om aanleiding te geven tot alle celtypes van het lichaam 1. Er zijn verschillende methoden voorgesteld voor de differentiatie van iPS cellen in CM's, variërend van de klassieke embryoid instanties (EBS) aggregatie aanpak van chemisch gedefinieerde protocollen 2,3. In dit artikel wordt een EBS-gebaseerd protocol stellen we en laten zien hoe deze methodiekd kan worden gebruikt om efficiënt genereren functionele CM-achtige cellen uit voedingsvrije iPS cellen.

Introduction

Historisch gezien, heeft het onderzoek naar de genetische en moleculaire mechanismen achter de menselijke ontwikkeling en de ziekte is gebaseerd op het genereren van genetisch gemodificeerde diermodellen. Echter, een groot aantal menselijke fenotypes niet succesvol gerepliceerd in muizen, vooral als gevolg van de biologische verschillen tussen de twee soorten. Anderzijds, toegang tot menselijke weefsels kan worden beperkt en vaak geen voldoende materiaal te verkrijgen voor diepgaande experimentele studies. Het gebied van de cardiovasculaire biologie lijdt aan beide beperkingen: de fysiologie van het menselijk hart significant verschilt van die van de muis, en een aanzienlijke hoeveelheid van hartweefsel is alleen post mortem of tijdens hartchirurgie. Vinden van een optimale bron voor de differentiatie van functionele humane CM's heeft dan ook een centraal thema in de cardiovasculaire biologie geworden, en veel moeite is gedaan om dit probleem aan te pakken. Diverse soorten cellen zijn voorgesteld, including skeletmyoblasten, lokale hartstamcellen, beenmerg mononucleaire cellen endotheliale stamcellen en mesenchymale stamcellen. Echter, gegevens verkregen met behulp van deze cellen niet consistent 4 geweest.

De winning van menselijke embryonale stamcellen (ESC) eerste 5 en de baanbrekende ontdekking van geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPS) cellen door Yamanaka en Thomson 6,7 leek later oplossingen: deze cellen hebben het vermogen om onbeperkt groeien en het potentieel te bieden stijgen alle mobiele derivaten van de drie kiemlagen, zoals de CMS. Het gebruik van iPS cellen heeft verdere voordelen: afgeleid is van autologe volwassen cellen, zij dragen het genoom van de persoon of patiënt waarvan ze zijn afgeleid. Ze laten dan ook de ontwikkeling van in vitro modellen die het onderzoek van menselijke genetische ziekten en mechanismen van de ontwikkeling te bevorderen. Op grond van dit karakteristieke, kan iPS cellen ook overcome problemen met betrekking tot afstoting en ethische kwesties 8. Daarom, hoewel SER nog altijd de gouden standaard op het gebied biologie van stamcellen, onderzoekers wereldwijd nu verplaatsen naar iPS celtechnologie.

iPS cellen worden nu gebruikt om menselijke ziekten te modelleren in vitro voor verschillende aandoeningen, waaronder aangeboren cardiovasculaire aandoeningen 9,10. Onlangs, heeft de toepassing van de iPS-cel ziekte modellering uitgevoerd voor monogene cardiale aandoeningen (dwz lange QT-syndroom, catecholaminerge polymorfe ventriculaire tachycardie) en pathologieën waarin hartafwijkingen zijn onderdeel van een complex fenotype (dwz Leopard en Timothy syndromen, gedilateerde cardiomyopathie). Deze rapporten bevestigden dat patiënt-specifieke iPS cellen die worden onderscheiden in CM's weer te geven soortgelijke fenotypische en functionele kenmerken als de ziekte in vivo.

Ernog vele uitdagingen voor de werkzaamheid van het induceren van de iPS cellen in het hart lijn verbeteren. Spontane generatie van CM's uit menselijke SER via aggregaatvorming genaamd embryoid instanties (EBS) hebben bewezen succesvol 17. Sinds deze ontdekking, hebben vele werkwijzen voorgesteld. Veel groepen hebben sterk verbeterde de efficiëntie van de differentiatie protocol en zijn verhuisd naar chemisch gedefinieerde en dierlijk bijproduct-vrije cultuur reagentia (zie Mummery, C., et al.., Circulation Research (2012) voor een uitgebreid overzicht van alle bestaande methoden 3 ).

Toch is de klassieke methode op basis van EB aggregatie vertegenwoordigt nog steeds de meest gebruikte voor het uitvoeren van functionele studies en onderzoeken ziektemechanismen. De voorgestelde protocol is gebaseerd op de aggregatie van iPS cellen in EBS en cultuur in de aanwezigheid van serum en ascorbinezuur, dat is aangetoond dat het cardiaal differentiatieproces verbeteren en positively invloed hebben op de rijping van deze cellen 18,19. In dit artikel gaan we door middel van deze methode in detail en zal laten zien hoe je feeder-vrije iPS cellijnen gebruiken voor het genereren van patiënt-specifieke iPS-afgeleide CM's.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Feeder-free Onderhoud en passage van de Mens iPS Cell Lines

  1. Bereid de Matrigel-gecoate gerechten. Dooi een flacon van menselijke ESC-gekwalificeerde Matrix op ijs gedurende een uur en verdun het in 25 ml DMEM-F12 medium. Voeg 1 ml voor elke 35 mm plaat (of equivalente hoeveelheden per oppervlakte als andere gerechten worden gebruikt), om alles op ijs en ervoor te zorgen dat alle platen en buizen zijn voorgekoeld. Afdekplaten met aluminiumfolie.

Opmerking: Matrigel voorraad concentraties verschillen per de partij. Verdunningsinstructies worden aangegeven op het informatieblad.

  1. Houd platen op ijs 's nachts en te verwijderen uit het ijs de volgende dag. Platen kunnen in de koelkast worden bewaard tot een week vóór het gebruik.
  2. Bereid de mTESR1 compleet medium (of ontdooien een flesje Nutristem medium) en H-ESM (human ESC medium) volgens de onderstaande tabel.
    H-ESM Eindconc FOR 500 ml
    Knockout Serum Vervanging (KSR) 20% 100 ml
    GlutaMAX 100X 2 mM 5 ml
    MEM niet-essentiële aminozuren 0,1 mM 5 ml
    Penicilline-streptomycine 100 U / ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    2-mercaptoethanol 0,1 mM 900 pl
    B27 Supplement - zonder Vitamina 1% 10 ml
    N2 Supplement 1% 5 ml
    Knockout DMEM - 370 ml

    De drager kan bij 4 ° C gedurende maximaal 2 weken bewaard. Om volledige groeimedium te bereiden, wordt basisch FGF toegevoegd net goederenvervoerdere voeden bij een eindconcentratie van 20 ng / ml.

Opmerking: de volledige H-ESM onder de voorwaarde dat de muis embryonale fibroblasten kunnen in plaats van mTESR1 of Nutristem worden gebruikt voor iPS cellen.

  1. Plaats beklede platen in een incubator bij 37 ° C gedurende 30 min tot 2 uur voorafgaand aan passage.
  2. De cellen worden gepasseerd ongeveer elke 5 dagen, zelfs als ze niet samenvloeiing bereikt. Kolonies niet moet aanraken.
  3. Vervang groeimedium met 1 ml van dispase (1 mg / ml, los van een 10 mg / ml voorraad in PBS).
  4. Verwijder differentiëren gebieden met getrokken glas pasteurpipetten. Gebieden die moeten worden verwijderd omvatten kraterachtige of cysteuze structuren in het centrum van de kolonies, en gedeelten waar de cellen worden gescheiden van kolonies en afgeplat en lijken te migreren naar buiten.
  5. Incubeer bij 37 ° C onder een kap cultuur tot kolonie grenzen helderder en beginnen los (gewoonlijk ongeveer 5-7 minuten). Discard dispase. Wassen met 1 ml H-ESM en gooi.
  6. In 1 ml H-ESM, gebruik dan een cel lifter (spatel-achtige scraper) te oogsten kolonies en verzamelen in een 15 ml Eppendorf buis. Spoelen met 1 ml H-ESM en toe te voegen aan de buis. Draaien bij 1000 RCF gedurende 4 min en verwijder het supernatant.
  7. Resuspendeer pellet in 1 ml voorverwarmde groeimedium (ofwel mTESR1 of Nutristem). Vermijd opbreken klonten te veel - pipet op en neer op minder dan 6-8x. Bepalen hoeveel cellen moeten verzilverd worden en verwijder onnodige cellen (meestal 1:04 of 1:05 verdunning), bijv. voor 2 platen bij 1:05, verwijder 600 ui, voeg dan 1,6 ml vers medium.
  8. Verwijder Matrigel uit platen. Plaats cellen druppelsgewijs verdelen gelijkmatig over de plaat. Vermijd het schudden van de buis overdreven, omdat dit zal leiden tot cellen te verplaatsen naar het midden.
  9. Wassen buis met 1 ml medium en verdeel tussen de platen. Eindvolume in elke plaat moet 1,5 -2 ml zijn.
  10. Veranderen medium elke dag, behalve de dag na de passage. Hoewel hetideaal om het medium elke dag verandert, kan dit soms worden veranderd met een frequentie van eenmaal per twee dagen, indien niet meer dan 2-3 dagen zijn verstreken sinds de laatste passage zonder dat pluripotency of differentiatie potentieel.
  11. Als de cellijn moeten worden bevroren, opnieuw te schorten in plaats van 1-2 ml mFreSR bevriezing medium met behulp van een ml pipet 2 en plaats 1 ml / cryovial. Plaats flacons in een cryobox bij -80 ° C en transfer naar vloeibare stikstof in 3-4 dagen.

Opmerking: Handmatig microdissection van iPS cellen moeten onder een stereomicroscoop worden uitgevoerd. Een in vitro fertilisatie (IVF) werkplek (bv. door IVF Werkstation KSystem) geïntegreerd met een stereomicroscoop staat manipulatie van de cellen in steriele omstandigheden, terwijl ze op een verwarmd oppervlak gehouden. Als dit niet beschikbaar is, kan een stereomicroscoop worden verplaatst onder een normale laminaire stroming kap.

2. Embryoid Bodies Samenvoeging en Cardiac Induction

  1. Bereid EBM-medium 20 volgens de onderstaande tabel.
    EBM-20 Eindconc FOR 500 ml
    Fetal Bovine Serum (oorsprong Zuid-Amerika) 20% 100 ml
    MEM niet-essentiële aminozuren 0,1 mM 5 ml
    Penicilline - streptomycine 100U/ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    GlutaMAX 100X 0,1 mM 5 ml
    2-mercaptoethanol 50um 450 pl
    DMEM/F12 - 385 ml

    Gebruik van FBS Zuid Amerika oorsprong is kritiek voor het bepalen van de differentiatie efficiency: dienst andere typen sera kunnen beïnvloedenhet differentiatieproces. Om volledige EBM-20, add ascorbinezuur (AA) te bereiden op een eindconcentratie van 50 ug / ml. Volledige groeimedium bij 4 ° C gedurende maximaal een week opgeslagen.
  2. Harvest iPS kolonies zoals hierboven beschreven (stap 1.6 tot 1.9).
  3. Resuspendeer zachtjes in 1 ml EBM-20 met een ml pipet 2. Vermijd opbreken klonten te veel - pipet op en neer niet meer dan 2-3x, controleren van de grootte van de kolonies onder de stereomicroscoop. Plaat op ultra-low bevestigingsplaten in 1:1 verhouding (bijv. voor een 35 mm schaal, gebruik 1 putje van een 6-wells plaat). Spoel buis met 1 ml EBM-20 en voeg toe aan plaat.

Opmerking: De grootte van de kolonies invloed op het differentiatieproces, controle efficiency en timing van cardiale inductie. Aggregatie van homogeen formaat EBS is aangetoond dat het wordt waargenomen tijdens differentiatie verminderen.

  1. Op dag 3, wijzigen EBM-20 keer met een microscoop te vermijden removal van EBS. Houd de pipet dicht tegen elkaar van de plaat, en verwijder medium.
  2. Op dag 7, switch EBS platen bekleed met 0,1% gelatine en tevoren voor 30 min bij 37 ° C. Eventueel kan gelatine worden verwijderd en de platen liet onder een celkweek kap O / N. Voeg 35-40 EBS per 35 mm schaal.
  3. Controleer EBS voor het verslaan van gebieden en verandering EBM-20 twee keer per week. Markeer ze verslagen gebieden aan de bovenkant van de schaal deksel voor lokalisatie zij onder de stereomicroscoop vergemakkelijken. Aanbestedende gebieden moeten verschijnen na ongeveer 10-20 dagen.
  4. Bij gebieden met spontane contractie verschijnen, schakelt medium tot EBM-2 (bereiden als EBM-20, met 2% FBS plaats) en isoleer ze, zoals hieronder beschreven in paragraaf 3.
  5. Doorgaan naar andere gebieden te controleren voor het verslaan en verandering medium twee keer per week totdat verslaan gebieden zijn nodig voor verdere experimenten.

Opmerking: Efficiëntie van het differentiatieproces sterk afhankelijkverscheidene factoren, de meest kritische waarvan de specifieke cellijnen en de serum-gebruikt om cardiale differentiatie induceren. Om het hoogste rendement te verkrijgen, testen cellijnen voor cardiomyogene potentieel en diverse serumcharges.

3. Beating Gebieden Isolatie en Cultuur

  1. Coat 12-well platen (4 cm 2 oppervlakte) of de platen plaats met 5 ug / cm 2 fibronectine, verdund in PBS om voldoende volume het gehele oppervlak volledig te bedekken (300 ul totaal per putje in 12-well platen) te maken. Ontdekt in celkweek kap te houden en laten drogen. Platen kunnen worden verpakt en opgeslagen bij 4 ° CO / N.
  2. Verwijder slaan gebied met een glazen Pasteur pipet getrokken en scalpel, indien nodig. Transfer naar fibronectine gecoate platen met een ml pipet 1.
  3. Voeg 1 ml EBM-2.
  4. Oversteken van de plaat naar de gebieden waar de cellen werden verwijderd aangeven en veranderen het medium. Platen kunnen voor maximaal worden bewaard tot 1 maand, als andere gebieden b mag beginnenlater op het eten.

Opmerking: Als er kleinere verslagen klontjes nodig en pipetteer de geëxplanteerde gebied en neer meerdere malen onder de stereomicroscoop, totdat deze breekt in kleinere stukken. Dit zal resulteren in clusters van enkele beating cellen (zie film 3).

  1. Verander medium twee keer per week tot klaar voor de analyses.

Opmerking: cardiomyocyten verkregen van de protocol bezitten foetale-achtige morfologische en functionele eigenschappen rijping tot een volwassen-achtig fenotype kan worden verkregen door verhogen van de tijd in kweek verder opsplitsen deze cellen.

4. Single Beating Cellen Isolatie en Analyse

  1. Coat 2-kamer dia's (4 cm 2 oppervlakte) of andere geschikte steunen met 5 ug / cm 2 fibronectine verdund in PBS voldoende om de hele cultuur oppervlak bedekken. Als een glazen drager wordt gebruikt, jas met laminine en fibronectine (5 ug / cm <sup> 2 elk).
  2. Verwijder slaan met een Pasteur pipet / scalpel van de platen uit hoofdstuk 3.
  3. Met behulp van een pipet 1 ml, overdracht cellen om een ​​15 ml buis die 500 pi collagenase II (480 U / ml in PBS met Ca en Mg) en incubeer 15 minuten bij 37 ° C, na het schudden van de buis tijdens de incubatie.
  4. Pipet op en neer met een 200 ul pipet. Eventuele klonten blijven, over te dragen aan verse collagenase II en herhaal stap 4.3.
  5. Herhaal stap 4.4 tot er geen grote klonten worden gelaten.
  6. Inactiveren collagenase met 3 ml EBM-2 (geen AA). De buis kan dan onder de motorkap in een verwarmde rack worden gelaten tot andere tubes zijn klaar. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 4 minuten.
  7. Resuspendeer pellet in 1 ml 0,25% trypsine / EDTA (verdund van een 0,5% stock in 1X PBS) en incubeer bij 37 ° C gedurende 5 minuten. Combineer fracties van ontsluitingen van dezelfde oorspronkelijke monster.
  8. Inactiveren trypsine met 4 ml EBM-2 (geen AA). Passeren cellen door middel van een 18G naald op een 2,5 ml spuit niet meer than 7x. Centrifugeer bij 1000 RCF gedurende 4 minuten.
  9. Resuspendeer cel pellet in 1 ml EBM-2 per putje en plaat. Cellen kunnen worden gebruikt voor functionele en morfologische analyses 2-3 dagen na het uitplaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In onze studies gegenereerd we CM's uit verschillende iPS cellijnen. Deze lijnen werden aanvankelijk geproduceerd op een MEF feeder-laag, maar werden onmiddellijk geplaatst op Matrigel het gebruik van een bepaald medium (ofwel mTESR1 of Nutristem). Verschillende assays werden gebruikt voor het onderhoud van de morfologische eigenschappen, de expressie van markers kenmerkend pluripotente cellen (OCT-4, SSEA4 en TRA1-60) en de stabiliteit van het genoom (figuur 1) te controleren.

Inductie in de cardiale afkomst werd veroorzaakt door samenvoeging van iPS cellen in EBS en cultuur in de aanwezigheid van een specifiek type van serum en AA (Figuren 2A en 2B). Verdragsluitende gebieden vertegenwoordigen 20-35% van het totaal, afhankelijk van de cellijn (Fig. 2C en Film 1). Aanbestedende CMs geïsoleerd uit deze regio's door enzymatische vertering (Film 2) uitgedrukt typische cardiomyocyte structurele eiwitten (troponine, & alpha,-sarcomeer actine, myosine zware ketens α en β), gap junction eiwitten (connexine-43), en de grote ionenkanalen (Figuren 2D-2F). Elektrofysiologische analyse van deze cellen bleek een heterogene populatie cellen omvat met knooppunten, atriale en ventriculaire profielen (data niet getoond, Priori, SG, et al.., J. Clin. Invest., In Press, 14,15,20).

Figuur 1
Figuur 1. Feeder-free iPS cellen onderhoud heeft geen invloed pluripotency. AB) iPS kolonies gegroeid op Matrigel behouden hun menselijke ESC-achtige morfologie, met fase-heldere randen en prominente nucleoli. CD) Immuunfluorescentie analyses tonen iPS cellen juist de uiting van de transcriptiefactor oktober-4 (C)en de TRA1-60 oppervlakte-antigeen (schaalbalken: 50 pm). (D) (E) Cytofluorimetric analyse bevestigde de expressie van typische oppervlak pluripotency antigenen (SSEA-4 en TRA1-60). De gating strategie blijkt uit de linker scatter. (F) Vertegenwoordiger karyotype analyse van iPS cellen gekweekt op Matrigel. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

Figuur 2
Figuur 2. Differentiatie van functionele iPS-afgeleide CM. A) Schematische weergave van de differentiatie protocol. B) Embryoid lichamen geaggregeerd uit iPS cellen. C) Vertegenwoordiging van een gebied van krimp. D) RT-PCR tonening van de expressie van een aantal cardiale-specifieke ionkanalen door de iPS-afgeleide kloppend klonten (CACNA1A - calciumantagonisten, spanningsafhankelijke, alpha subunit 1A; SCN5A - natrium kanaal, voltage-gated, type V, alfasubeenheid; KCNQ1 - kalium voltage- gated kanaal, KQT als onderfamilie, lid 1) en beide vormen van myosine zware keten (MHC-a en MHC-b). Geen expressie detecteerbaar was in iPS cellen, terwijl cDNA van foetale hartspiercellen werd gebruikt als een positieve controle. HGPRT werd gebruikt als huishoud-gen. EF) Immunofluorescentiekleuring showing single iPS-afgeleide CM expressie structurele eiwit α-actine hartspiercellen, cardiaal troponine I (TNNI), en het cardiaal-specifieke splitsing connexine 43 (CNX-43). Schaal bars: 50 pm. Beelden werden verkregen met behulp van een AxioVision Zeiss fluorescentie omgekeerde microscoop en geanalyseerd met ImageJ. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .

<strong> Film 1. Aanbestedende gebied afgeleid van iPS cellen. Klik hier om film te bekijken.

Film 2. Single aanbestedende iPS-afgeleide CMs, verkregen uit enzymatische afbraak van een aanbestedende gebied. Klik hier om film te bekijken.

Movie 3. Kleine aanbestedende cluster, verkregen door gedeeltelijke mechanische dissectie. Klik hier om film te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pluripotente stamcellen hebben het potentieel om spontaan differentiëren in CM, zij het met lage efficiëntie en hoge variabiliteit tussen lijnen. De ontwikkeling van nieuwe methoden inductie is daarom gericht op de verbetering van de werkwijze en bewegen naar meer gedefinieerde protocollen. De meeste van deze nieuwe differentiatie methoden zijn zeer complex en vereist uitgebreide kweekomstandigheden, fijne controle van timing en concentratie van reagentia, en behandeling met dure cytokines en groeifactoren. Ook verschillen in de endogene cytokine signalering niveaus van verschillende iPS cellijnen moeilijk maken om cytokine concentraties vaak worden afgeregeld niveaus voor elke cellijn standaardiseren.

Rijping van de verkregen iPS-afgeleide CMs vormt ook een essentieel aspect om te overwegen bij een poging cardiale differentiatie van iPS cellen voor ziekte modellering en drug discovery toepassingen. De differentiation van menselijke SER's en iPS cellen geeft meestal aanleiding tot CM's met een foetale fenotype dwz zonder dat een volledig volwassen structuur. Dit geldt met name wanneer monolaag gewerkt, en als gevolg dat deze zijn geschikt voor het opwekken, versterken, en het isoleren van specifieke cardiale voorlopercellen populaties 2,3.

In dit scenario, de "klassieke" EBs aggregatie methode, die nog steeds op grote schaal wordt gebruikt voor de ziekte modelleren doeleinden, lijkt beter te passen bij de experimentele behoeften. Deze werkwijze is eenvoudig, economisch, gemakkelijk uitvoerbaar en geschikt voor alle lijnen. Er is geen extra groeifactoren of cytokinen, of eencellige spijsvertering, die vaak niet goed verdragen wordt door iPS cellen, ook, aanvullende behandelingen met ROCK remmers 21 vereisen. Bovendien is de aggregatie in EBS lijkt op het natuurlijke ontwikkelingsproces van een pluripotente cel, met de EBS leveren een 3-dimensionale omgeving en paraCrine signalen die meer op fysiologische omstandigheden. Bovendien is de toevoeging van AA is consistent aangetoond cardiale differentiatie van iPS cellen verbeteren, en ook om de structurele en functionele rijping 18,19 verbeteren. Kiezen iPS cellijnen basis van hun cardiogene potentieel, alsook de keuze van de meest geschikte serum-, kan verder de efficiëntie van CM generatie.

Ten slotte is de hier voorgestelde methode heeft ook het voordeel dat er geen muis feeder cellen, die de mogelijkheid van besmetting met de muis cellen elimineert en ook een verdere vereenvoudiging van de technische procedures voor de iPS cel passage en EBS formatie. Deze methode kent vele voordelen en vormt een aanzienlijke verbetering ten opzichte van eerdere technieken, het openen van de weg naar toekomstige cardiovasculaire regeneratieve geneeskunde toepassingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Geen financiële belangen openbaar te maken.

Acknowledgements

BS werd gesteund door de Universiteit van Milaan-Bicocca Summer Student Research Training Program; onderzoek werd gesteund door fondsen van het Italiaanse ministerie van Volksgezondheid en het Italiaanse Ministerie van Onderwijs, Universiteit en Researchcentrum en Fondazione Humanitas aan GC, we danken Michael VG Latronico voor het kritisch lezen van de manuscript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  3. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  4. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  7. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  8. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
  9. Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
  10. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  11. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
  12. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
  13. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
  14. Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
  16. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
  17. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
  18. Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
  19. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
  20. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
  21. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics