Generering av Human Cardiomyocytes: differentiering protokoll från Feeder-fria mänskliga inducerade pluripotenta stamceller

1Humanitas Clinical and Research Center, Italy, 2Institute of Genetic and Biomedical Research (IRGB), National Research Council (CNR)
Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Pluripotenta stamceller, antingen embryonala eller inducerad pluripotenta stamceller (iPS-celler), utgör en värdefull källa för humana differentierade celler, inklusive hjärtmuskelceller. Här kommer vi att fokusera på hjärt induktion av iPS-celler, som visar hur man använder dem för att uppnå funktionella mänskliga hjärtmuskelceller genom en embryoid organ-baserat protokoll.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Di Pasquale, E., Song, B., Condorelli, G. Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (76), e50429, doi:10.3791/50429 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

För att utreda händelserna kör hjärta utveckling och att bestämma de molekylära mekanismer som leder till hjärtinfarkt sjukdomar hos människor, är det viktigt först att generera funktionella mänskliga hjärtmuskelceller (CMS). Användningen av dessa celler i läkemedelsutveckling och toxicologystudier skulle också vara till stor nytta, vilket gör att nya farmakologiska molekyler för behandling av hjärtsjukdomar som ska valideras prekliniskt på celler av mänskligt ursprung. Av de möjliga källor till CMS inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) är bland de mest lovande, eftersom de kan härledas direkt från lättillgänglig patientvävnad och har en inneboende förmåga att ge upphov till alla celltyper i kroppen 1. Flera metoder har föreslagits för att differentiera iPS-celler på cms, allt från de klassiska embryoidkroppar (EBS) aggregering förhållningssätt till kemiskt definierade protokoll 2,3. I denna artikel kommer vi föreslå en EBS-baserat protokoll och visa hur denna method kan användas för att effektivt generera funktionella CM-liknande celler från feeder-fria iPS-celler.

Introduction

Historiskt sett har undersökningen av de genetiska och molekylära mekanismer som driver mänsklig utveckling och sjukdom varit baserad på generering av genmodifierade djurmodeller. Men många mänskliga fenotyper undgå att framgångsrikt replikeras i möss, främst på grund av de biologiska skillnaderna mellan de två arterna. Å andra sidan, har tillgång till mänskliga vävnader kan vara begränsad och ofta inte tillräckligt med material för att erhållas för fördjupade experimentella studier. Området kardiovaskulär biologi lider båda dessa begränsningar: fysiologi människans hjärta är väsentligt annorlunda än musen, och en betydande mängd av hjärtat vävnad är tillgänglig endast efter slakt eller vid hjärtoperationer. Att hitta en optimal källa för differentiering av funktionella human CMS har därför blivit en central fråga i kardiovaskulär biologi, och stora ansträngningar har gjorts för att ta itu med denna fråga. Olika celltyper har föreslagits, including skelettet myoblasts, lokala hjärt stamceller, benmärg mononukleära celler, endotelceller stamceller och mesenkymala stamceller. Men, erhålles data med dessa celler har inte varit konsekvent 4.

För utvinning av mänskliga embryonala stamceller (ESC) första 5 och den banbrytande upptäckten av inducerade (iPS) pluripotenta stamceller från Yamanaka och Thomson 6,7 verkade senare att erbjuda lösningar: dessa celler har förmågan att växa på obestämd tid och möjlighet att ge upphov till alla celler derivat av de tre groddblad, inklusive CMS. Användningen av iPS-celler ger ytterligare fördelar: som härrör från autologa adulta celler, bär de samma arvsmassa som individ eller patient från vilken de härrör. De tillåter därför utvecklingen av in vitro-modeller som underlättar utredningen av genetiska sjukdomar och mekanismer för utveckling. I kraft av denna egenskap, kan iPS-celler o ocksåvercome problem relaterade till avstötning och etiska frågor 8. Av dessa skäl, även om ekonomiska och sociala råd utgör fortfarande den gyllene standarden inom stamcellsbiologi, är forskare i hela världen går nu mer mot iPS cell-teknik.

iPS-celler är nu anställd för att modellera människans sjukdom in vitro för olika förhållanden, bland annat medfödda kardiovaskulära sjukdomar 9,10. Nyligen, har tillämpningen av iPS-cell sjukdom modellering utförts för monogena hjärtsjukdomar (dvs lång QT-syndrom, katekolaminerga polymorf ventrikeltakykardi) och sjukdomar som hjärtfel är en del av ett komplex fenotyp (dvs. Leopard och Timothy syndrom, dilaterad kardiomyopati). Dessa rapporter bekräftade att patientspecifika iPS-celler som är differentierade på cms uppvisar liknande fenotypiska och funktionella egenskaper som sjukdomen in vivo.

Det finns dockfinns fortfarande många utmaningar för att förbättra effektiviteten av inducera iPS-cellerna in i hjärt-härstamning. Spontan generering av CM från mänskliga ESCs via aggregatbildning kallas embryoidkroppar (EBS) har visat sig framgångsrika 17. Efter denna upptäckt har många andra metoder föreslagits. Många grupper har ökat effektiviteten av differentiering protokoll och har gått mot kemiskt definierade och animaliska biprodukt-fri kultur reagens (se Mummery, C, et al., Circulation Research (2012) för en omfattande översyn av alla befintliga metoder 3 ).

Ändå representerar den klassiska metoden bygger på EB aggregering fortfarande den mest använda för att utföra funktionella studier och undersöka sjukdomsmekanismer. Vår föreslagna protokollet bygger på aggregering av iPS-celler till EB och kultur i närvaro av serum och askorbinsyra, vilket har visat sig öka hjärt differentiering processen och positively påverka mognaden av dessa celler 18,19. I denna artikel kommer vi att gå igenom denna metod i detalj och kommer att visa hur man använder feeder-fria iPS cellinjer för att generera patientspecifika iPS-härledda CMS.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ett. Feeder-free Underhåll och Passaging av mänskliga iPS cellinjer

  1. Förbered Matrigel-belagda rätter. Thaw en injektionsflaska av humant ESC-kvalificerad Matrix på is under en timme och späd den i 25 ml DMEM-F12-medium. Tillsätt 1 ml till vardera 35 mm platta (eller motsvarande belopp per yta om andra rätter används), hålla allt på is och se till att alla plåtar och rör är förkyld. Täck plattorna med aluminiumfolie.

Obs: Matrigel stock koncentrationerna varierar beroende på partiet. Spädningsinstruktioner anges på databladet.

  1. Håll plattorna på is under natten och ta bort från isen nästa dag. Plattorna kan förvaras i kylskåp upp till en vecka innan den används.
  2. Förbered mTESR1 fullständigt medium (eller tina en injektionsflaska med Nutristem medium) och H-ESM (humant ESC medium) enligt tabellen nedan.
    H-ESM SLUTLIG CONC FÖR 500 ml
    Knockout Serum Byte (KSR) 20% 100 ml
    GlutaMAX 100X 2 mM 5 ml
    MEM icke-essentiella aminosyror 0,1 mM 5 ml
    Penicillin-streptomycin 100 E / ml - 0,1 mg / ml 5 ml
    2-merkaptoetanol 0,1 mM 900 | il
    B27 Supplement - utan Vitamina 1% 10 ml
    N2 supplementet 1% 5 ml
    Knockout DMEM - 370 ml

    Stock mediet kan lagras vid 4 ° C i högst 2 veckor. För att förbereda komplett odlingsmedium, är grundläggande FGF precis lagt before matning vid en slutlig koncentration på 20 ng / ml.

Anmärkning: Komplett H-ESM betingad på möss embryonala fibroblaster kan användas i stället för mTESR1 eller Nutristem för iPS-celler.

  1. Placera belagda plattor i en inkubator vid 37 ° C under 30 min till 2 h före passaging.
  2. Celler bör passerats ungefär var 5 dagar, även om de inte har nått sammanflöde. Kolonier bör inte röra.
  3. Ersätt tillväxtmedium med 1 ml dispas (1 mg / ml, lös upp från en 10 mg / ml lager i PBS).
  4. Ta differentiera områden med drog glas Pasteur pipetter. Områden som bör tas bort omfatta krater-liknande eller cystisk strukturer i centrum av kolonierna, och alla områden där cellerna har blivit separerade från kolonier och tillplattade och verkar vara migrera utåt.
  5. Inkubera vid 37 ° C under en kultur huv tills koloni blir gränserna ljusare och börja att lösgöra (vanligtvis runt 5-7 min). Discard dispas. Tvätta med 1 ml H-ESM och kassera.
  6. I 1 ml H-ESM, använd en cell lyftare (spatel-liknande skrapa) att skörda kolonier och samla i en 15 ml Eppendorf-rör. Skölj med 1 ml H-ESM och lägg till röret. Snurra vid 1000 RCF i 4 minuter och avlägsna supernatanten.
  7. Resuspendera pelleten i 1 ml förvärmd tillväxtmedium (antingen mTESR1 eller Nutristem). Undvik att bryta upp klumpar för mycket - pipettera upp och ned mindre än 6-8x. Bestäm hur många celler ska vara klädd och ta bort onödiga celler (vanligen 1:04 eller 1:05 utspädning), t.ex. för 2 plattor vid 01:05, ta bort 600 pl, tillsätt sedan 1,6 ml färskt medium.
  8. Ta Matrigel från plattorna. Placera cellerna droppe för droppe, fördela jämnt över plattan. Undvik att skaka röret överdrivet, eftersom detta kommer att orsaka celler att röra sig mot mitten.
  9. Tvätta rör med 1 ml medium och klyftan mellan plattorna. Slutlig volym i varje platta bör vara 1,5 -2 ml.
  10. Ändra medelstora vardag, utom för dagen efter passage. Även om det äridealiskt att ändra mediet vardag, kan detta ibland ändras vid en frekvens av en gång varannan dag om inte mer än 2-3 dagar har gått sedan den sista passagen utan att påverka pluripotency eller differentiering potential.
  11. Om cellinje skall frysas, återsuspendera stället i 1-2 ml mFreSR frysmediet med en 2 ml pipett och placera 1 ml / cryovial. Placera rören i en cryobox vid -80 ° C och överföring till flytande kväve i 3-4 dagar.

Obs: Manuell microdissection av iPS-celler måste utföras under ett stereomikroskop. En in vitro-fertilisering (IVF) arbetsstation (t.ex. en IVF Workstation från KSystem) integrerad med ett stereomikroskop tillåter manipulering av cellerna i sterila förhållanden medan de hålls på en uppvärmd yta. Om detta inte är tillgängligt, kan ett stereomikroskop flyttas enligt ett regelbundet laminärt flöde huva.

2. Embryoidkroppar Aggregation och Cardiac Induction

  1. Förbered EBM-20 medium enligt tabellen nedan.
    EBM-20 SLUTLIG CONC FÖR 500 ml
    Fetalt bovint serum (ursprung Sydamerika) 20% 100 ml
    MEM icke-essentiella aminosyror 0,1 mM 5 ml
    Penicillin - streptomycin 100 U - 0,1 mg / ml 5 ml
    GlutaMAX 100X 0,1 mM 5 ml
    2-merkaptoetanol 50um 450 | il
    DMEM/F12 - 385 ml

    Användning av FBS i Sydamerika ursprung är avgörande för att bestämma differentiering effektivitet: anställning av andra typer av serum kan påverkadifferentieringsprocessen. För att framställa komplett EBM-20, tillsätt askorbinsyra (AA) till en slutlig koncentration av 50 pg / ml. Komplett odlingsmedium kan lagras vid 4 ° C under högst en vecka.
  2. Harvest iPS kolonier såsom beskrivits ovan (steg 1,6-1,9).
  3. Resuspendera försiktigt i 1 ml EBM-20 med en 2 ml pipett. Undvik att bryta upp klumpar för mycket - pipettera upp och ner mer än 2-3x, kontrollera storleken på kolonierna i stereomikroskop. Platta på ultra-låga fastsättningsplattor i förhållandet 1:1 (t.ex. för en 35 mm skål, använd en brunn i en 6-brunnar). Skölj röret med 1 ml EBM-20 och lägg till plattan.

Obs! Storleken av kolonierna påverkar differentieringsprocessen, kontrollera effektiviteten och timing av hjärt-induktion. Sammanläggning av homogent-sized EB har visat sig minska variabiliteten vid differentiering.

  1. På dag 3, ändra EBM-20 en gång med hjälp av ett mikroskop för att undvika reborttagande av EBS. Håll pipettera nära kanten av plattan, och ta bort mediet.
  2. På dag 7, omkopplaren EBS till plattor belagda med 0,1% gelatin och tidigare placerats vid 37 ° C under 30 min. Vid behov, kan gelatin tas bort och plattorna lämnades under en cellkultur huva O / N. Lägg 35-40 EB per 35 mm skål.
  3. Kontrollera EB för att slå områden och förändring EBM-20 två gånger per vecka. Märk ut var slå områden är belägna på toppen av skålen locket, för att underlätta de lokalisering under stereomikroskop. Avtalsslutande områden bör visas efter cirka 10-20 dagar.
  4. När områden med spontan kontraktion visas, byta medium till EBM-2 (förbereda som EBM-20, med 2% FBS istället) och isolera dem som beskrivs nedan i avsnitt 3.
  5. Fortsätt att kontrollera andra områden för att slå och ändra mediet två gånger per vecka tills slå områden behövs för ytterligare experiment.

Anm: Effektivitet av differentiering processen är starkt beroende avflera faktorer, den mest kritiska av vilka de specifika cellinjer och satsen i serum används för att inducera hjärt differentiering. För att uppnå högsta effektivitet, testa cellinjer för cardiomyogenic potential och olika serumsatser.

Tre. Seger Områden Isolering och kultur

  1. Coat 12-brunnsplattor (4 cm 2 område) eller plattor av intresse med 5 | ig / cm 2 fibronektin, som spätts i PBS för att göra tillräcklig volym för att täcka hela ytan fullständigt (300 | il totalt per brunn i 12-brunnars plattor). Håll avtäckt i cellkultur huva och låt torka. Plattorna kan slås in och lagras vid 4 ° CO / N.
  2. Avlägsna slå området med hjälp av ett glas drog pasteurpipett och skalpell, efter behov. Överföring till fibronektinbelagda plattor med en 1 ml pipett.
  3. Tillsätt 1 ml EBM-2.
  4. Korsa av plattan för att ange de områden där cellerna bort och byta mediet. Plattorna kan förvaras i upp till 1 månad, som andra områden kan börja bäta senare.

Obs: Om mindre slå klumpar behövs, pipettera explanterad området upp och ner flera gånger under stereomikroskop, tills den går sönder i mindre bitar. Detta kommer att resultera i kluster av ett fåtal stryk celler (se film 3).

  1. Ändra mediet två gånger i veckan tills för analyserna.

Obs: Cardiomyocytes erhållna från detta protokoll besitter fetalt-liknande morfologiska och funktionella egenskaper, mognad mot en vuxen-liknande fenotyp kan erhållas genom att öka tiden i odling att ytterligare differentiera dessa celler.

4. Single Seger Celler Isolering och analys

  1. Coat 2-kammare diabilder (4 cm 2 område) eller andra lämpliga stag med 5 ng / cm 2 fibronektin utspädd i tillräcklig PBS för att täcka hela odlingsytan. Om ett glas stöd används, rock med laminin och fibronektin (5 ng / cm <sup> 2 vardera).
  2. Ta slog område med en Pasteur pipett / skalpell från plattorna från avsnitt 3.
  3. Med hjälp av en 1 ml pipett, överföra celler till en 15 ml rör innehållande 500 | il kollagenas II (480 U / ml i PBS med Mg och Ca) och inkubera 15 minuter vid 37 ° C, skaka röret en gång under inkuberingen.
  4. Pipettera upp och ner med en 200 l pipett. Om några klumpar kvar, flytta till frisk kollagenas II och upprepa steg 4.3.
  5. Upprepa steg 4,4 tills inga stora klumpar kvar.
  6. Inaktivera kollagenas med 3 ml EBM-2 (ingen AA). Röret kan sedan bli kvar under huven på en uppvärmd rack tills andra rören är redo. Centrifugera vid 1000 RCF i 4 min.
  7. Resuspendera pelleten i 1 ml 0,25% trypsin / EDTA (utspädd från en 0,5% lager i 1 x PBS) och inkubera vid 37 ° C under 5 min. Kombinera fraktioner av digereringar från samma ursprungliga provet.
  8. Inaktivera trypsin med 4 ml EBM-2 (ingen AA). Pass celler genom en 18G nål på en 2,5 ml spruta inte mer thante 7x. Centrifugera vid 1000 RCF i 4 min.
  9. Resuspendera cellpelleten i 1 ml EBM-2 per brunn och plattan. Cellerna kan användas för funktionella och morfologiska analyser 2-3 dagar efter plätering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I våra studier har vi genererat CM från flera iPS cellinjer. Dessa rader ursprungligen genererades på en MEF matare lager men placerades omedelbart på Matrigel använda ett definierat medium (antingen mTESR1 eller Nutristem). Olika analyser användes för att kontrollera underhåll av morfologiska egenskaper, uttrycket av markörer typiska av pluripotenta celler (OCT-4, SSEA4 och TRA1-60) och deras genom stabilitet (figur 1).

Induktion in i hjärt härstamning utlöstes av aggregering av iPS-celler till EB och kultur i närvaro av en specifik typ av serum och AA (figur 2A och 2B). Avtalsslutande områden utgjorde 20-35% av den totala, beroende på cellinjen användas (figur 2C och Movie 1). Upphandlande CM isolerats från dessa regioner genom enzymatisk spjälkning (film 2) uttryckte typiska cardiomyocyte strukturella proteiner (cardiac troponin, & alpha,-sarkomeriskt aktin, myosin tunga kedjor α och β), GAP proteiner korsning (connexin-43), och de stora jonkanaler (Figurerna 2D-2F). Elektrofysiologisk analys av dessa celler avslöjade en heterogen population som innefattar celler med nodal, atrial, och profiler ventrikulära (data visas ej, Priori, SG, et al., J. Clin. Invest., Under tryckning, 14,15,20).

Figur 1
Figur 1. Feeder-free iPS-celler underhåll påverkar inte pluripotency. AB) iPS kolonierna odlade på Matrigel behåller sin mänskliga ESC-liknande morfologi, med fas-ljusa kanter och framträdande nukleolerna. CD) Immunfluorescensstudier analyser som visar iPS-celler korrekt uttrycker transkriptionsfaktor OKT-4 (C)och TRA1-60 ytantigen (skala staplar: 50 | im). (D) (E) Cytofluorimetric analys bekräftade expression av typiska yt pluripotensbestämmande antigener (SSEA-4 och TRA1-60). Gating Strategin framgår av den vänstra scatter. (F) Representant karyotype analys av iPS-celler som odlas på Matrigel. Klicka här för att visa en större bild .

Figur 2
Figur 2. Differentiering av funktionella iPS-härledd CMS. A) Schematisk representation av differentiering protokollet. B) embryoidkroppar aggregerats från iPS-celler. C) Framställning av ett område av kontraktion. D) RT-PCR showning uttrycket av vissa hjärt-specifika jonkanaler av iPS-härledda slå klumpar (CACNA1A - kalciumantagonister, spänningsberoende, alfa 1A subenhet, SCN5A - natrium kanal, spänning-gated, typ V, alfasubenheten, KCNQ1 - kalium spänning- gated kanal, KQT som underfamiljen, medlem 1) och båda formerna av myosin tung kedja (MHC-a och MHC-b). Ingen expression kunde detekteras i iPS-celler, medan cDNA från fostrets hjärta celler användes som en positiv kontroll. HGPRT användes som housekeeping-gen.) EF Immunofluorescens färgning visar gemensam iPS-härledd CMs uttrycker strukturprotein α-sarkomeriskt aktin, cardiac troponin I (TNNI), och hjärt-specifika korsningen connexin 43 (CNX-43). Skala barer: 50 uM. Bilder förvärvades med en AxioVision Zeiss fluorescens inverterat mikroskop och analyserades med ImageJ. Klicka här för att visa en större bild .

<strong> Film 1. Upphandlande område härrör från iPS-celler. Klicka här för att se filmen.

Movie 2. Single upphandlande iPS-härledda CMS erhållits från enzymatisk spjälkning av en upphandlande område. Klicka här för att se filmen.

Movie 3. Små upphandlande kluster, som erhållits genom partiell mekanisk dissektion. Klicka här för att se filmen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Pluripotenta stamceller har potential att differentiera spontant på cms, om än med låg verkningsgrad och hög variabilitet mellan raderna. Utvecklingen av nya induktion metoder har därför fokuserat på att effektivisera processen och går mot mer definierade protokoll. Men de flesta av dessa nya differentiering metoder är ganska komplicerat och kräver genomarbetade odlingsbetingelser, fin styrning av timing och koncentration av reagens, och behandling med dyra cytokiner och tillväxtfaktorer. Även skillnader i de endogena nivåerna cytokinsignalering av olika iPS cellinjer gör det svårt att standardisera cytokin koncentrationer, som ofta måste anpassas till lämpliga nivåer för varje cellinje.

Mognad av den erhållna iPS-härledda CM utgör också en viktig aspekt att beakta när man försöker hjärt differentiering av iPS-celler för sjukdom modellering och drogapplikationer upptäckt. Den differentiation av mänskliga ESCs och iPS-celler ger oftast upphov till CMS med ett foster fenotyp dvs utan en helt mogen struktur. Detta är särskilt sant när enkelskikthöljen metoder används, och som ett resultat dessa är mer lämpade för alstring, förstärkning och isolering av specifika hjärt progenitorceller populationer 2,3.

I detta scenario, verkar det "klassiska" EBS aggregering metod, som fortfarande används i stor utsträckning för ändamål sjukdom modellering, för att bättre passa de experimentella behov. Denna metod är enkel, ekonomisk, lätt genomförbart, och lämpar sig för alla linjer. Det finns inget behov av ytterligare tillväxtfaktorer eller cytokiner, eller för encelliga matsmältning, som ofta inte är mycket väl tolereras av iPS-celler, också, de kräver ytterligare behandlingar med ROCK-hämmare 21. Vidare liknar aggregation till EBS den naturliga utvecklingsprocess av en pluripotent cell, med EBs ger en 3-dimensionell miljö och paracrine signaler som är mer lik fysiologiska förhållanden. Dessutom har tillägg av AA konsekvent visat att förbättra hjärt differentiering av iPS-celler, och även för att förbättra deras strukturella och funktionella mognad 18,19. Välja iPS cellinjer utifrån deras kardiogen potential, tillsammans med valet av den mest lämpliga parti serum, kan ytterligare förbättra effektiviteten i CM generation.

Slutligen har den metod som föreslås här också den fördelen att inte kräva musceller feeder, vilket eliminerar risken för kontaminering med musceller och även ytterligare förenklar de tekniska förfarandena för iPS cell passage och EB bildning. Denna metod ger många fördelar och utgör en betydande förbättring jämfört med tidigare tekniker, banar väg för framtida kardiovaskulära regenerativ medicin applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Inga finansiella intressen att lämna ut.

Acknowledgements

BS fick stöd av University of Milan-Bicocca Sommar Student Research Training Program, forskning stöddes av medel från det italienska hälsoministeriet och italienska utbildningsdepartementet, universitet och forskning och Fondazione Humanitas till GC, vi tackar Michael VG Latronico för kritiskt läsa manuskript.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Media and Reagents
Human ESC-qualified Matrix BD Biosciences 354277 Thaw the 5 ml bottle at 4 °C on ice O/N, aliquot in pre-chilled cryo-tubes on ice, according to the data sheet dilution instructions and store at -20 °C .
Fibronectin, from human plasma, 0.1% solution Sigma F0896-2MG Working concentration: 5 μg/cm2
Laminin Sigma L2020-1MG Working concentration: 5 μg/cm2
PBS (no Mg and Ca), 10X Lonza BE17-515F
PBS (with Mg and Ca), 10X Bio Sera XC-S2067/500
Dispase II, neutral protease, grade II Roche 4942078001 Stock: 10 mg/ml in DMEM-F12 at -20 °C, working solution: 1 mg/ml in PBS (no Mg/Ca)
Trypsin/EDTA, 0.5% Sigma T3924
Collagenase type 2 Worthington 4176 Dilute to 480 U/ml (e.g. 1.6 mg/ml) in PBS with Mg and Ca
DMEM-F12 Life Technologies 21331-020
Knockout DMEM Life Technologies 10829-018
Knockout Serum Replacement (KSR) Life Technologies 10828-028 Thaw at 4 °C, aliquot and store at -20 °C
F–tal Bovine Serum (origin South America) Invitrogen 10270-106 Batches should be tested for their cardiogenic potential. Thaw at 4 °C, heat-inactivate at 56 °C for 30 min, aliquot and store at -20 °C
PenStrep, penicillin-Streptomycin, 100X Life Technologies 15140-122
GlutaMAX, 100X Life Technologies 35050-038
MEM NEAA, 100X Invitrogen 11140-135
N2 supplement, 100X Life Technologies 17502-048
B27 supplement, 50X Life Technologies 12587-010
2-mercapt–thanol Invitrogen 31350-010
Gelatin, from porcine skin Sigma G1890-100G Make stock at 1% in water, store at -20 °C. Dilute to 0.1% in PBS and keep at 4 °C
mTeSR1 Stem Cell Technologies 5850 Combine Supplement 5X with the basic medium, aliquot and store at -20 °C. Do not keep complete medium at 4 °C for more than 1 week
Nutristem hESC XF Stemgent from Biological Industries 05-100-1A Thaw at 4 °C O/N, aliquot and store at -20 °C until use. Aliquots may be kept at 4 °C for no more than a week.
mFreSR Stem Cell Technologies 5853
Ascorbic acid Sigma A4544-25G Prepare stocks at 10 mg/ml in water. Store aliquots at -20 °C in the dark. Add to EBM at the final concentration (500X)
Plasticware
35 mm culture dishes Becton Dickinson 353001
Cell scraper Corning Incorporated 3008
12-well plates Becton Dickinson 353043
Permanox 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177437
Glass 2-well chamber slides Thermo Fisher Scientific 177380
6-well plates, ultra-low-attachment surface Corning Incorporated 3471
18G needle Becton Dickinson 304622
Glass pasteur pipettes, 230 mm VWR International 612-1702
2.5 ml syringe Becton Dickinson 300188
Equipments
IVF Workstation KSystem, by Nikon
Nikon SMZ1500 Stereomicroscope Nikon

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function. Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).
  2. Laflamme, M. A., Murry, C. E. Heart regeneration. Nature. 473, 326-335 (2011).
  3. Mummery, C. L., et al. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circulation Research. 111, 344-358 (2012).
  4. Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. Origins and fates of cardiovascular progenitor cells. Cell. 132, 537-543 (2008).
  5. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
  6. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (2007).
  7. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318, 1917-1920 (2007).
  8. Yamanaka, S. A fresh look at iPS cells. Cell. 137, 13-17 (2009).
  9. Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders. Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).
  10. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
  11. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465, 808-812 (2012).
  12. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).
  13. Yazawa, M., et al. Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome. Nature. 471, 230-234 (2011).
  14. Itzhaki, I., et al. Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells. Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).
  15. Jung, C. B., et al. Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia. EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).
  16. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4, 130ra147 (2012).
  17. Kehat, I., et al. Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes. The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).
  18. Cao, N., et al. Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells. Cell Research. 22, 219-236 (2012).
  19. Takahashi, T., et al. Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes. Circulation. 107, 1912-1916 (2003).
  20. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).
  21. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics