एक मानव 3 डी के ऊतक इंजीनियरिंग * These authors contributed equally

Bioengineering
 

Summary

परीक्षा प्रणाली के रूप में मानव 3D ट्यूमर ऊतकों बनाने के लिए तरीके से वर्णित हैं. इन प्रौद्योगिकियों एक decellularized जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc), प्राथमिक मानव कोशिकाओं और एक प्रवाह बायोरिएक्टर में गतिशील परिस्थितियों में के रूप में अच्छी तरह से स्थिर तहत संवर्धित किया जा सकता है, जो एक ट्यूमर कोशिका लाइन, पर आधारित हैं.

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Moll, C., Reboredo, J., Schwarz, T., Appelt, A., Schürlein, S., Walles, H., Nietzer, S. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460, doi:10.3791/50460 (2013).

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Abstract

कैंसर दुनिया भर में मृत्यु के प्रमुख कारणों में से एक है. वर्तमान चिकित्सकीय रणनीति मुख्य रूप से अपर्याप्त vivo में शारीरिक स्थिति को प्रतिबिंबित जो 2D संस्कृति प्रणालियों में विकसित कर रहे हैं. जैविक 3 डी matrices ऊतक संगठन और सेल भेदभाव के अध्ययन की अनुमति, कोशिकाओं कोशिकाओं स्वयं को संगठित कर सकते हैं जिसमें एक वातावरण प्रदान करते हैं. इस तरह scaffolds प्रत्यक्ष 3 डी सेल सेल बातचीत का अध्ययन करने के लिए विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं का एक मिश्रण के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है. कैंसर ट्यूमर का 3 डी जटिलता की नकल करने के लिए, हमारे समूह एक 3 डी में इन विट्रो ट्यूमर परीक्षण प्रणाली विकसित की है.

हमारे 3 डी ऊतक परीक्षण प्रणाली मॉडल हम अपने decellularized सुअर का मध्यांत्रीय खंड व्युत्पन्न जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc) के साथ स्थापित किया गया है, जो घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर (MPNSTs), के vivo स्थिति. हमारे मॉडल में, हम प्राथमिक fibroblasts, microvascular endothelial कोशिकाओं (के साथ एक संशोधित BioVaSc मैट्रिक्स reseededmvECs) और S462 ट्यूमर कोशिका लाइन. स्थिर संस्कृति के लिए, BioVaSc के संवहनी संरचना हटा दिया जाता है और शेष पाड़ एक तरफ (छोटा आंतों submucosa सीस-muc) पर खुला कट जाता है. परिणामस्वरूप मैट्रिक्स तो दो धातु के छल्ले (सेल मुकुट) के बीच तय हो गई है.

एक अन्य विकल्प संस्कृति तनाव कतरनी के लिए कोशिकाओं को उजागर करता है कि एक प्रवाह bioreactor प्रणाली में सेल वरीयता प्राप्त सीस-muc है. इधर, बायोरिएक्टर एक आत्म - निर्माण इनक्यूबेटर में एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़ा है. एक कंप्यूटर रक्तचाप, तापमान, और प्रवाह की दर के रूप में मानकों के माध्यम से धमनी ऑक्सीजन और पोषक तत्वों की आपूर्ति को नियंत्रित करता है. इस सेटअप दबाव विनियमित काँपने के गुणवाला या निरंतर प्रवाह के साथ या तो एक गतिशील संस्कृति के लिए अनुमति देता है.

इस अध्ययन में, हम सफलतापूर्वक MPNSTs के लिए एक स्थिर और गतिशील 3 डी संस्कृति प्रणाली दोनों स्थापित कर सके. एक अधिक प्राकृतिक 3 डी वातावरण में कैंसर के ट्यूमर को मॉडल करने की क्षमता की खोज, परीक्षण, और सत्यापन के लिए सक्षम हो जाएगाएक मानव की तरह मॉडल में भविष्य फार्मास्यूटिकल्स.

Introduction

नई दवाइयों उनकी गुणवत्ता, सुरक्षा, और बाजार प्राधिकरण से पहले प्रभावकारिता के संबंध में मान्य होना चाहिए. तिथि करने के लिए, पशु प्रयोगों औषधि परीक्षण और सत्यापन के लिए मानक तरीका है. बहरहाल, कारण प्रजाति विशेष के मतभेदों को, पशु प्रयोगों अक्सर व्यापक मनुष्यों 1 में यौगिकों के प्रभाव का मूल्यांकन नहीं है. इस कारण से, यह नई दवाओं और पदार्थों के इन विट्रो परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि मानव ऊतक मॉडल उत्पन्न करने के लिए महत्वपूर्ण है.

हमारे समूह का ध्यान केंद्रित का एक हमारे जैविक vascularized पाड़ (BioVaSc) 2,3 के साथ इन विट्रो परीक्षण मॉडल की रचना है. BioVaSc एक स्थिर या गतिशील 3 डी मैट्रिक्स प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. स्थिर संस्कृति के लिए, decellularized सुअर का मध्यांत्रीय खंड (छोटा आंतों submucosa सीस-muc) सेल reseeding के लिए एक धातु डालने में रखा गया है. इस तरह के कैंसर और endothelial कोशिकाओं के रूप में विभिन्न कोशिकाओं, चबूतरा पर संवर्धित किया जा सकता है.

4 का भेदभाव या प्रसार पर कार्रवाई कि, जैविक, यांत्रिक या विद्युत उत्तेजनाओं लागू. टिशू इंजीनियरिंग के क्षेत्र में बायोरिएक्टर के लिए, बुनियादी अवधारणा मानव शरीर में शर्तों अनुकरण करने के लिए है. जिसमें, कोशिकाओं वे एक दूसरे को और उनके आसपास के बाह्य मैट्रिक्स के साथ बातचीत कर सकते हैं, जिसमें एक प्राकृतिक वातावरण प्रदान की जाती हैं. इन विट्रो परीक्षण प्रणाली या प्रत्यारोपण के उत्पादन के लिए, एक उपयुक्त वाहक संरचना और bioreactor प्रणाली के साथ कोशिकाओं के प्राकृतिक वातावरण नकल करने की क्षमता महत्वपूर्ण है 5. इसलिए, अधिक जटिल और तकनीकी रूप से मांग उपकरणों इन कार्यों 6 को पूरा करने के क्रम में विकसित किया जाना चाहिए.

यह establ के लिए हमारे पाड़ उपयोग करने के लिए इसके अलावा संभव हैकारण खिला धमनी, नस, और जोड़ने केशिका बिस्तर शामिल हैं जो संरक्षित ट्यूबलर संरचना, के लिए एक vascularized मॉडल की ishment. सभी सुअर की कोशिकाओं, रासायनिक यांत्रिक और enzymatic decellularization से हटा दिया जाना चाहिए, और पाड़ गामा निष्फल. बहाल ट्यूबलर संवहनी संरचनाओं बाद में पीएच, तापमान, दबाव, पोषक तत्वों की आपूर्ति और कचरे को हटाने के रूप में 6 biomechanical और / या जैव रासायनिक मापदंडों mimics जो एक पुनःपरिसंचरण छिड़काव बायोरिएक्टर 7, का उपयोग मानव microvascular endothelial कोशिकाओं के साथ reseeded किया जा सकता है. ट्यूबलर संरचना का पुन: endothelialization श्लेषजनउत्पादी पाड़ 3,7 के भीतर एक मानव रक्त वाहिनियों बराबर बनाता है. निम्न चरण में, पूर्व लुमेन (म्यूकोसा) की सतह सह संस्कृतियों 3,7,8 स्थापित करने के लिए प्राथमिक मानव कोशिकाओं के साथ वरीयता प्राप्त किया जा सकता है.

इस अध्ययन में एक 3 डी ट्यूमर परीक्षण प्रणाली प्राथमिक सेंट के साथ एक ट्यूमर कोशिका लाइन सह संवर्धन द्वारा निर्धारित हैएसआईएस-muc पर स्थिर और गतिशील परिस्थितियों में romal कोशिकाओं.

Protocol

1. BioVaSc की Decellularization

  1. Cannulated धमनी का उपयोग और पीबीएस के साथ आंतों लुमेन के माध्यम से सुअर का मध्यांत्रीय खंड की नाड़ी तंत्र कुल्ला -. यह पूरी तरह से साफ है जब तक दोहराएँ.
  2. 4 एडाप्टर के साथ एक 200 मिमी व्यास कांच टैंक तैयार है और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप (Ismatec) के लिए सिलिकॉन ट्यूब के माध्यम से उन्हें कनेक्ट. इकाई को नियंत्रित करने का दबाव एक बाँझ डिस्पोजेबल डोम (चित्रा 1 देखें) से जुड़ा हुआ है कि एक प्रेशर सेंसर के माध्यम से नजर रखी जा सकती है.
  3. Decellularization (DZ) समाधान के साथ जलाशय की बोतलें भरें और संभव हवा के बुलबुले के लिए ट्यूबिंग प्रणाली की जाँच करें.
  4. Luminal प्रवाह के लिए कांच कनेक्टर्स के लिए केबल संबंधों के साथ आंतों लुमेन कनेक्ट करें. नाड़ी तंत्र की लाल धमनी एक्सेस (चित्रा 1 बी) में 500 मिलीलीटर DZ समाधान पम्प. शीघ्र ही हाथ से, पूरे आंतों लुमेन बाहर प्रेस करने के लिए पम्पिंग प्रक्रिया हर 15 मिनट में व्यवधान डाला.
  5. Decellularizati दौरानप्राकृतिक रक्तचाप मॉडलिंग के बाद 100 मिमी पारा, - प्रक्रिया पर, बफर समाधान का दबाव 80 के बीच होनी चाहिए.
  6. पीबीएस के साथ BioVaSc धो - यह ("पूरी तरह से सफेद") सेल अवशेष से मुक्त है जब तक.
  7. DZ समाधान के साथ पूरी तरह से BioVaSc भरें और यह एक प्रकार के बरतन कमाल पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में DZ समाधान में डूब सेते हैं.
  8. कदम 1.6 दोहराएँ.
  9. DNase समाधान में BioVaSc रखें और शेखर का घोड़ा पर 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में सेते हैं.
  10. DNase समाधान निकालें और धोने बफर के साथ कुल्ला.
  11. 25 kGy साथ γ-नसबंदी

2. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं

प्राथमिक मानव त्वचीय microvascular endothelial कोशिकाओं (mvECs) और fibroblasts की 2.1 अलगाव

  1. 2 की स्ट्रिप्स में त्वचा बायोप्सी (अधिमानतः preputium) कट - छुरी के साथ 3 मिमी चौड़ाई और उन्हें पीबीएस के साथ 3x कुल्ला - समाधान.
  2. Dispase समाधान के साथ ऊतक कवर और 16 के लिए यह सेते - 14 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटा
  3. अलग 2 चिमटी के साथ dermis से epidermis और पीबीएस + से भरा पेट्री डिश में दोनों अलग हस्तांतरण.
  4. कुल्ला डर्मिस Versene साथ 1x स्ट्रिप्स.
  5. डर्मिस स्ट्रिप्स के लिए 10 मिलीलीटर trypsin / EDTA समाधान जोड़ें और 40 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में यह सेते हैं.
  6. तुरंत 1% FCS साथ एंजाइम प्रतिक्रिया बंद करो.
  7. VascuLife से भरा एक पेट्री डिश के लिए त्वचा स्ट्रिप्स हस्तांतरण और एक छोटे से दबाव उनका कहना है, प्रत्येक पक्ष 8x स्केलपेल के साथ प्रत्येक पट्टी बाहर खरोंच.
  8. एक अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए एक सेल झरनी के माध्यम से उत्पादित सेल निलंबन स्थानांतरण और VascuLife साथ सेल झरनी 3x कुल्ला.
  9. 5 मिनट के लिए 1200 XG पर ट्यूब अपकेंद्रित्र और VascuLife साथ सेल गोली resuspend.
  10. Fibroblasts को अलग करने के लिए, काट डर्मिस स्केलपेल का उपयोग छोटे टुकड़ों में स्ट्रिप्स.
  11. डर्मिस टुकड़े के लिए collagenase समाधान के 10 एमएल जोड़ें.
  12. इनक्यूबेटर में 45 मिनट के लिए यह सेते हैं, तो सु यह अपकेंद्रित्र और ध्यान हटानेpernatant.
  13. DMEM + 10% FCS +% PenStrep, अपकेंद्रित्र इसके साथ गोली 1x धो लें और ध्यान से सतह पर तैरनेवाला हटायें.
  14. संस्कृति के माध्यम में गोली Resuspend और कोशिकाओं ऊतक से बाहर हो जाना करने के लिए अनुमति देने के लिए एक T75 संस्कृति फ्लास्क को हस्तांतरण.

2.2 ट्यूमर कोशिका लाइन S462

(कृपया डॉ. निकोला Holtkamp, ​​चरित विश्वविद्यालय चिकित्सा बर्लिन द्वारा प्रदान की) ट्यूमर कोशिका लाइन S462 वंशानुगत ट्यूमर गड़बड़ी सिंड्रोम neurofibromatosis टाइप 1 से 9 के साथ एक महिला रोगी की एक घातक परिधीय तंत्रिका म्यान ट्यूमर से उत्पन्न किया गया था. S462 10% FCS साथ पूरक DMEM में सुसंस्कृत हैं. 3 दिन - मध्यम हर 2 परिवर्तित किया जाना है. एक सप्ताह में एक बार कोशिकाओं को विभाजित किया जाना है.

3. ट्यूमर परीक्षा प्रणाली: स्टेटिक संस्कृति शर्तों बायोरिएक्टर प्रणाली में गतिशील संस्कृति के साथ तुलना में

  1. ट्यूबलर सीस-muc एक तरफ खुला और दो धातु के छल्ले (सेल मुकुट, 10 मिमी व्यास, आत्म सेल्सियस के बीच यह तय कर लो कटonstructed). रातोंरात सेल संस्कृति माध्यम में एसआईएस-muc कवर.
  2. एसआईएस (मोनो या सह संस्कृति सेट अप) में से एक या दोनों पक्षों पर परिभाषित सेल संख्या में बीज अलग कक्षों (नीचे देखें).
    1. बीज 8,000 कोशिकाओं एसआईएस (पूर्व serosa) की basolateral सतह पर 100 μl की कुल मात्रा में प्राथमिक mvECs के / 2 सेमी. 3 घंटा बाद में एक डुबकी लगाये संस्कृति को सुनिश्चित करने के माध्यम के साथ अच्छी तरह से भरें.
    2. Endothelial कोशिकाओं 3 दिनों के लिए पालन करने की अनुमति. 180 डिग्री से स्थिर संस्कृति प्रणाली पलटें और एक 12 अच्छी तरह से थाली को हस्तांतरण.
    3. एसआईएस (पूर्व लुमेन की ओर) के शिखर सतह पर 500 μl की कुल मात्रा के भीतर प्राथमिक त्वचीय fibroblasts की एक मिश्रण (8000 कोशिकाओं / 2 सेमी) और ट्यूमर कोशिकाओं (15,000 कोशिकाओं / 2 सेमी) बीज.
    4. कोशिकाओं 3 घंटे के लिए पालन करना और मध्यम के साथ अच्छी तरह से भरने की अनुमति (पानी में डुबोया संस्कृति, मध्यम: 10% FCS साथ पूरक 50% Vasculife + 50% DMEM).
    5. ट्यूमर परीक्षण प्रणाली स्थिर शर्तों के तहत सुसंस्कृत हैटी 37 डिग्री सेल्सियस, अतिरिक्त 14 दिनों के लिए इनक्यूबेटर में 5% सीओ 2. 3 दिन - हर 2 मध्यम संस्कृति बदलें.
  3. गतिशील संस्कृति के लिए, दो धातु के छल्ले के बीच सीस-muc तय करने और 3.2.1 में वर्णित के रूप में प्राथमिक mvECs बीज. 3 दिनों के बाद धातु के छल्ले से एसआईएस-muc हटाने और (आंकड़े -2 सी और 2 डी देखें) प्रवाह रिएक्टर में झिल्ली डालें. बायोरिएक्टर में मैट्रिक्स पर एक सिरिंज और प्रवेशनी साथ त्वचीय fibroblasts और ट्यूमर कोशिकाओं प्राथमिक लागू करें, और कोशिकाओं संस्कृति के माध्यम से bioreactor प्रणाली भरने से पहले 3 घंटे के लिए पालन करने के लिए अनुमति देते हैं.
  4. लगातार मध्यम प्रवाह के साथ अगले दिन गतिशील संस्कृति की स्थिति में (3.8 मिलीग्राम / मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2) शुरू किया जा सकता है. गतिशील संस्कृति 14 दिनों के लिए बनाए रखा है, संस्कृति के माध्यम से 7 दिनों के बाद बदल गया है.
  5. गतिशील परीक्षण सेटअप एक पंप और आवश्यक तापमान और सीओ 2 के माध्यम से मीडिया प्रवाह प्रदान करता है कि एक आत्म - निर्माण इनक्यूबेटर में सुसंस्कृत है

4. विश्लेषण के लिए लक्षण तरीकों

4.1 फिक्सिंग और वरीयता प्राप्त श्लेषजनउत्पादी मैट्रिक्स की आयल एम्बेडिंग

  1. (इम्युनो) ऊतकीय अभिलक्षण के लिए संस्कृति मध्यम हटाने और 2 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde के साथ ऊतकों को ठीक.
  2. 4% paraformaldehyde निकालें और एक ऊतक एम्बेडिंग कैसेट को धातु डालने से एसआईएस हस्तांतरण. शेष लगानेवाला हटाने और आयल घुसपैठ के लिए निर्जलीकरण ऊतक पानी.
  3. एक तेल ब्लॉक में एम्बेड करने से पहले, 2 में सीस काट - 3 स्लाइस और कटौती सतहों नीचे की ओर का सामना करना इतना है कि एक तेल से भरे धातु कोष के सांचे में उन्हें जगह है. एक समर्थन के रूप में ढालना के शीर्ष पर ऊतक कैसेट जोड़ें.
  4. 5 माइक्रोन स्लाइस काटें और के लिए सीधे एक 40 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान पर उन्हें नाव, तो उपयुक्त गिलास स्लाइड पर स्लाइड माउंट. Uncoated स्लाइड immunohistological धुंधला के लिए polylysine लेपित स्लाइड लगाव सुधार करने के लिए, एच एंड ई दाग के लिए उपयोग किया जाता है.स्लाइस को अच्छी तरह से सूखा.
  5. आयल पिघल, xylene के साथ इसे हटाने और धुंधला निम्नलिखित के लिए स्लाइस rehydrate.

4.2 धुंधला

  1. rehydrated स्लाइस एक मानकीकृत अवलोकन धुंधला के रूप में Hematoxylin / eosin के साथ दाग जा सकता है.
  2. Immunhistological धुंधला के लिए, तय की और आयल घुसपैठ ऊतक स्लाइस एंटीबॉडी पहचान और उनके विशिष्ट epitopes के लिए बाध्य करने के लिए अनुमति देने के लिए एक प्रतिजन पुनर्प्राप्ति से गुजरना होगा. इसलिए, deparaffinized और rehydrated स्लाइड 20 मिनट के लिए गरम साइट्रेट बफर (6.0 पीएच) के साथ एक भाप कुकर में रखा जाता है.
  3. धुंधला समाधान के लिए आवश्यक मात्रा को कम करने के लिए एक पैप कलम से धोने बफर (0.5 एम टीबीएस बफर + 0.5% के बीच) और वृत्त स्लाइस पर स्थानांतरण स्लाइड.
  4. एक नमी कक्ष में स्लाइड रखें. प्रतिजन प्रतिरक्षी बाध्यकारी का एक विशिष्ट हॉर्सरैडिश peroxidase की मध्यस्थता दृश्य को सुरक्षित करने के लिए, अंतर्जात peroxidase 3% हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ संतृप्त किया जाना चाहिए.
  5. प्राथमिक antibODY dilutions, स्लाइस को लागू आरटी पर 1 घंटे के लिए incubated और ध्यान से धोने बफर के साथ बंद धो रहे हैं.
  6. विशिष्ट प्रतिजन प्रतिरक्षी बाइंडिंग का पता लगाने के लिए अल्ट्रा विजन Quanto जांच प्रणाली एचआरपी थपका (थर्मो वैज्ञानिक) की सिफारिश प्रोटोकॉल के अनुसार किया जाता है.
  7. नाभिक 1 मिनट के लिए Hematoxylin साथ counterstained रहे हैं.
  8. स्लाइड्स, एक जलीय माध्यम के साथ घुड़सवार सूखे, और एक उलटा माइक्रोस्कोप का उपयोग imaged हैं.

Representative Results

चित्रा 1 बी में दिखाया गया है, हम केशिका नेटवर्क के संरक्षित ट्यूबलर संरचना के साथ सुअर का मध्यांत्रीय खंड (लगभग 2 लंबाई में मीटर और व्यास में 20 मिमी) decellularized. रासायनिक, enzymatic और यांत्रिक decellularization के बाद, हम 3 डी सेल संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जो एक कोलेजन मैं / तृतीय पाड़, प्राप्त की. एक Feulgen परीक्षण मैट्रिक्स (नहीं दिखाया डेटा) की पवित्रता (कोई डीएनए अवशेष) प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शन किया था.

आंकड़े 2A और 2 बी सेल मुकुट द्वारा सुरक्षित सीस-muc के स्थिर संस्कृति दिखाते हैं. हम गतिशील संस्कृति के लिए एक घर में बनाया गया बायोरिएक्टर (चित्रा -2) में एसआईएस-muc तय की. चित्रा 2 डी बायोरिएक्टर के कक्ष के माध्यम से नकली गतिशील प्रवाह को दिखाता है. बायोरिएक्टर एक आत्म - निर्माण इनक्यूबेटर प्रणाली में रखा गया है और एक क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप के साथ जुड़ा हुआ है. इस सेटअप दबाव विनियमित काँपने के गुणवाला प्रवाह या ग के साथ या तो एक गतिशील संस्कृति की अनुमति देता है ONSTANT प्रवाह.

चित्रा 3 2D मोनोकल्चर में स्थिर रुप से संवर्धित S462 ट्यूमर कोशिका लाइन के एक सिंहावलोकन (चित्रा 3) देता है और 3 डी coculture (आंकड़े 3B-3D) में. चित्रा 3B ट्यूमर कोशिकाओं S462 और सीस के शिखर पक्ष पर प्राथमिक fibroblasts की ट्रिपल संस्कृति से पता चलता है basolateral पक्ष (पूर्व serosa की ओर) पर MUC (पूर्व भीतरी लुमेन की ओर) और mvEC. विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं की पहचान mvEC (चित्रा -3 सी) लेबल करने के लिए इस तरह वॉन Willebrand कारक के रूप में सेल प्रकार विशिष्ट मार्करों, धुंधला करके संभव है. p53 पॉजिटिव S462 कोशिकाओं p53 नकारात्मक प्राथमिक fibroblasts (चित्रा 3 डी) और कोशिकाओं के 3 डी वितरण विश्लेषण किया जा सकता से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. गतिशील रूप से संवर्धित ट्रिपल संस्कृति के 3 चित्रा 4 से पता चलता stainings बराबर चित्रा.

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चित्रा 1. Decellularization सेट अप. (ए) bioreactor और एक पीसी से नजर रखी BioVaSc, decellularizing के लिए पंप सेट अप. (बी) decellularized BioVaSc ग्लास टैंक में. लुमेन और धमनी इनलेट एडाप्टर से जुड़े हैं. .

चित्रा 2
चित्रा 2. अलग संस्कृति सेट अप के दृश्य पर. Microtiter अच्छी तरह से थाली में स्थिर संस्कृति प्रणाली (ए) सीएडी अनुभाग देखने के लिए, (बी) स्थिर संस्कृति के लिए धातु सम्मिलित, प्रवाह बायोरिएक्टर के ऊपरी ढक्कन के गतिशील संस्कृति के लिए (सी) मध्यम प्रवाह सिमुलेशन (वेग क्षेत्र [एम / सेक]) , (डी) क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला पंप से जुड़े गतिशील संस्कृति के लिए प्रवाह बायोरिएक्टर. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें

ईएनटी "के लिए: रखने together.within पृष्ठ =" हमेशा "> चित्रा 3
चित्रा 3. स्थिर 3D ट्यूमर मॉडल के immunohistological लक्षण वर्णन का अवलोकन. एक Permanox स्लाइड पर S462 कोशिकाओं की स्थिर रुप से संवर्धित 2 डी मोनो संस्कृति की (ए) Hematoxylin दाग, स्थिर रुप से संवर्धित 3 डी ट्रिपल संस्कृति का (बी) एच एंड ई दाग, तीर, वॉन Willebrand कारक के लिए (सी) immunohistological धुंधला, (डी endothelial कोशिकाओं के निशान p53 के लिए) immunohistological धुंधला हो जाना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें

चित्रा 4
(बी) के निशान वॉन Willebrand कारक के लिए immunohistological धुंधला हो जाना, p53 के लिए (सी) immunohistological धुंधला हो जाना. बड़ा आंकड़ा देखने के लिए क्लिक करें

Discussion

अधिक महंगा दृष्टिकोण होने के बावजूद ट्यूमर अनुसंधान, 3 डी सिस्टम में 2 डी और 3 डी संस्कृति प्रणालियों की तुलना, बेहतर जैविक microenvironments में परिस्थितियों की नकल सिद्ध कर दिया है. यह कुछ ट्यूमर कोशिकाओं को एक असली ट्यूमर में स्थिति के अनुसार है, जो एक आम 2 डी संस्कृति 12, में से एक 3 डी संस्कृति में बहुत धीमी हो जाना कि दिखाया जा सकता है. बिसेल और सहकर्मियों कैंसरकारी स्तन कोशिकाओं के व्यवहार एक मैट्रिक्स के भीतर एक 3 डी संस्कृति सेल ईसीएम बातचीत प्रदान करता है और अधिक सही है जब सेल आकारिकी और संकेतन सहित vivo स्थिति, दर्शाता है कि उनके काम में पता चला. इसके अलावा, वे पर्यावरण बातचीत में परिवर्तन एक सामान्य phenotype के लिए घातक कोशिकाओं के प्रत्यावर्तन के लिए नेतृत्व का प्रदर्शन है कि 3 डी में बाह्य वातावरण के महत्व पर बल दिया. इसके अतिरिक्त और सबसे महत्वपूर्ण बात, इन परिणामों को भी विवो पशु मॉडल 10,11 में में इस बात की पुष्टि की जा सकती है.

ontent "> vivo में पशु प्रयोगों और इन विट्रो ऊतक मॉडल में प्रत्यक्ष तुलना दोनों प्रणालियों में फायदे और कमियां पता चलता है. इन विट्रो मॉडल में से एक लाभ एक बेहतर वास्तविक समय या माइक्रोस्कोपी द्वारा तय इमेजिंग की अनुमति है. एक सीमा है कि वे में विवो प्रणालियों अक्सर प्रगति, जबकि स्थिर या अल्पकालिक परिस्थितियों की नकल. वाहिका संरचना और छोटे अणुओं के सामान्य परिवहन की मौजूदा कमी,. प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की मेजबानी, और अन्य सेल सेल बातचीत में इन विट्रो मॉडल 12 से आगे नुकसान कर रहे हैं इसलिए, 3 डी इन विट्रो प्रणाली में इस अध्ययन में प्रस्तुत के रूप में पशु प्रयोगों के लिए एक आशाजनक अलावा प्रदान करते हैं. वे मानव जीव के लिए एक बेहतर तुलनात्मकता प्रदान करते हैं और इसलिए प्रयोगात्मक गलत व्याख्याओं को कम. Biomimetic विवो मॉडल प्रणाली में इसलिए कैंसर और metastatic प्रसार निर्भर है कि कैसे अध्ययन करने के लिए और अधिक प्रासंगिक हो जाएगा tumorig कि विनियमित microenvironmental शर्तों परenesis 11.

हमारे अध्ययन सीस-muc द्वारा प्रदान की 3 डी वातावरण सामान्य 2 डी सेल संस्कृति में नहीं मनाया जाता है जो कोशिकाओं की एक अधिक ट्यूमर की तरह ऊतक गठन, (चित्रा 3 देखें) की ओर जाता है कि पता चलता है. इसके अलावा, ट्यूमर बायोप्सी से व्युत्पन्न प्राथमिक कोशिकाओं का उपयोग व्यक्तिगत दवा, एक मरीज की व्यक्तिगत जरूरतों के आधार पर सबसे अच्छा उपचार की पहचान करने के लिए करना है कि एक अनुशासन की दिशा में एक बहुत ही महत्वपूर्ण कदम है. बायोप्सी सामग्री से अलग प्राथमिक रोगी विशेष के ट्यूमर कोशिकाओं को शामिल चिकित्सीय रणनीतियों के लिए इन विट्रो में परीक्षण की अनुमति देगा. इस तरह की परीक्षा प्रणाली यह संभव है एक समय और लागत की बचत उच्च throughput स्क्रीनिंग में क्या अलग दवाओं और संयोजनों की जांच करने के लिए कर देगा. एक ट्यूमर microenvironment प्रभावों ट्यूमर प्रगति 13 और suitab के रूप में साबित हो सकता है के बाद से ही, इस अध्ययन में दिखाया गया है ट्यूमर जुड़े stromal कोशिकाओं के एकीकरण, व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए महत्वपूर्ण हैLe चिकित्सकीय लक्ष्य.

वैकल्पिक रूप से एक व्यक्तिगत दृष्टिकोण के लिए, हमारे ट्यूमर मॉडल स्थापित tumorigenic सेल लाइनों का समावेश करके एक सामान्यीकृत ट्यूमर परीक्षण प्रणाली के रूप में सेवा करने के लिए संशोधित किया जा सकता है. इस बुनियादी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए एक आशाजनक रूपांतर है. दोनों दवा परीक्षण के लिए एक संवहनी संरचना की उपस्थिति चिकित्सकीय पदार्थों के वितरण और तेज परीक्षण करने के लिए आवश्यक है दृष्टिकोण. एसआईएस-muc मैट्रिक्स बाधा तेज पढ़ाई के लिए प्राथमिक mvEC साथ basolateral बोने की अनुमति देता है, BioVaSc के संरक्षित संवहनी संरचनाओं के reseeding आगे दवा वितरण के अध्ययन में सुधार होगा.

ऊतक मॉडल बनाने के लिए आदेश में, एक 3 डी biodegradable मैट्रिक्स विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं 14 के एक सह संस्कृति के लिए ढांचे के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. ऐसी 3 डी matrices का उपयोग अक्सर एक कार्यात्मक vascularization की अनुपस्थिति द्वारा सीमित है. इस समस्या संरक्षित रक्त वाहिका Str प्रदान करता है जो BioVaSc, का उपयोग करके हल किया जा सकता हैuctures, जो endothelial कोशिकाओं के साथ reseeded किया जा सकता है. इसके अलावा, BioVaSc कोशिकाओं के आसंजन सुनिश्चित करने और ऊतक भेदभाव की सुविधा जो बाह्य घटकों, प्रदान करता है. यह भी bioartificial 3D ऊतकों 7,8,15 की लंबे समय ऊतक विशेष समारोह में सक्षम बनाता है. कार्यात्मक संवहनी के विकल्प के लिए इंजीनियरिंग की शर्त मानव शारीरिक और biomechanical शर्तों की नक़ल है. इसलिए, इन विट्रो में इन आवश्यकताओं को लागू कर सकते हैं जो बायोरिएक्टर प्रणाली, जैविक ट्यूमर मॉडल बनाने के लिए चरम ब्याज की हैं.

BioVaSc के संयोजन, बायोरिएक्टर प्रौद्योगिकी और अलग सेल प्रकार की सह संवर्धन ऐसे angiogenesis और मेटास्टेसिस के रूप में कैंसर की प्रगति के लिए प्रासंगिक तंत्र के अध्ययन की अनुमति देगा जो vascularized ट्यूमर ऊतकों, उत्पन्न करने के लिए एक बहुत ही होनहार विधि है. हम एक बराबर प्रदान करके जानवरों के अध्ययन के पूरक के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण के रूप में इस तरह के ट्यूमर मॉडल देखनेमानव ट्यूमर शरीर क्रिया विज्ञान के लिए.

Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgements

लेखकों बायोरिएक्टर और bioreactor इनक्यूबेटर विकसित करने के लिए अपने तकनीकी सहायता के लिए जनवरी Hansmann (Fraunhofer IGB, स्टटगार्ट) को धन्यवाद देना चाहूंगा.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase solution SERVA 17454 (500 U/ml)
Dispase solution Gibco 17105-041 (2.0 U/ml)
DMEM, high-glucose PAA G0001,3010
DNase ROCHE 10104159001 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep
DZ solution Roth 3484.2 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water
FCS LONZA DE14-801F
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
medical pressure transducer MEMSCAP SP844
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor DAKO Cytomation M0616 Clone F8/86 0.12 μg/ml
mouse monoclonal anti-human p53 DAKO Cytomation IS616 Clone DO-7 ready-to-use
peristaltic pump Ismatec
sterile disposable dome MEMSCAP 844-28
Trypsin / EDTA solution PAA L11-003 0,05%
VascuLife (VEGF-Mv) Lifeline LL-0003
Versene Gibco 15040-033

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References

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Comments

2 Comments

  1. Hi, I am currently working on fish guts and am interested in trying to apply your method to my tissue sections. Would it be possible to find out a little more information about the process, especially the self made rings. Information such as what material was used and tensile strength would be ideal and whether you had tried going smaller then 10mm with any success?

    Reply
    Posted by: Laura L.
    August 21, 2013 - 9:18 AM
  2. Hi,
    thanks for your comment and your interest to adapt our method.
    The metal rings we use are out of stainless steel (V4A). We tried out smaller diameters as well. Therefore we used the cell crown inserts from Scaffdex (http://www.scaffdex.com/sivut/cellcrownâ;„¢48), that are commonly available for 6 / 12 / 24 / 48 and 96 well plates. For our application the 48 well plate inserts were too small, because the porcine gut matrix is very rigid. But maybe it's suitable for your fish guts!?
    About the tensile strength I can not tell you a number, we never measured the strength, it depends also on the tolerances with which your rings are manufactured.
    We wish you success with your experiments.
    Best regards.

    Reply
    Posted by: Jenny R.
    August 22, 2013 - 8:27 AM

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