הנדסת רקמות של 3D אדם
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, University Hospital Würzburg
* These authors contributed equally

Bioengineering
 

Summary

שיטות ליצירת רקמות גידול 3D אדם כמערכות בדיקה מתוארות. טכנולוגיות אלה מבוססות על ביולוגי vascularized פיגום decellularized (BioVaSc), תאים אנושיים יסודיים ושורת תאים סרטניים, אשר יכול להיות מתורבת תחת סטטי, כמו גם בתנאים דינאמיים בזרימת bioreactor.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moll, C., Reboredo, J., Schwarz, T., Appelt, A., Schürlein, S., Walles, H., Nietzer, S. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460, doi:10.3791/50460 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

סרטן הוא אחד הגורמים המובילים למוות בכל עולם. אסטרטגיות טיפוליות הנוכחיות בעיקר מפותחות במערכות תרבות 2D, המשקפות כהלכה תנאים פיסיולוגיים בגוף חי. מטריצות 3D ביולוגיות לספק תאי סביבה שבה תאים יכולים לארגן עצמיים, המאפשרת המחקר של ארגון רקמה והתמיינות תאים. ניתן זורעים פיגומים כגון בתערובת סוגי תאים שונים כדי ללמוד תאי תאי אינטראקציות-3D ישירים של. כדי לחקות את מורכבות 3D של גידולי סרטן, הקבוצה שלנו פיתחה מערכת בדיקה 3D במבחנה גידול.

המודלים שלנו 3D מערכת בדיקת רקמות מצב in vivo של גידולים ממאירים היקפיים עצבים נדן (MPNSTs), שהקמנו עם הקטע שלנו decellularized חזירי jejunal פיגום ביולוגי הנגזר vascularized (BioVaSc). במודל שלנו, אנו reseeded מטריצת BioVaSc שונה עם fibroblasts הראשוני, תאי אנדותל כלי הדם (mvECs) ושורת התאים הסרטני S462. לתרבות סטטי, מבנה כלי הדם של BioVaSc מוסר והפיגום שנותר הוא לחתוך פתוח בצד אחד (מעי הדק submucosa SIS-MUC). מטריקס וכתוצאה מכך הוא קבוע אז בין שתי טבעות מתכת (כתרי תא).

אפשרות נוספת היא תרבות תאי זרע SIS-MUC במערכת bioreactor תזרים החושפת את התאים למאמץ גזירה. הנה, bioreactor מחובר למשאבת peristaltic בחממה הוקם באופן עצמי. מחשב מווסת את חמצן העורקים ואספקה ​​של חומר מזין באמצעות פרמטרים כגון לחץ דם, טמפרטורה וקצב זרימה. התקנה זו מאפשרת לתרבות דינמית עם או pulsatile מוסדר לחץ או זרימה קבועה.

במחקר זה, אנו יכולים לקבוע בהצלחה גם מערכת תרבות 3D סטטי ודינמית לMPNSTs. היכולת למודל גידולים סרטניים בסביבת 3D טבעית יותר תאפשר גילוי, בדיקות, ואימות שלתרופות עתידיות במודל דמוי אדם.

Introduction

תרופות חדשות חייבת להיות מאומתות בכל קשור לאיכותם, בטיחות ויעילות לפני אישור שוק. עד כה, ניסויים בבעלי החיים הם השיטה סטנדרטית לבדיקות סמים ואימות. עם זאת, בשל הבדלי מינים ספציפיים, ניסויים בבעלי החיים לעתים קרובות לא באופן מקיף להעריך את ההשפעה של התרכובות בבני האדם 1. מסיבה זו, חשוב לייצר דגמי רקמה אנושיים שיכול לשמש לבדיקות במבחנה של תרופות וחומרים חדשים.

אחד המוקדים של הקבוצה שלנו הוא היצירה של במבחנה מודלים בדיקה עם הפיגום הביולוגי שלנו vascularized (BioVaSc) 2,3. BioVaSc יכול לשמש כמערכת מטריצת 3D סטטי או דינמית. לתרבות סטטי, מגזר jejunal חזירי decellularized (מעי הדק submucosa SIS-MUC) ממוקם בהוספת מתכת לזריעה מחודשת של תאים. תאים שונים, כגון סרטן ותאי האנדותל יכולים להיות מתורבת על הפיגום.

4. לbioreactors בתחום הנדסת רקמות, הרעיון הבסיסי הוא לדמות את התנאים בגוף האדם. שבו, תאים ניתנים סביבה טבעית שבה הם יכולים לתקשר אחד עם השני והמטריצה ​​תאית המקיפה אותם. לייצור במבחנה מערכות בדיקה או השתלות, היכולת לחקות את הסביבה הטבעית של תאים במערכת bioreactor מבנה מנשא מתאים והיא 5 קריטיים. לכן, מכשירים מורכבים יותר ותובעניים מבחינה טכנית יש לפתח כדי למלא משימות אלה 6.

זה יתר על כן ניתן להשתמש בפיגום שלנו לestablishment של מודל vascularized בשל המבנים צינוריים השתמרו, הכוללים את עורק ההאכלה, וריד, ומיטת נימים המקשרת. כל התאים החזיריים צריכים להסיר על ידי decellularization הכימי, מכאני והאנזימטית, ומעוקר גמא הפיגום. לאחר מכן ניתן יהיה reseeded מבני כלי דם צינורי המשוחזר עם תאי אנדותל כלי הדם אנושיים באמצעות bioreactor סחרור זלוף 7, אשר מחקה את הפרמטרים ביומכנית ו / או ביוכימיים כגון pH, טמפרטורה, לחץ, אספקת חומרי מזון ופינוי פסולת 6. מחדש endothelialization של המבנים צינורי יוצר מקבילה כלי דם אנושית בתוך 3,7 פיגום collagenous. בשלב הבא, את פני השטח של לומן לשעבר (הרירי) ניתן נזרעו עם תאים אנושיים ראשוניים להקמת שיתוף תרבויות 3,7,8.

במחקר זה מערכת בדיקת גידול 3D מוגדרת על ידי שיתוף culturing שורת תאים סרטניים עם st העיקריתאי רומאל בתנאים סטטיים ודינמיים על SIS-MUC.

Protocol

1. Decellularization של BioVaSc

  1. יש לשטוף את מערכת כלי הדם של מגזר jejunal חזירי באמצעות גישת עורקי cannulated ולומן מעיים עם PBS -. חזור על פעולה עד שהוא נקי לחלוטין.
  2. הכן את מיכל זכוכית קוטר 200 מ"מ עם 4 מתאמים ולחבר אותם באמצעות צינורות סיליקון למשאבת peristaltic (Ismatec). לחץ השליטה יחידה ניתן לנטר באמצעות חיישן לחץ שמחובר לכיפה חד פעמית סטרילי (ראה איור 1).
  3. מלא בקבוקי מאגר עם פתרון decellularization (DZ) ולבדוק את מערכת צינורות לבועות אוויר אפשריות.
  4. חבר את לומן מעיים עם קשרי כבל למחברי הזכוכית לזרימה של אור. לשאוב 500 פתרון מיליליטר DZ לגישת עורקים האדום (איור 1) של מערכת כלי הדם. להפסיק את תהליך השאיבה כל 15 דקות זמן קצר ללחוץ ידני חלל המעי כולו.
  5. במהלך decellularizatiבתהליך, הלחץ של פתרון החיץ צריך להיות בין 80-100 מ"מ כספית, במודל של לחץ הדם הטבעי.
  6. שטוף את BioVaSc עם PBS - עד שהוא נקי משרידי תא ("לבן לחלוטין").
  7. מלא BioVaSc לחלוטין עם פתרון DZ ודגירה אותו לצלול בפתרון DZ במשך הלילה ב 4 ° C על הנדנדה ייקרה.
  8. חזור על שלב 1.6.
  9. הנח את BioVaSc בפתרון DNase דגירה במשך הלילה ב 4 ° C על הנדנדה שייקר.
  10. הסר פתרון DNase ולשטוף עם חיץ כביסה.
  11. γ-עיקור עם 25 kGy

2. סוגי התאים השונים

2.1 בידוד של תאים ראשוניים אנושיים אנדותל כלי הדם עורי (mvECs) וfibroblasts

  1. חותכים ביופסיה של עור (רצוי preputium) לרצועות של 2 - 3 מ"מ רוחב עם אזמל ולשטוף אותם 3x עם PBS - פתרון.
  2. כסה את הרקמה עם פתרון Dispase ודגירה אותו ל16-18 שעות ב 4 ° C.
  3. האפידרמיס הנפרד מהדרמיס עם 2 פינצטה ולהעביר את שניהם בנפרד לצלחות פטרי מלאות PBS +.
  4. הדרמיס שטיפת רצועות 1x עם Versene.
  5. הוסף 10 מיליליטר טריפסין / EDTA פתרון לרצועות הדרמיס ודגירה אותו בחממה במשך 40 דקות.
  6. לעצור את תגובת האנזים מייד עם FCS 1%.
  7. העבר את רצועות עור לצלחת פטרי מלאה בVascuLife ולגרד את כל רצועה עם האזמל 8x כל צד, ומוסיף קצת לחץ.
  8. מעביר את ההשעיה התא מיוצרת באמצעות מסננת תא לצינור צנטריפוגות ולשטוף 3x מסננת תא עם VascuLife.
  9. צנטריפוגות הצינור ב1,200 XG במשך 5 דקות ו resuspend התא גלולה עם VascuLife.
  10. כדי לבודד את fibroblasts, הדרמיס לקצוץ רצועות לחתיכות קטנות באמצעות סכין המנתחים.
  11. הוסף 10 מיליליטר של תמיסת collagenase לחתיכות הדרמיס.
  12. דגירה זה 45 דקות בחממה, אז צנטריפוגות ובזהירות להסיר supernatant.
  13. לשטוף 1x גלולה עם FCS% DMEM + 10 +% PenStrep, זה צנטריפוגות ובזהירות להסיר את supernatant.
  14. Resuspend את הכדור במדיום התרבות ולהעביר אותו לבקבוק תרבות T75 כדי לאפשר לגדל תאים מתוך הרקמה.

S462 שורת תאי 2.2 גידול

שורת תאים הסרטניים S462 (הניתן באדיבות על ידי ד"ר ניקולא Holtkamp, ​​אוניברסיטת שריטה הרפואה ברלין) נוצר מגידול ממאיר היקפי עצבים נדן של מטופלת עם סוג נוירופיברומטוזיס תסמונת נטייה התורשתי גידול 1 9. S462 בתרבית DMEM בתוספת FCS 10%. בינוני צריך להיות שונה בכל 2 - 3 ימים. פעם בשבוע התאים צריכים להיות מפוצלים.

3. מערכת מבחן גידול: תנאי תרבות סטטית לעומת דינמית תרבות במערכות Bioreactor

  1. חותכים את SIS-MUC צינורי לפתוח בצד אחד ולתקן אותה בין שתי טבעות מתכת (כתרי תא, 10 בקוטר מ"מ, עצמי גonstructed). כסה SIS-MUC בתרבית תאים בינוניים למשך לילה.
  2. תאי זרע בודד במספרים סלולריים שהוגדרו (ראה להלן) על אחד או שני צדדים של SIS (ההגדרה מונו או התרבות המשותפת).
    1. זרעי 8,000 תאים / 2 סנטימטר של mvECs העיקרי בהיקף כולל של 100 μl על פני השטח basolateral של SIS (serosa לשעבר). 3 שעות מאוחר יותר למלא היטב עם מדיום כדי להבטיח תרבות קומטי.
    2. לאפשר לתאים אנדותל לדבוק במשך 3 ימים. להעיף את מערכת התרבות סטטית על ידי 180 ° ולהעביר אותו לצלחת 12 היטב.
    3. זרעי תערובת של fibroblasts עורי הראשוני (8,000 תאים / 2 סנטימטר) ותאים סרטניים (15,000 תאים / 2 סנטימטר) בהיקף כולל של 500 μl על משטח הפסגה של SIS (בצד של לומן לשעבר).
    4. לאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ולמלא היטב עם מדיום (תרבות קומטי, בינוני: 50% DMEM Vasculife + 50% בתוספת FCS 10%).
    5. מערכת בדיקת הגידול בתרבית בתנאים סטטייםלא 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 באינקובטור במשך 14 ימים נוספים. שנה בינוני תרבות כל 2 - 3 ימים.
  3. לתרבות הדינמית, לתקן SIS-MUC בין שתי טבעות מתכת וזרעי mvECs העיקרי כפי שתואר ב3.2.1. לאחר 3 ימים להסיר את SIS-MUC מטבעות המתכת ולהכניס את הקרום לזרימת הכור (ראה 2C דמויות ו2 ד). החל fibroblasts עור ותאי גידול הראשוני עם מזרק וצינורית על המטריצה ​​בbioreactor, ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות לפני מילוי מערכת bioreactor עם מדיום לתרבות.
  4. בתנאים הבאים היום דינמי התרבות עם זרם בלתי פוסק בינוני (3.8 מיליליטר / דקה, 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) יכול להיות יזם. התרבות הדינמית נשמר ל14 ימים, מדיום התרבות שונה לאחר 7 ימים.
  5. התקנת הבדיקה הדינמית היא בתרבית באינקובטור בהקמה עצמית המספק זרימת מדיה דרך משאבה והטמפרטורה הדרושה וCO 2

4. שיטות אפיון לניתוח

4.1 תיקון ופרפין הטבעה של מטריקס collagenous זרע

  1. ל( חיסוני) אפיונים היסטולוגית להסיר את מדיום התרבות ולתקן רקמות עם paraformaldehyde 4% במשך שעה 2.
  2. הסר paraformaldehyde 4% ולהעביר את SIS מ להכניס את המתכת לקלטת רקמות הטבעה. להשקות את הרקמה להסרת מקבע שנותר ומייבש לחדירת פרפין.
  3. לפני ההטבעה בבלוק פרפין, לחתוך את SIS ב2 - 3 פרוסות ומניחים אותם בתבנית מתכת המלא בפרפין, כך את פני שטח חתך פנים כלפי מטה. הוסף את קלטת הרקמה בחלק העליון של העובש כגיבוי.
  4. לחתוך 5 מיקרומטר פרוסות ולצוף אותם באמבט מים 40 מעלות צלזיוס במשך מיישר, אז הר שקופיות על גבי שקופיות זכוכית מתאימות. שקופיות ללא ציפוי משמשות לכתמי H & E, מגלשות מצופים polylysine עבור מכתים immunohistological כדי לשפר את קובץ מצורף.בואו פרוסות להתייבש היטב.
  5. ממסים פרפין, להסיר אותו עם קסילן ורעננותם פרוסות לבאים מכתים.

4.2 מכתים

  1. יכולות להיות מוכתמות פרוסות rehydrated עם Hematoxylin / Eosin כמכתים סקירה סטנדרטי.
  2. עבור מכתים immunhistological, קבוע ופרוסות רקמות הסתננו פרפין חייבות לעבור אחזור אנטיגן כדי לאפשר נוגדנים להכיר ולהיקשר לאפיטופים הספציפיים שלהם. לכן, deparaffinized ושקופיות rehydrated ממוקמות בסיר אדים עם חיץ ציטרט מחומם (pH 6.0) עבור 20 דקות.
  3. העברת שקופיות לחיץ כביסה (0.5 חיץ + Tween 0.5% M TBS) ופרוסות העיגול עם עט PAP כדי למזער את ההיקף הנדרש לפתרונות מכתים.
  4. מניחים את השקף בתא לחות. כדי להבטיח להדמיה בתיווך peroxidase ספציפית חזרת של אנטיגן נוגדן מחייב, peroxidase אנדוגני חייב להיות רווי במי חמצן 3%.
  5. אנטיב העיקרידילולים ody מוחלים על הפרוסות, טופחו במשך שעה 1 ב RT ולשטוף בזהירות עם חיץ כביסה.
  6. לצורך זיהוי של איגודי נוגדן אנטיגן ספציפיים Ultra Vision Quanto מערכת איתור HRP DAB (Thermo Scientific) משמש על פי הפרוטוקול המומלץ.
  7. גרעיני counterstained עם Hematoxylin דקות 1.
  8. שקופיות הם רכובים עם מדיום מימיים, מיובש, וצלמו באמצעות מיקרוסקופ הפוך.

Representative Results

כפי שניתן לראות באיור 1, אנו decellularized המגזר חזירי jejunal (כ -2 מ 'אורך ו20 מ"מ קוטר) עם מבנים צינוריים השתמרות של רשת הנימים. לאחר כימי, אנזימטי וdecellularization המכני, השגנו פיגום אני קולגן / III, אשר יכול לשמש לתרבית תאי 3D. מבחן Feulgen בוצע כדי להדגים את טוהר (אין שרידי DNA) של המטריצה ​​(מידע לא מוצג).

2A הדמויות ו2B להראות את התרבות סטטי של SIS-MUC המובטח בכתרי התא. אנו קבועים SIS-MUC בbioreactor בתוך הבית תוכנן (איור 2 ג) לתרבות דינמית. איור 2 ד ממחיש את הזרימה הדינמית מדומה דרך החדר של bioreactor. Bioreactor ממוקם במערכת חממה הוקם באופן עצמי ומחובר עם משאבת peristaltic. התקנה זו מאפשרת תרבות דינמית עם או זרימת pulsatile מוסדר לחץ או ג זרימת onstant.

איור 3 נותן סקירה כללית של הקו באופן סטטי בתרבית S462 גידול התא בmonoculture 2D (איור 3 א) ובcoculture 3D (איורים 3 ב-3D). איור 3 ב מציג את התרבות המשולשת של תאים סרטניים S462 וfibroblasts העיקרי בצד הקודקוד של SIS -MUC (צד לומן פנימי לשעבר) וmvEC בצד basolateral (צד serosa לשעבר). זיהוי של סוגי תאים שונים אפשרי על ידי צביעת סמני תאים מסוג מסוימים, כגון גורם פון Willebrand לתייג mvEC (איור 3 ג). ניתן להבחין בין תאי S462 p53 חיובי מfibroblasts העיקרי p53 שלילי (איור 3D) והפצת 3D של תאים ניתן לנתח. נתון מקביל 4 מופעי stainings איור 3 של התרבות המשולשת דינמית בתרבית.

0460/50460fig1.jpg "/>
איור 1. הגדרת Decellularization. Bioreactor () והגדרת משאבה לdecellularizing BioVaSc, פיקוח על ידי מחשב. (B) decellularized BioVaSc במכל זכוכית. לומן וכניסת העורקים מחוברים למתאמים. .

איור 2
איור 2. על תצוגה של קבוצה קופצים התרבות השונות. () צפו בקטע CAD של מערכת תרבות סטטית בצלחת גם microtiter, (ב) מוסיף מתכת לתרבות סטטי, (C) זרימה בינונית סימולציה (שדה מהירות [מ '/ שנייה]) לתרבות הדינמית של המכסה העליון של הזרימה bioreactor , (ד) הזרימה bioreactor לתרבות דינמית המחובר למשאבת peristaltic. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה

אף אוזן גרון "עבור: לשמור-together.within-page =" תמיד "> איור 3
איור 3. סקירה כללית של אפיון immunohistological של מודל גידול 3D סטטי. כתם Hematoxylin (א) לתרבות מונו 2D באופן סטטי בתרבית של תאי S462 בשקופית Permanox, (ב) כתם H & E של התרבות המשולשת 3D באופן סטטי בתרבית, חיצים לסמן תאי אנדותל, (C) צביעת immunohistological לגורם פון Willebrand, (ד ' ) מכתים immunohistological לp53. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה

איור 4
(ב) מכתים immunohistological לגורם פון Willebrand, (C) צביעת immunohistological לp53. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה

Discussion

כאשר משווה בין מערכות תרבות 2D and 3D במחקר גידול, מערכות 3D, למרות היותו הגישה יקרה יותר, הוכיחו לחקות את התנאים במייקר ביולוגי טובים יותר. זה יכול להיות הראה כי חלק מהתאים סרטניים לגדול הרבה יותר איטיים בתרבות 3D מאשר בתרבות משותפת 2D 12, אשר היא בהתאם למצב בגידול אמיתי. ביסל ועמיתים לעבודה הראו בעבודתם כי התנהגותם של תאי שד מסרטנים משקפת את המצב in vivo, כוללים מורפולוגיה תא ואיתות, בצורה מדויקת יותר, כאשר תרבות 3D בתוך מטריצה ​​מציעה תא אינטראקציות-ECM. יתר על כן, הם הדגישו את חשיבותה של הסביבה תאית ב-3D על ידי הוכחת כי שינויים באינטראקציות הסביבתיות הובילו להחזרה של התאים הממאירים לפנוטיפ נורמלי. בנוסף והכי חשוב, יכולים להיות גם אישרו בתוצאות אלה במודלים של בעלי החיים vivo 10,11.

ontent "> ההשוואה הישירה של in vivo ניסויים בבעלי חיים ובדגמי רקמת מבחנה מגלה יתרונות וחסרונות בשתי המערכות. אחד יתרונות של במבחנה מודלים הוא ברשות הרבה יותר טוב בזמן אמת או הדמיה קבועה על ידי מיקרוסקופ. הגבלה היא כי הם מחקים את תנאים לטווח קצר או סטטי, ואילו בvivo מערכות לעתים קרובות התקדמות. חוסר הנוכחי של כלי דם והובלה תקינה של מולקולות קטנות, תארח את תגובה חיסונית, ותאי תאי אינטראקציות אחרות חסרונות נוספים של במבחנה מודלים 12. לכן, 3D במערכות חוץ גופית כפי שהוצגו במחקר זה מציע תוספת מבטיחה לניסויים בבעלי חיים. הם מספקים השוואה טובה יותר לאורגניזם האנושי ולכן למזער פרשנויות מוטעות ניסיוניות. Biomimetic במערכות מודל vivo יהיה מכאן הפך רלוונטי יותר כדי ללמוד איך סרטן והתפשטות גרורה הוא תלוי בתנאי microenvironmental המסדירים tumorigenesis 11.

המחקר שלנו מראה כי סביבת 3D הניתנת על ידי SIS-MUC מובילה להיווצרות יותר כמו גידול רקמות של תאים, אשר לא נצפתה בתרבית תאי 2D הנפוצה (ראה איור 3 א). יתר על כן, השימוש בתאים ראשוניים הנגזרים מביופסיות גידול הוא צעד מאוד חשוב לקראת רפואה אישית, משמעת שמטרתו לזהות את הטיפול הטוב ביותר בהתאם לצרכים האישיים של מטופל. שילוב תאי גידול ראשוני מטופל ספציפי מבודדים מחומר הביופסיה יאפשר בבדיקות במבחנה של אסטרטגיות טיפוליות. מערכות בדיקה מסוג זה תאפשר לחקור תרופות ושילובים שונים ממנו בזמן ותפוקה גבוהה הקרנה לחיסכון בעלויות. בנוסף, השילוב של תאי סטרומה גידולים הקשורים כפי שמוצגים במחקר זה חשוב לגישה אישית, שכן התקדמות גידול השפעות microenvironment של גידול 13 ועשויה להתברר כsuitabיעד טיפולי le.

לחלופין לגישה אישית, מודל הגידול שלנו יכול להיות שונה כדי לשמש כמערכת בדיקת גידול כללית על ידי השילוב של שורות תאים סרטניות שהוקמו. זוהי הסתגלות מבטיחה למטרות מחקר בסיסיות. עבור שני בדיקות הסמים מתקרב לנוכחות של מבנה כלי דם נדרשת כדי לבחון את ההתפלגות וספיגה של חומרים טיפוליים. מטריקס SIS-MUC מאפשר זריעת basolateral עם mvEC העיקרי ללימודי ספיגת מכשול, הזריעה המחודשת של מבני כלי הדם נשמרו של BioVaSc תהיה לשפר עוד יותר את המחקר של אספקת סמים.

על מנת ליצור מודלים רקמות, מטריקס מתכלה 3D יכול לשמש כמסגרת לשיתוף תרבות תאים מסוגים שונים 14. השימוש במטריצות 3D כזה הוא מוגבל לעתים קרובות על ידי היעדר כלי דם תפקודי. בעיה זו ניתן לפתור על ידי השימוש בBioVaSc, המציע str כלי דם נשמרuctures, אשר ניתן reseeded עם תאי האנדותל. יתר על כן, BioVaSc מספק רכיבים תאיים, אשר להבטיח את ההידבקות של התאים ולאפשר בידול רקמות. הוא גם מאפשר את תפקוד הרקמות ספציפי זמן הארוך של רקמות 3D bioartificial 7,8,15. תנאי מוקדם להנדסה של כלי דם תחליפים פונקציונליים הוא החיקוי של פיסיולוגי אנושיים ותנאים ביומכנית. לכן, מערכות bioreactor, אשר יכולה ליישם את הדרישות הללו במבחנה, הן עניין קיצוני ליצירת מודלים גידול ביולוגיים.

השילוב של BioVaSc, טכנולוגית bioreactor ושיתוף תא culturing-סוגים שונים של שיטה מבטיחה מאוד ליצירת רקמות גידול vascularized, אשר תאפשר את המחקר של מנגנונים רלוונטיים להתקדמות סרטן כגון אנגיוגנזה וגרורות. אנו רואים גידול מודלים כגון גישה מבטיחה למשלימים מחקרים בבעלי חיים על ידי מתן שווה ערךלפיסיולוגיה של הגידול האנושי.

Disclosures

יש מחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות ליאן Hansmann (Fraunhofer IGB, שטוטגרט) לתמיכה הטכנית שלו לפתח bioreactors וחממת bioreactor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase solution SERVA 17454 (500 U/ml)
Dispase solution Gibco 17105-041 (2.0 U/ml)
DMEM, high-glucose PAA G0001,3010
DNase ROCHE 10104159001 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep
DZ solution Roth 3484.2 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water
FCS LONZA DE14-801F
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
medical pressure transducer MEMSCAP SP844
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor DAKO Cytomation M0616 Clone F8/86 0.12 μg/ml
mouse monoclonal anti-human p53 DAKO Cytomation IS616 Clone DO-7 ready-to-use
peristaltic pump Ismatec
sterile disposable dome MEMSCAP 844-28
Trypsin / EDTA solution PAA L11-003 0,05%
VascuLife (VEGF-Mv) Lifeline LL-0003
Versene Gibco 15040-033

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).
  2. Pusch, J., Votteler, M., et al. The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine. Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).
  3. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).
  4. Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. Principles of tissue engineering. 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).
  5. Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).
  6. Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).
  7. Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).
  8. Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research. Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).
  9. Holtkamp, N., Atallah, I., et al. MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors. Neoplasia. 9, 671-677 (2007).
  10. Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  11. Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. Translating tissue engineering technology platforms into cancer research. J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).
  15. Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J. Urol. 173, 276-280 (2005).

Comments

2 Comments

  1. Hi, I am currently working on fish guts and am interested in trying to apply your method to my tissue sections. Would it be possible to find out a little more information about the process, especially the self made rings. Information such as what material was used and tensile strength would be ideal and whether you had tried going smaller then 10mm with any success?

    Reply
    Posted by: Laura L.
    August 21, 2013 - 9:18 AM
  2. Hi,
    thanks for your comment and your interest to adapt our method.
    The metal rings we use are out of stainless steel (V4A). We tried out smaller diameters as well. Therefore we used the cell crown inserts from Scaffdex (http://www.scaffdex.com/sivut/cellcrownâ;„¢48), that are commonly available for 6 / 12 / 24 / 48 and 96 well plates. For our application the 48 well plate inserts were too small, because the porcine gut matrix is very rigid. But maybe it's suitable for your fish guts!?
    About the tensile strength I can not tell you a number, we never measured the strength, it depends also on the tolerances with which your rings are manufactured.
    We wish you success with your experiments.
    Best regards.

    Reply
    Posted by: Jenny R.
    August 22, 2013 - 8:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics