İnsan 3D Doku Mühendisliği * These authors contributed equally

Bioengineering
 

Summary

Test sistemleri olarak insan 3D tümör dokuları oluşturmak için yöntemler tarif edilmiştir. Bu teknolojiler, decellularized Biyolojik Vaskülarize İskele (BioVaSc), primer insan hücreleri ve bir akış biyoreaktör içinde dinamik koşullar altında hem de statik altında kültürlenebilir bir tümör hücre hattı, dayanmaktadır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Moll, C., Reboredo, J., Schwarz, T., Appelt, A., Schürlein, S., Walles, H., Nietzer, S. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460, doi:10.3791/50460 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Kanser dünya çapında önde gelen ölüm nedenlerinden biridir. Şu an tedavi stratejileri ağırlıklı olarak yetersiz in vivo fizyolojik koşulları yansıtacak 2D kültür sistemlerinde, gelişmiştir. Biyolojik 3D matrisler doku organizasyonu ve hücre farklılaşmasının çalışma izin, hücreler kendini organize bir ortam sağlar. Bu tip iskeleler doğrudan 3D, hücre-hücre etkileşimleri incelemek için, farklı hücre tiplerinin karışımı ile tohumlandı edilebilir. Kanser tümörlerinin 3D karmaşıklığını taklit etmek, bizim grup bir 3D in vitro tümör testi sistemi geliştirdi.

Bizim 3D doku test sistemi modelleri bizim decellularized domuz jejunal segmentte elde edilen biyolojik kanlanan iskele (BioVaSc) ile kurulan malign periferik sinir kılıfı tümörü (MPNSTs), in vivo durum. Bizim modelde, birincil fibroblastlar, mikrovasküler endotel hücreleri ile (modifiye BioVaSc matris reseededmvECs) ve S462 tümör hücre hattı. Statik kültür için BioVaSc vasküler yapısı çıkarılır ve geriye kalan iskele bir tarafta (küçük bağırsak mukozada SIS-Muc) açık kesilir. Elde edilen matris, iki metal halkalar (hücre kron) arasında sabitlenir.

Başka bir seçenek kesme stresine karşı kültür hücreleri ortaya akış biyoreaktör sistemi içinde hücre tohumlanmış SIS-Muc etmektir. Burada, biyoreaktör kendinden inşa inkübatör içerisinde bir peristaltik pompa bağlanmıştır. Bir bilgisayar gibi kan basınç, sıcaklık ve akış hızı gibi parametreleri ile arteriyel oksijen ve besin kaynağı düzenler. Bu kurulum, basınç-regüle ya da aralıklı ya da sürekli akışı ile dinamik bir kültürü sağlar.

Bu çalışmada, başarılı MPNSTs için statik ve dinamik 3D kültür sistemi hem de kurabilir. Daha doğal bir 3D ortamda kanser tümörleri model yeteneği keşif, test ve doğrulama ve sağlayacakBir insan gibi modelinde gelecek ilaç.

Introduction

Yeni ilaç kalitesi, güvenliği, ve ruhsat öncesi etkinlik açısından valide edilmelidir. Bugüne kadar, hayvan deneyleri uyuşturucu testi ve doğrulama için standart bir yöntemdir. Ancak, türe özgü farklılıklar nedeniyle, genellikle hayvan deneyleri kapsamlı insanlarda 1 bileşiklerin etkisini değerlendirmek yoktur. Bu nedenle, bu yeni ilaçlar ve maddelerin in vitro testler için kullanılabilir insan doku modelleri oluşturmak için önemlidir.

Grubumuzun odaklarından biri, bizim biyolojik kanlanan iskele (BioVaSc) 2,3 ile in vitro test modellerinin oluşturulmasıdır. BioVaSc, bir statik veya dinamik 3D matris sistemi olarak kullanılabilir. Statik kültür için hücresizleştirilmiş domuz jejunal segment (küçük bağırsak mukozada SIS-Muc) hücre yeniden tohumlama için bir metal uç yerleştirilir. Kanser ve endotel hücreleri gibi çeşitli hücreler, bir platform üzerinde kültürlenebilir.

4 farklılaştırma veya çoğalması üzerine hareket, biyolojik, mekanik veya elektrik uyaranlara uygulamak. Doku mühendisliği alanında biyoreaktörler için, temel kavram, insan vücudundaki koşullarını taklit etmektir. Bu formülde, hücreler birbirlerine ve kendi çevre hücre dışı matris ile etkileşim için doğal bir ortam sağlanmaktadır. In vitro test sistemleri veya transplantların üretimi için, uygun bir taşıyıcı yapı ve biyoreaktör sistemi ile hücrelerin doğal ortamı taklit edilmesi yeteneği kritiktir 5'tir. Bu nedenle, daha karmaşık ve teknik olarak zorlu cihazlar bu görevleri 6 yerine getirmek amacıyla geliştirilmiş olmalıdır.

Bu establ için iskele kullanmak da mümkündürnedeniyle besleme arter, ven ve bağlantı kapiler yatak bulunmaktadır korunmuş boru şeklindeki yapılar, bir vaskülarize modeli ishment. Tüm hücreler, domuz, kimyasal, mekanik ve enzimatik decellularization ile kaldırılması gerekir ve iskele gama-sterilize edilmiştir. Geri boru vasküler yapılar daha sonra, pH, sıcaklık, basınç, besin kaynağı ve atık çıkarma 6 olarak biyomekanik ve / veya biyokimyasal parametreler taklit eden bir devridaim perfüzyon biyoreaktörü kullanarak 7, insan mikrovasküler endotelyal hücreleri ile tohumlandı edilebilir. Boru şeklindeki yapıların yeniden endotelizasyon kollajen iskele 3,7 olan bir insan kan damarı eşdeğer oluşturur. Bir sonraki adımda, eski lümen (mukoza) yüzey ko-kültürler 3,7,8 kurmak için primer insan hücreleri ile tohumlanabilmektedir.

Bu çalışmada, 3 boyutlu bir tümör test sistemi primer st olan bir tümör hücre çizgisi ko-kültür tarafından kurulmuşDİE-Muc statik ve dinamik koşullar altında romal hücreleri.

Protocol

1.. BioVaSc ve Decellularization

  1. Kanüle arter erişim ve PBS ile bağırsak lümeni ile domuz jejunal segmentin damar sistemi yıkayın -. Tamamen temiz olana kadar tekrarlayın.
  2. 4 adaptörleri ile 200 mm çaplı cam tankı hazırlayın ve peristaltik pompa (Ismatec) silikon tüpler aracılığıyla bağlayın. Kontrol ünitesi basınç steril tek kubbe (bkz. Şekil 1) bağlı olan bir basınç sensörü ile izlenebilir.
  3. Decellularization (DZ) çözümü ile rezervuar şişeleri doldurmak ve olası hava kabarcıklarının için boru sistemini kontrol.
  4. Lümen akışı için cam konnektörlerine kablo bağları ile bağırsak lümeni bağlayın. Damar sisteminin kırmızı arter erişim (Şekil 1B) içine 500 ml DZ çözelti pompası. Kısa bir süre elle tüm intestinal lümen dışarı basın pompalama işlemini her 15 dk kesiyoruz.
  5. Decellularizati sırasındadoğal kan basıncı örnek alınarak 100 mm Hg, - süreç, tampon çözeltinin basıncı 80 arasında olmalıdır.
  6. PBS ile BioVaSc yıkayın - bu ("tamamen beyaz") hücre kalıntıları çıkana kadar.
  7. DZ solüsyonu ile tamamen BioVaSc doldurun ve sallanan çalkalayıcı üzerinde 4 ° C de gece boyunca daldırın DZ çözelti içinde inkübe edilir.
  8. Adımı 1.6 tekrarlayın.
  9. DNase çözelti içinde BioVaSc yerleştirin ve çalkalayıcıyı sallanan üzerinde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilir.
  10. DNaz çözüm çıkarın ve yıkama tamponu ile yıkayın.
  11. 25 kGy ile γ-sterilizasyon

2. Farklı Hücre Tipleri

Primer insan dermal mikrovasküler endotelial hücreleri (mvECs) ve fibroblast 2.1 izolasyonu

  1. 2 şeritler halinde deri biyopsisi (tercihen preputiumda) Cut - neşter ile 3 mm genişliğinde ve onları PBS ile 3x yıkayın - çözüm.
  2. Dispase çözeltisi ile doku örtün ve 16 için inkübe - 14 ° C 'de 8 saat
  3. Ayrı 2 cımbız ile dermis epidermis ve PBS + ile dolu petri kutularının içine de ayrı ayrı aktarmak.
  4. Durulama dermis Versene ile 1x şeritler.
  5. Dermis şeritlere 10 ml tripsin / EDTA solüsyonu ilave edin ve 40 dakika boyunca inkübatör içinde inkübe edilir.
  6. Hemen% 1 FCS ile enzim reaksiyonu durdurun.
  7. VascuLife ile dolu bir petri deri şeritler aktarın ve biraz baskı ekleyerek, her tarafta 8x neşter ile her şerit çizik.
  8. Bir santrifüj tüpüne bir hücre süzgecinden ile üretilen hücre süspansiyonu aktarın ve VascuLife ile hücre filtresi 3 kez yıkayın.
  9. 5 dakika boyunca 1,200 x g de santrifüj ve tüp VascuLife ile hücre pelletini.
  10. Fibroblastlar izole etmek, pirzola dermis neşter kullanarak küçük parçalar halinde şeritler.
  11. Dermis parçalara kollajenaz çözüm 10 ml ekleyin.
  12. Kuluçka makinesi içinde 45 dakika için inkübe edilir, sonra su da santrifüj ve dikkatli bir şekilde çıkarınpernatant.
  13. DMEM +% 10 FCS +% Penstrep ile tedarik edilmiş, santrifüj onunla pelet 1x yıkayın ve dikkatlice süpernatant kaldırmak.
  14. Kültür ortamı içinde pelet yeniden süspanse edin ve hücreleri, doku dışında büyümeye izin veren bir T75 kültür şişesine aktarın.

2.2 Tümör Hücre Hattı S462

(Lütfen Dr Nikola Holtkamp, ​​Charite Üniversitesi Tıp Berlin tarafından sağlanan) tümör hücre hattı S462 herediter tümör yatkınlık sendromu Nörofibromatozis tip 1 9 olan bir kadın hastanın malign periferik sinir kılıfı tümörü elde edildi. S462,% 10 FCS ile takviye edilmiş DMEM içinde kültürlenir. 3 gün - Medium her 2 değiştirilmelidir. Haftada bir hücreler bölünmüş olması gerekir.

3. Tümör Test Sistemi: Statik Kültür Koşulları Biyoreaktörü'nün Sistemlerinde Dinamik Kültür ile karşılaştırıldığında

  1. Boru şekilli SIS-Muc bir tarafta açık ve iki metal halkalar (hücre kron, 10 mm çap, kendi C arasında tamir Kesonstructed). Gece boyunca, hücre kültür ortamı içinde SIS-Muc örtün.
  2. SIS (mono-ya da ko-kültür set-up) bir ya da her iki tarafta tanımlanmış hücre sayıları Tohum izole edilmiş hücreler (aşağıya bakınız).
    1. Tohum 8.000 hücre SIS (eski Seroza) bazolateral yüzeyi üzerine 100 ul toplam hacim içinde birinci mvECs of / cm 2. 3 saat sonra, bir daldırılmış kültür sağlamak için ortam ile kuyu doldurun.
    2. Endotel hücreleri 3 gün boyunca yapışmaya izin verin. 180 ° statik kültür sistemi çevirin ve 12-iyi levhaya transfer.
    3. SIS (eski lümenin tarafı) apikal yüzeyi üzerinde 500 ul toplam hacim içinde birinci dermal fibroblastlarda oluşan bir karışım (8.000 hücre / cm 2) ve tümör hücreleri (15,000 hücre / cm 2) tohum.
    4. Hücreler, 3 saat boyunca bağlı ve orta ile iyi doldurmak için izin verir (daldırılmış kültür ortamı:% 10 FCS ile takviye edilmiş% 50 Vasculife +% 50 DMEM).
    5. Tümör test sistemi, statik şartlar a altında kültürlenmekteT 37 ° C, ilave 14 gün boyunca inkübatör içinde% 5 CO2. 3 gün - her 2 kültür ortamı değiştirin.
  3. Dinamik kültürü için, iki metal halkalar arasındaki SIS-Muc düzeltmek ve 3.2.1 de açıklandığı gibi birincil mvECs tohum. 3 gün sonra, metal halkalar SIS-Muc çıkarın ve (Şekiller 2C ve 2D bakınız) akış reaktörüne membran yerleştirin. Biyoreaktör içinde bir matris üzerine bir şırınga ve kanül ile dermal fibroblastlar ve tümör hücrelerinin birincil uygulanır ve hücreler, kültür ortamı ile biyoreaktör sistemi doldurulmadan önce 3 saat boyunca yapışmaya izin verir.
  4. Sabit orta akış ile ertesi gün dinamik kültür koşulları üzerinde (3.8 ml / dakika, 37 ° C ve% 5 CO2) başlatılabilir. Dinamik Kültür 14 gün boyunca muhafaza edilir, kültür ortamı, 7 gün sonra değiştirilir.
  5. Dinamik test düzeneği, bir pompa ve gerekli sıcaklık ve CO2 ile ortam akışı sağlayan, kendi kendine yapılan inkübatörde kültüre

4. Analiz için Karakterizasyon Yöntemleri

4.1 Tespit ve seribaşı kollajen matriks parafin-gömme

  1. (Imüno-) histolojik karakterizasyonu için, kültür ortamı çıkarın ve 2 saat boyunca% 4 paraformaldehit ile doku tamir.
  2. % 4 paraformaldehid çıkarın ve bir doku gömme kasetine metal ovülden SIS aktarın. Kalan Fiksatif kaldırmak ve parafin infiltrasyonu için kurutmak için doku sulayın.
  3. Bir parafin bloğu içine yerleştirilmeden önce, 2 SIS kesilmiş - 3 dilim ve kesme yüzeyleri aşağı doğru gelecek şekilde bir parafin dolu metal taban kalıp yerleştirin. Bir destek olarak, kalıbın üst doku kaseti ekleyin.
  4. 5 mikron dilim kesin ve düzleştirme için bir 40 ° C su banyosunda onları yüzer, daha sonra uygun bir cam slaytlar üzerine monte slaytlar. Kaplanmamış slaytlar immünohistolojik boyama için polilisin ile kaplanmış dilimlerin yapışması için, H & E lekeler için kullanılır.Dilimleri iyice kurumasını bekleyin.
  5. Parafin eritin, ksilen ile çıkarın ve lekelenme aşağıdaki için dilimleri depoIayabiIirIer.

4.2 Boyama

  1. Rehydrated dilimler standartlaştırılmış bakış boyama olarak Hematoksilen / Eosin ile boyanmış olabilir.
  2. Immunhistological boyama için, sabit ve parafine infiltre doku dilimleri antikorları tanıyan ve spesifik epitoplara bağlanan izin vermek için bir antijen alma geçmesi gerekmektedir. Bu nedenle, deparafinize ve rehidre slaytları 20 dakika boyunca ısıtıldı sitrat tampon maddesi (pH 6.0) ile bir buhar ocak içine yerleştirilir.
  3. Boyama çözümler için gerekli hacmi en aza indirmek için bir PAP kalem ile yıkama tamponu (0.5 M TBS tamponu +% 0.5 Tween) ve daire dilimleri aktarın kayar.
  4. Bir nem odası içinde slayt yerleştirin. Antijen-antikor-bağlanma, belirli bir yaban turbu peroksidaz-aracılı görselleştirme güvence altına almak için, endojen peroksidaz% 3 hidrojen peroksit ile doygun hale getirilir.
  5. İlköğretim antibody seyreltiler dilimlerine uygulandığı oda sıcaklığında 1 saat inkübe edildi ve dikkatli bir şekilde yıkama tamponu ile yıkanır.
  6. Spesifik antijen-antikor bağlamaları tespiti için Ultra Vision Quanto Detection System HRP DAB (Thermo Scientific) tavsiye edilen protokole uygun olarak kullanılır.
  7. Çekirdekler, 1 dakika için hematoksilin ile karşı edilir.
  8. Slaytlar, bir sulu ortam ile monte edilmiş, kurutulmuş ve bir ters mikroskop kullanılarak.

Representative Results

Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, kılcal ağ korunmuş boru yapıları ile domuz jejunal parçası (yaklaşık 2 m uzunluğunda ve 20 mm çapında) decellularized. Kimyasal, enzimatik ve mekanik decellularization sonra, 3D hücre kültürü için kullanılabilecek bir kollajen I / III iskeleti sağlamıştır. A Feulgen test matrisi (veriler gösterilmemiştir) saflığını (no DNA kalıntıları) göstermek için gerçekleştirildi.

Şekiller 2A ve 2B hücre kron tarafından güvenli SIS-Muc statik kültürünü göstermektedir. Bu dinamik kültürü için bir in-house olarak tasarlanmış biyoreaktör (Şekil 2C) 'de SIS-Muc sabit. Şekil 2B bioreaktörün bölmesi boyunca simüle edilmiş dinamik bir akış göstermektedir. Biyoreaktör, kendi kendine yapılan kuluçka makinesi sistemi içine yerleştirilmiş ve bir peristaltik pompa ile bağlanır. Bu kurulum, basınç-regüle pulsatil akış ya da C ile bir dinamik kültür sağlar: ONSTANT akışı.

Şekil 3, 2 boyutlu monokültürde statik S462 kültürlenmiş tümör hücre çizgisinin bir bakış (Şekil 3A) verir ve 3D kokültür (Şekiller 3B-3D). Şekil 3B, tümör hücreleri, S462 ve SIS apikal tarafında birinci fibroblast üçlü kültür gösterir basolateral tarafında (eski Seroza tarafı)-Muc (eski iç lümen tarafı) ve mvEC. Farklı hücre tiplerinin tanımlanması mvEC (Şekil 3C) etiketlemek için von Willebrand faktörü gibi, hücre tipi özel belirteçler, boyama ile mümkün olduğunu. P53-pozitif hücreler, S462, p53-negatif primer fibroblastlar (Şekil 3B) ve hücrelerin 3D dağılımı analiz edilebilir ayırt edilebilir. Dinamik olarak kültürlenmiş üçlü kültür Şekil 3 Şekil 4 boyamaları eşdeğer Şekil.

0460/50460fig1.jpg "/>
Şekil 1. Decellularization set-up. (A) Bioreactor ve bir PC tarafından izlenen BioVaSc, decellularizing için pompa set-up. (B) decellularized BioVaSc cam tankta. Lümen ve arteryel giriş adaptörlere bağlanır. .

Şekil 2,
Şekil 2. Farklı kültür set-up bir bakış. Mikrotiter plaka statik kültür sistemi (A) CAD kesit görünüşüdür, (B) statik kültürü için metal insertler, akış bioreaktörün üst kapağının dinamik kültürü için (C) orta akış simülasyonu (hız alanı [m / sn]) , (D) peristaltik pompaya bağlı dinamik kültürü için akış biyoreaktör. büyük rakam görmek için buraya tıklayın

ent "fo: keep-together.within-page =" always "> Şekil 3,
Şekil 3,. Statik 3B tümör modelinin immünohistolojik karakterizasyonu bakış. Bir Permanox slaytta S462 hücrelerin statik kültürlü 2D mono kültür (A) Hematoksilen leke, statik kültürlü 3D üçlü kültür (B) H & E boyama, oklar, von Willebrand faktör (C) immünohistolojik boyama, (D endotel hücreleri işaretlemek p53) immünohistolojik boyama. büyük rakam görmek için buraya tıklayın

Şekil 4,
(B) işaretlemek von Willebrand faktör immünohistolojik boyama, p53 için (C) immünohistolojik boyama. büyük rakam görmek için buraya tıklayın

Discussion

Daha pahalı bir yaklaşım olmasına rağmen, tümör araştırma, 3D sistemleri, 2 ve 3 boyutlu kültür sistemleri karşılaştırıldığında, daha iyi biyolojik mikroçevrelerde koşullarını taklit kanıtlanmıştır. Bu, bazı tümör hücreleri gerçek tümöründe duruma uygun olarak ortak bir 2B kültür 12, daha 3B kültürde daha yavaş büyümeye gösterilebilir. Bissell ve arkadaşları kanserojen meme hücrelerinin davranışı bir matris içinde bir 3D kültür hücre-ECM etkileşimleri sunmaktadır daha doğru hücre morfolojisi ve sinyalizasyon dahil in vivo durumu yansıtan bu işlerinde gösterdi. Bundan başka, çevre etkileşimleri değişiklikler, normal bir fenotip için habis hücrelerin geri dönmesine neden olduğunu göstererek 3D olarak hücre dışı ortamın önemi vurgulanmıştır. İlave olarak ve en önemlisi, bu sonuçlar aynı zamanda in vivo hayvan modellerinde 10,11 teyit edilebilir.

ontent "> in vivo hayvan deneylerinde ve in vitro doku modellerinde arasında direkt karşılaştırma her iki sistemde de avantajları ve sakıncaları ortaya koyar. in vitro modellerin bir avantajı, çok daha iyi bir gerçek zamanlı veya mikroskobu ile sabit görüntüleme izni olan. bir sınırlama olduğu Bu in vivo sistemler genellikle ilerleme ise, statik ya da kısa süreli koşullarını taklit eder. damar ve küçük moleküller, normal taşıma mevcut olmaması. bağışıklık tepkilerini barındırmak ve diğer hücre-hücre etkileşimleri in vitro model 12 daha başka dezavantajları vardır Bu nedenle, 3D vitro sistemlerde bu çalışmada sunulan hayvan deneyleri için umut verici bir ek sunuyoruz. Onlar insan organizması için daha iyi bir kıyaslama sağlamak ve bu nedenle deneysel yanlış yorumlamaları en aza indirmek. Biyomimetik vivo model sistemlerinde dolayısıyla kanser ve metastatik yayılma bağımlı olduğunu nasıl çalışma için daha uygun olacak tumorig düzenleyen microenvironmental koşullarıEnesis 11.

Çalışmamız SIS-Muc sağladığı 3D çevre ortak 2B hücre kültürü içinde gözlemlenmemektedir hücre, daha tümör gibi doku formasyonu, (Şekil 3A) neden olduğunu göstermektedir. Ayrıca, tümör biyopsi türetilen birincil hücrelerin kullanımı kişiselleştirilmiş tıp, bir hastanın bireysel ihtiyaçlarına göre en iyi tedaviyi belirlemeyi amaçlamaktadır bir disiplin yönünde çok önemli bir adımdır. Biyopsi izole birinci hastaya özgü tümör hücrelerini ekleme tedavi stratejilerinin vitro test sağlayacaktır. Bu test sistemleri mümkün bir zaman ve maliyet tasarrufu, yüksek verimli tarama bunların farklı ilaçlar ve bunların kombinasyonlarını araştırmak için yapacaktır. Bir tümörün mikro çevre etkileri, tümör ilerlemesi ve 13 suitab olarak ispat olabilir çünkü Buna ek olarak, bu çalışmada gösterildiği gibi, tümörle bağlantılı stromal hücrelerin entegrasyonu, kişiye özel bir yaklaşım için önemlidirle terapötik hedefi.

Alternatif olarak, bir kişiye bir yaklaşıma, bizim tümör modeli kurulmuş kanser oluşturucu hücre çizgilerinin eklenmesi ile genel bir tümör test sistemi olarak hizmet etmek için modifiye edilebilir. Bu temel araştırma amaçlı umut verici bir uyarlamasıdır. Her iki ilaç testi için, bir damar yapısı, bu terapötik maddelerin dağılımını ve alımını test etmek için gereklidir yaklaşır. SIS-Muc matris bariyer emilme deneyleri için birincil mvEC ile bazolateral tohum sağlar BioVaSc korunmuş vasküler yapıların yeniden tohumlama başka ilaç teslimat çalışma artıracaktır.

Doku modelleri oluşturmak için, 3 boyutlu bir biyo-bozunabilir matris, farklı hücre tipleri 14 bir ko-kültür için çerçeve olarak kullanılabilir. , 3D matrislerin kullanımı genellikle fonksiyonel damarlanma yokluğu ile sınırlıdır. Bu sorun, korunmuş kan damarı str sunar BioVaSc, kullanımı ile çözülebiliructures, bu endotel hücreleri ile tohumlandı edilebilir. Ayrıca, BioVaSc hücrelerin yapışmasını sağlamak ve doku farklılaşması kolaylaştırmak hücre dışı bileşenleri içerir. Ayrıca biyoyapay 3D dokuların 7,8,15 uzun süre doku özel bir işlev sağlar. Fonksiyonel vasküler vekalet mühendisliği için önkoşul insan fizyolojik ve biyomekanik koşullar taklidi yapmak. Bu nedenle, in vitro bu gereksinimleri uygulamak biyo-reaktör sistemleri, biyolojik tümör modelleri oluşturmak için son derece ilgi çekicidir.

BioVaSc kombinasyonu, biyoreaktör teknolojisi ve farklı hücre tiplerinin ortak kültürleme örneğin anjiyojenez, kanser ve metastaz olarak ilerlemesi hakkında mekanizmalarının çalışmasını sağlayacak vaskülarize tümör dokular üretmek için bir çok umut verici bir yöntemdir. Biz bir eşdeğerini sağlayarak hayvan çalışmaları tamamlayan için umut verici bir yaklaşım gibi tümör modellerini görmekinsan tümör fizyolojisi.

Disclosures

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

Yazarlar Reaktörler ve biyoreaktör inkübatör geliştirmek için yaptığı teknik destek için Jan HANSMANN (Fraunhofer IGB, Stuttgart) teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase solution SERVA 17454 (500 U/ml)
Dispase solution Gibco 17105-041 (2.0 U/ml)
DMEM, high-glucose PAA G0001,3010
DNase ROCHE 10104159001 200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep
DZ solution Roth 3484.2 34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water
FCS LONZA DE14-801F
IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP DCS PD000KIT
medical pressure transducer MEMSCAP SP844
monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor DAKO Cytomation M0616 Clone F8/86 0.12 μg/ml
mouse monoclonal anti-human p53 DAKO Cytomation IS616 Clone DO-7 ready-to-use
peristaltic pump Ismatec
sterile disposable dome MEMSCAP 844-28
Trypsin / EDTA solution PAA L11-003 0,05%
VascuLife (VEGF-Mv) Lifeline LL-0003
Versene Gibco 15040-033

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Schenke-Layland, K., Nerem, R. M. In vitro human tissue models--moving towards personalized regenerative medicine. Adv. Drug Deliv. Rev. 63, 195-196 (2011).
  2. Pusch, J., Votteler, M., et al. The physiological performance of a three-dimensional model that mimics the microenvironment of the small intestine. Biomaterials. 32, 7469-7478 (2011).
  3. Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. J. Biotechnol. 148, 56-63 (2010).
  4. Lanza, R., Langer, R., Vacanti, J. Principles of tissue engineering. 3rd, Elsevier Academic Press. Burlington, MA. (2007).
  5. Barron, V., Lyons, E., Stenson-Cox, C., McHugh, P. E., Pandit, A. Bioreactors for cardiovascular cell and tissue growth: a review. Ann. Biomed. Eng. 31, 1017-1030 (2003).
  6. Martin, I., Wendt, D., Heberer, M. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol. 22, 80-86 (2004).
  7. Mertsching, H., Walles, T., Hofmann, M., Schanz, J., Knapp, W. H. Engineering of a vascularized scaffold for artificial tissue and organ generation. Biomaterials. 26, 6610-6617 (2005).
  8. Linke, K., Schanz, J., Hansmann, J., Walles, T., Brunner, H., Mertsching, H. Engineered liver-like tissue on a capillarized matrix for applied research. Tissue Eng. 13, 2699-2707 (2007).
  9. Holtkamp, N., Atallah, I., et al. MMP-13 and p53 in the progression of malignant peripheral nerve sheath tumors. Neoplasia. 9, 671-677 (2007).
  10. Weaver, V. M., Petersen, O. W., et al. Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies. J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).
  11. Hutmacher, D. W., Horch, R. E., et al. Translating tissue engineering technology platforms into cancer research. J. Cell. Mol. Med. 13, 1417-1427 (2009).
  12. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  13. Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
  14. Yang, S. -T., Zhang, X., Wen, Y. Microbioreactors for high-throughput cytotoxicity assays. Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 11, 111-127 (2008).
  15. Schultheiss, D., Gabouev, A. I., et al. Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model. J. Urol. 173, 276-280 (2005).

Comments

2 Comments

  1. Hi, I am currently working on fish guts and am interested in trying to apply your method to my tissue sections. Would it be possible to find out a little more information about the process, especially the self made rings. Information such as what material was used and tensile strength would be ideal and whether you had tried going smaller then 10mm with any success?

    Reply
    Posted by: Laura L.
    August 21, 2013 - 9:18 AM
  2. Hi,
    thanks for your comment and your interest to adapt our method.
    The metal rings we use are out of stainless steel (V4A). We tried out smaller diameters as well. Therefore we used the cell crown inserts from Scaffdex (http://www.scaffdex.com/sivut/cellcrownâ;„¢48), that are commonly available for 6 / 12 / 24 / 48 and 96 well plates. For our application the 48 well plate inserts were too small, because the porcine gut matrix is very rigid. But maybe it's suitable for your fish guts!?
    About the tensile strength I can not tell you a number, we never measured the strength, it depends also on the tolerances with which your rings are manufactured.
    We wish you success with your experiments.
    Best regards.

    Reply
    Posted by: Jenny R.
    August 22, 2013 - 8:27 AM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics