لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية من الخلايا المتمايزة Neuroprogenitor الإنسان في الثقافة

1Section of Endocrinology, Denver VA Medical Center, 2Department of Medicine, University of Colorado Denver School of Medicine
Neuroscience

Your institution must subscribe to JoVE's Neuroscience section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

تم توسيع الخلايا neuroprogenitor الإنسان (الشخصيات) في ظل الظروف المتكاثرة. وقد تختلف الشخصيات في الثقافات الخلايا العصبية الغنية في وجود مزيج من neurotrophins. تم الكشف عن علامات العصبية التي كتبها المناعي تلطيخ. لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية، وقد تختلف الشخصيات في PEN الشرائح الغشاء وتم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Bouchard, R., Chong, T., Pugazhenthi, S. Laser Capture Microdissection of Neurons from Differentiated Human Neuroprogenitor Cells in Culture. J. Vis. Exp. (79), e50487, doi:10.3791/50487 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

تم توسيع الخلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) معزولة عن دماغ الجنين البشري في ظل ظروف التكاثري في وجود عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي) وعامل نمو الخلايا الليفية (جمعية جيل المستقبل) لتوفير امدادات وفيرة من الخلايا. وقد تختلف الشخصيات في وجود تركيبة جديدة من عامل نمو الأعصاب (NGF)، المشتقة من عامل التغذية العصبية في الدماغ (BDNF)، dibutyryl المخيم (DBC) وحمض الريتينويك على أطباق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin للحصول على الخلايا العصبية الغنية الثقافات. وتختلف الشخصيات أيضا في غياب neurotrophins، DBC وحمض الريتينويك وبحضور الهدبية عامل التغذية العصبية (CNTF) لانتاج الثقافات نجمية الغنية. وتميزت الشخصيات المتباينة التي كتبها تلطيخ المناعي لوحة من علامات العصبية بما في ذلك NeuN، synapsin، أستيل، synaptophysin وGAP43. تم الكشف عن ييفي الدبقية الحمضية البروتين (GFAP) وSTAT3، وعلامات نجمية، في 10-15٪ من الشخصيات المتباينة. لتسهيلخلية من نوع التوصيف الجزيئي محددة، تم إجراء الليزر التقاط تسليخ مجهري لعزل الخلايا العصبية مثقف على البولي اثيلين naphthalate (PEN) الشرائح الغشاء. الطرق الموضحة في هذه الدراسة توفر أدوات قيمة لتعزيز فهمنا للآلية الجزيئية من تنكس عصبي.

Introduction

ومن المعروف الخلايا العصبية مدى الحياة لتحدث في المنطقة subventricular من البطينين الوحشي وفي طبقة جزئي التحبب من التلفيف المسنن من البالغين أدمغة الثدييات 1. خلايا Neuroprogenitor (الشخصيات) التي تنشأ من هذه المناطق هي خلايا متعددة القدرات التي يمكن أن تفرق في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية و oligodendrocytes 2. لقد ولدت الشخصيات الفائدة بسبب قدرتها على أن زرع في المرضى الذين يعانون من مختلف الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون والتصلب الوحشي الضموري والسكتة الدماغية ومرض الزهايمر (AD) 3. الدراسات مع الشخصيات ركزت عموما على هذه الزاوية زرع لكن إمكانات الخلايا العصبية المشتقة من مجلس الشعب كنموذج زراعة الخلايا لتحديد آلية تنكس عصبي لم تستغل بالكامل. وقد استخدمت الدراسات السابقة عموما الخلايا العصبية بعد الإنقسامية المعزولة من أنسجة الدماغ القوارض والتي تحتاج إلى أن تكون معزولة عن كل تجربة لأنها ليستتجديد الذات. على الرغم من خطوط الخلايا العصبية البشرية بما في ذلك SH-SY5Y والخلايا SK-N-MC يمكن توسيعها، لم يكن لديهم خصائص الخلايا العصبية الأولية. الشخصيات البشرية، من ناحية أخرى، تقدم كل المزايا لأنها يمكن توسيعها لفقرات متعددة ويمكن أن تكون متباينة لتوليد السكان الخلية مع خصائص الخلايا العصبية الأولية 4،5. في الدراسة الحالية، ونحن تصف بروتوكول التمايز جديدة للحصول على السكان الخلايا العصبية الغنية متسقة من الشخصيات المتاحة تجاريا معزولة عن دماغ الجنين البشري. لأن هذه الثقافات لا تحتوي على نسبة صغيرة من الخلايا الدبقية، ونحن بحاجة الى طرق إضافية لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية لتوصيف الجزيئي. القبض على الليزر تسليخ مجهري (LCM) هو أسلوب الرواية التي يبلغ عدد سكانها متجانسة من الخلايا من قسم الأنسجة يمكن ملاحظتها بشكل انتقائي لتحليل التعبير الجيني 6. الدماغ هو نسيج غير متجانس يتكون من الخلايا العصبية، الدبقية وغيرها تاي الخليةعبوة. وقد استخدم LCM لتحديد الخلايا العصبية محددة التعبير الجيني يحلل 7-10. وقد أجرينا في السابق LCM من الخلايا العصبية قرن آمون من م (Tg2576) أقسام مخ الفأر لإظهار التعبير انخفض من دوري عنصر استجابة AMP البروتين ملزمة (CREB) وعامل التغذية العصبية تحديدا في الخلايا العصبية الحصين 11. في هذه الدراسة، ونحن تصف إجراءات لتوسيع الشخصيات البشرية، وتمايز الخلايا العصبية، وتلطيخ مناعي للعلامات العصبية وLCM لعزل الخلايا العصبية مثقف على الشرائح PEN الغشاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. توسيع الشخصيات البشرية (الشكل 1)

  1. إحياء الأسهم المجمدة من الشخصيات البشرية من دماغ الجنين (ونزا، Walkersville، MD، الولايات المتحدة الأمريكية) والثقافة لهم في تعليق في T-75 قوارير كما neurospheres (الشكل 1A) في المتوسط ​​neurobasal تحتوي على ملاحق الانتشار، صندوق تعديل العولمة الأوروبي (10 نانوغرام / مل) و جمعية جيل المستقبل (10 نانوغرام / مل).
  2. بعد 3 أيام في الثقافة، ونقل neurospheres إلى أنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 500 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  3. تجاهل طاف تاركين وراءهم ~ 100 ميكرولتر المتوسطة فوق بيليه الخلية ونقل إلى أنبوب إيبندورف. A بيليه الخلية 100 ميكرولتر يكفي لانقسم الى 2 T-75 قوارير. إذا كانت أقل، والحد من عدد من قوارير كما تفشل الخلايا على التكاثر إذا neuroprogenitor تقسيم رقيقة.
  4. يسحن بيليه مع 200 ميكرولتر غيض 50X مع الحفاظ على غيض 200 ميكرولتر ضد الجزء السفلي من الأنبوب. تقسيم تعليق خلية بالتساوي الى قسمين وإضافتها إلى 2 T-75 قوارير (1-2 الانقسام)، واحدة للاصلالتوسع وآخر للتمايز.
  5. تواصل ثقافة الخلايا neuroprogenitor للتوسع (القارورة الأولى) عن طريق تغيير المتوسطة كل 4-5 أيام حتى تصل neurospheres حجمها الأصلي من 300-500 ميكرون. تغيير المتوسطة عن طريق الطرد المركزي (500 دورة في الدقيقة؛ 5 دقائق)، تجاهل المتوسطة القديمة والمتوسطة إضافة جديدة.

2. التفريق بين الشخصيات البشرية إلى ثقافة العصبية الغنية (الشكل 2)

  1. لتمايز الخلايا إلى الخلايا العصبية neuroprogenitor ثقافة غنية، ووضع ساترة واحد في كل بئر من لوحة 24 جيدا ومعطف مع 100 ميكروغرام / مل من بولي-L-يسين بإضافة 500 ميكرولتر في كل بئر. احتضان الأطباق لمدة 30 دقيقة في RT.
  2. نضح-L-يسين بولي الحل وشطف لوحة مع الماء المعقم.
  3. المقبل، ومعطف الآبار من لوحة مع 500 ميكرولتر من 5 ميكروغرام / مل laminin الماوس واحتضان لمدة 30 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني.
  4. بعد 4 أيام splittiنانوغرام الخلايا (الخطوة 1.4)، ونقل neurospheres صغيرة في قارورة وصفت "لتمايز" في الأطباق المغلفة في مناطق ذات كثافة من ~ 500 neurospheres لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
  5. بعد 6 ساعة، عندما نعلق neurospheres إلى الطبق، وإزالة المتوسطة الانتشار وإضافة متوسطة التمايز تتكون من المتوسطة neurobasal، B27 الملحق، NGF (20 نانوغرام / مل)، BDNF (10 نانوغرام / مل)، DBC (100 ملم)، وحمض الريتينويك (2 ميكرومتر).

3. المناعي تلون الشخصيات المتباينة (الشكل 3)

  1. التالي ثقافة الخلايا العصبية في neuroprogenitor متوسطة التمايز لمدة أسبوعين، يتم الحصول على الخلايا العصبية ثقافة غنية. شطف الخلايا العصبية مرة واحدة في برنامج تلفزيوني ومن ثم اصلاحها في بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 30 دقيقة. مرة واحدة ثابتة، وشطف الخلايا ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  2. احتضان الخلايا مع العازلة permeabilization (5٪ BSA و 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني) في RT لمدة 60 دقيقة.
  3. احتضان الأطباق O / N عند 4 ° م طغ شاكر مع التركيبة التالية من بولكلونل والاجسام المضادة في 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني: NeuN (1:250) وsynapsin (1:250)؛ أسيتيل الكولين (1:500) وsynaptophysin (1:250)؛ BDNF (1 : 500) وGAP43 (1:250)؛ STAT3 (1:500) وGFAP (1:1،000).
  4. غسل coverslips ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني واحتضان ثم لهم المضادة للأرنب CY3 والأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس-FITC في RT في الظلام لمدة 90 دقيقة. بعد الحضانة، وغسل coverslips ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني.
  5. وضع 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على شريحة زجاجية، واخراج ساترة من الطبق الثقافة مع ملقط، ووضعه رأسا على عقب على المتوسطة المتزايدة. بلطف، ويمحو أي وسيط الزائدة تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر.
  6. فحص الخلايا العصبية في immunostained المجهر مضان.

4. لقطة ليزر تسليخ مجهري من الخلايا العصبية (الشكل 4)

  1. التفريق الشخصيات إلى ثقافة الخلايا العصبية الغنية على PEN الشريحة الغشاءق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin فقا للإجراءات وصفها لشكل 2.
  2. تنفيذ كافة الخطوات اللاحقة في ظل ظروف خالية ريبونوكلياز.
  3. وصمة عار على الثقافات باستخدام HistoGene وصمة عار (السماك الرامح) لتصور الخلايا.
  4. العثور على مجالات السكان العصبية نقية خالية من الخلايا النجمية باستخدام خارطة الطريق صورة الشريحة بأكملها مع نظام فيريتاس LCM. بمناسبة الخلايا العصبية باستخدام أدوات الرسم.
  5. القبض على أداء ليزر هذه المناطق باستخدام الدقة التي تسيطر عليها الكمبيوتر والأتمتة في عملية من خطوتين. أولا، يتم تشغيل الأشعة تحت الحمراء (الأشعة تحت الحمراء) في بقع متعددة مع إعداد قوة الليزر من 70 ميغاواط ونبض 2،500 μsec للحصول على الغشاء نعلق على الغطاء. المقبل، يتم رفعه منطقة تميزت باستخدام أداة القطع الأشعة فوق البنفسجية في إعداد مستوى منخفض من 10 بالسيارات.
  6. مزيج من هذه العمليات يلتقط انتقائي المناطق ملحوظ من الغشاء PEN على قبعات ماكرو CapSure LCM. عندما يتم رفع الغطاء، والغشاء مع نeurons تتمسك الغطاء.
  7. عزل الحمض النووي الريبي مجموع من عينات LCM استخدام عدة العزلة PicoPure الحمض النووي الريبي (السماك الرامح) وعلاج مع الدناز.
  8. تضخيم الحمض النووي الريبي معزولة باستخدام الحمض النووي الريبي RiboAMP عدة التضخيم التالية تعليمات من عدة.
  9. أداء الوقت الحقيقي تحليل RT-PCR باستخدام TaqMan تحقيقات للكشف عن خيط عصبي الإنسان السلسلة الثقيلة (hNFHc).

الاختصارات:

م، ومرض الزهايمر؛ BDNF، المستمدة من الدماغ عامل التغذية العصبية؛ CREB، دوري عنصر استجابة AMP بروتين ملزمة؛ DBC، Dibutyryl دوري امبير؛ صندوق تعديل العولمة الأوروبي، وعامل نمو البشرة؛ جمعية جيل المستقبل، وعامل نمو الخلايا الليفية؛ GFAP، ييفي الدبقية البروتين الحمضية؛ LCM، ليزر التقاط تسليخ مجهري؛ NGF، عامل نمو العصب؛ مجلس الشعب، neuroprogenitor الخلية؛ PEN، البولي إثيلين naphthalate.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

توسيع الشخصيات (الشكل 1)

عندما يتم تقسيم neurospheres وصولا الى تعليق خلية واحدة بواسطة سحن، يحتاج غيض ماصة للمس الجزء السفلي من الأنبوب حتى لا يكون هناك بعض المقاومة عند pipetted تعليق صعودا وهبوطا. وعدد المرات التي من سحن تختلف بين الأفراد ويحتاج إلى أن يتقرر عن طريق التجربة والخطأ من خلال دراسة تعليق الخلية الناتجة تحت المجهر. فمن الأهمية بمكان لتوفير كثافة كافية من تعليق خلية لأن الانتشار سيكون بمعدل أسرع عندما تأتي الشخصيات على اتصال وثيق. إذا الشخصيات لا تنمو، ينبغي زيادة كثافة الخلايا عن طريق الحد من عدد من قوارير. كنا قادرين على توسيع neurospheres لمدة تصل إلى 10-15 الممرات. يمكن أن تتولد امدادات وفيرة وبالتالي من الشخصيات البشرية، والحد من استخدام أنسجة الجنين البشري. لاستمرار توريد الشخصيات والخلايا العصبية، فمن المستحسن لتوسيع لهم في البداية لمدة 3-4 الممرات وبعد ذلك، ونصف من الشخصيات يمكن توسيعها كما neurospheres ويمكن أن تكون متباينة النصف الآخر للتجارب الجارية. بدلا من ذلك، الشخصيات يمكن توسيعها أيضا لمزيد من المقاطع، مجمدة في النيتروجين السائل كما في حالة من خطوط الخلايا لتوليد إمدادات أكبر من الأسهم، وأحيا عند الحاجة. ومن المستحسن أيضا لإجراء تجارب مع الخلايا العصبية المشتقة من دفعات مختلفة من الشخصيات.

العصبية تمايز الشخصيات (الشكل 2)

هي خلايا متعددة القدرات الشخصيات ويمكن أن تكون متباينة في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية أو قليلة التغصن تبعا للظروف الثقافة. تشارك بروتوكول التمايز لدينا البذر من neurospheres القديمة لمدة 4 أيام في أطباق المغلفة (الشكل 2A). لاحظنا أنه من الضروري على البذور كثافة كافية من neurospheres بحيث الخلايا العصبية التفريق تنتشر حولها وتشكل شبكة كثيفة من العمليات العصبية. الصور بعد 1 (الشكل 2B) و 4 أيام (الشكلوتظهر لدى عودتهم 2C) من البذر. الثقافات الخلايا العصبية الغنية ذات العوائد 80-90٪ الخلايا العصبية والخلايا النجمية 10-15٪، تم الحصول عليها بعد تمايز الشخصيات في وجود مزيج من نيسان الخليج، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك لمدة أسبوعين (الشكل 2D). إلى حد علمنا، لم يتم الإبلاغ عن البروتوكول وصفها في هذه الدراسة عن تمايز الخلايا العصبية سابقا من قبل الآخرين. في مناطق منخفضة الكثافة، متباينة الشخصيات في الخلايا النجمية (الشكل 2E). للحصول على الثقافة الغنية نجمية، الشخصيات يمكن تربيتها في وجود CNTF (10 نانوغرام / مل) وفي غياب NGF، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك. وبالتالي تكوين الخلايا العصبية نجمية يمكن التلاعب بها أثناء تمايز اعتمادا على الهدف من التجربة.

توصيف المتباينة الخلايا العصبية (الشكل 3)

لمزيد من تميز هذه الشخصيات متمايزة، أجرينا المناعية المزدوج للعلامات العصبية ثبولكلونل إيث والاجسام المضادة، يليه التعرض للأرنب والفأر الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة CY3 (الحمراء) وFITC (الخضراء) على التوالي. تم الكشف عن علامات العصبية التالية: الشكل 3A: NeuN وsynapsin الشكل 3B: أسيتيل الكولين (الوجع) وsynaptophysin الشكل 3C: BDNF وGAP43. وبالتالي، فإن الشخصيات المتباينة لديها خصائص الخلايا العصبية الأولية. بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن علامات نجمية STAT3 وGFAP في عدد صغير من السكان من الخلايا (الشكل 3A). وبالتالي هناك حاجة إلى أساليب إضافية لتحليل التعبير الجيني الخلايا العصبية المحددة.

لقطة ليزر تسليخ مجهري (LCM) من الخلايا العصبية (الشكل 4)

على الرغم من أن LCM يمكن استخدامها لعزل الخلايا من صحن الثقافة، المحاولات الأولية لدينا LCM مع الخلايا العصبية فشلت لأن ترتبط بقوة إلى أنها الأطباق المغلفة. للتغلب على هذه المشكلة، ونحن متباينة الشخصيات سن الشرائح مع PEN إدراج غشاء المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin. تم وضع الشريحة داخل 100 مم طبق ثقافة الخلية (الشكل 4A). وترد الترتيبات الشريحة غشاء PEN والقبعات LCM في الشكل 4B. كانت ملطخة الثقافات مع HistoGen وصمة عار (السماك الرامح) لتصور الخلايا (الشكل 4C). وضعت الشريحة في المجهر في الصك السماك الرامح فيريتاس. وتميزت الخلايا العصبية ليتم القبض مع أدوات الرسم (الشكل 4D). وضعت قبعات CapSure HS على الغشاء PEN. باستخدام مزيج من الأشعة فوق البنفسجية والتقاط القطع بالليزر ليزر الأشعة تحت الحمراء، وجمعت المناطق ملحوظ على الحد الأقصى. وتظهر الخلايا العصبية القبض على الغطاء في انخفاض (الشكل 4F) وعالية (الشكل 4F) التكبير.

الشكل 1
الشكل 1.توسيع الشخصيات البشرية. كانت A. الشخصيات مثقف في تعليق في قوارير T75 كما neurospheres. B. عندما وصلت neurospheres حجم 300-500 ميكرون، نقلوا إلى 15 مل أنابيب وطرد في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق. تم C. تجاهل طاف و تم نقل الخلية بيليه في 200 ميكرولتر المتوسطة إلى أنابيب إيبندورف والمسحوقة. ترد D. Neurospheres جاهزة للتقسيم. ترد E. neurospheres المكسور التالية سحن.

الرقم 2
الشكل 2. التفريق بين الشخصيات البشرية. تم كسر A. Neurospheres بواسطة سحن وتربيتها لمدة أربعة أيام لتوليد neurospheres جديدة. كانت المصنفة B. أربعة neurospheres بعمر يوم واحد في أطباق المغلفة مع بولي-L-يسين والماوس laminin. C. فارقولوحظ نشوئها من الشخصيات في وجود NGF، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك في ثلاثة أيام بعد البذر. تم الحصول على الثقافة الغنية D. العصبية بعد اسبوعين. E. الشخصيات متمايزة في الخلايا النجمية في مناطق منخفضة الكثافة. F. الشخصيات متمايزة في ثقافة نجمية الغنية في وجود CNTF (10 نانوغرام / مل) وفي غياب NGF، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك.

الرقم 3
الرقم 3. تم إصلاح الخلايا العصبية وعلامات نجمية في الشخصيات البشرية المتفاوتة. الشخصيات متباينة لمدة أسبوعين والمزدوجة immunostained للأهداف المشار إليها مع بولكلونل والاجسام المضادة، يليه التعرض للأرنب والفأر الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة CY3 (الحمراء) وFITC (الخضراء) على التوالي. تم الكشف عن علامات العصبية التالية: أ NeuN وsynapsin.B. أسيتيل الكولين (أستيل كولينستراز) وsynaptophysin. C. BDNF وGAP43. بالإضافة إلى ذلك، تم الكشف عن علامات نجمية التالية: D. STAT3 وGFAP.

الرقم 4
الشكل 4. القبض على الليزر تسليخ مجهري للخلايا العصبية. تم متباينة A. الشخصيات على شريحة الغشاء PEN المغلفة مع بولي يسين L والماوس laminin. تم وضع الشريحة داخل 100 مم طبق ثقافة الخلية. B. وترد ترتيبات PEN الشريحة غشاء وغطاء LCM في الصك السماك الرامح فيريتاس. كانت ملطخة C. الثقافات مع HistoGen وصمة عار (السماك الرامح) لتصور الخلايا. دال وتميزت الخلايا العصبية ليتم القبض مع أدوات الرسم. وتظهر الخلايا العصبية القبض على الغطاء في انخفاض (E) وعالية (F) ماغنيfication. انقر هنا لعرض أكبر شخصية .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وصفنا في هذه الدراسة نموذجا ثقافة الخلية العصبية غنية عن طريق تمايز الخلايا neuroprogenitor الإنسان تجديد الذات وطريقة لعزل السكان نقية من الخلايا العصبية بواسطة الليزر التقاط تسليخ مجهري. وقد استخدمنا مزيج من نيسان الخليج، عامل التغذية العصبية، وDBC حمض الريتينويك للتمايز الخلايا العصبية من الشخصيات. يستخدم DBC لتفعيل CREB، وهو عامل النسخ التي تعزز تكوين الخلايا العصبية 12. حمض الريتينويك يدفع خروج دورة الخلية، ويقلل من السكان الدبقية 13. الطريقة الموضحة في هذه الدراسة تتضمن تعديلات على تقريرنا السابق 14. ونحن قد استخدمت في وقت سابق الخطوة من الطحن وneurospheres إلى تعليق خلية واحدة ثم بذر في الأطباق المغلفة. هذا يمكن أن يؤدي إلى عدم كفاءة تمايز الخلايا العصبية في مناطق منخفضة الكثافة (الشكل 2E). أدخلنا الآن الإجراء من بذر لمدة أربعة أيام neurospheres الصغيرة القديمة (الشكل 1B) لضمان الاتصال بين فارقالخلايا العصبية تينغ (الشكل 1C). بالإضافة إلى ذلك، يتم استبدال الملحق التمايز (تقنيات الخلايا الجذعية) مع ملحق B27 (إينفيتروجن)، 4-5 أيام بعد البذر. الأسلوب الحالي ينتج 80-90٪ الخلايا العصبية باستمرار. هذه الخلايا العصبية مع شبكة واسعة من العمليات لا يمكن الحفاظ عليه في الثقافة لمدة 2-3 أشهر، وهي ميزة واضحة على نموذج العصبية الناتجة عن تمايز الخلايا العصبية البشرية خطوط. المناعية لعدة علامات العصبية بما في ذلك NeuN، synapsin، أستيل، synaptophysin وGAP43 لوحظت مع الشخصيات المتباينة (الشكل 3). STAT3 وGFAP، تم الكشف عن علامات النجمية أيضا في عدد صغير من السكان من الخلايا. عن طريق زيادة تركيز حمض الريتينويك ل2-5 ميكرومتر، السكان نجمية يمكن تخفيض آخر. ومع ذلك، مثل هذه الثقافات لا يمكن أن يحتفظ به لمدة طويلة لأن الخلايا الدبقية دعم بقاء الخلايا العصبية عن طريق إفراز عوامل النمو. وقد لاحظنا أنهأمر مرغوب فيه لزيادة تركيز الريتينويك قبل 3-5 أيام تنفيذ التجارب.

طبيعة غير متجانسة من الخلايا العصبية متباينة تحديات من حيث تحديد الخلايا من نوع محدد التعبير الجيني التنميط. لذا، قمنا الأمثل شروط LCM من الخلايا العصبية مثقف (الشكل 4). في الدراسة الحالية، ونحن متباينة الشخصيات على الشرائح مع PEN إدراج الغشاء وLCM تنفيذ لأن هذه التقنية قدمت صعوبات مع الخلايا العصبية مثقف على أطباق زراعة الخلايا العادية كما أنها هي التي تعلق بحزم. على الرغم من أن أهداف LCM يمكن تلبيتها عن طريق التحليل المناعى، LCM يقدم العديد من المزايا بما في ذلك القدرة على تضخيم إشارة على مستوى الحمض النووي الريبي، إجراء تحليل متعددة، والكميات دقيقة. عندما يقترن ميكروأري، LCM يسمح تحليل التعبير الآلاف من الجينات في أنواع الخلية المحددة 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

أي تضارب في المصالح لتعلن.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل عن طريق منحة الاستحقاق مراجعة (NEUD-004-07F) من إدارة المحاربين القدامى (ليرة سورية).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Neuroprogenitor cells (NPCs) Lonza PT-2599
Neurocult NS-A human basal medium Stem cell technology 5750
Neurocult NS-A Proliferation supplement Stem cell technology 5753
Neurocult NS-A Differentiation supplement Stem cell technology 5754
B-27 Supplement (50x) Invitrogen 17504-044
Human epidermal growth factor Stem cell technology 2633
Fibroblast growth factor Sigma F0291
Brain Derived Neurotrophic Factor Cell signaling 3897S
Nerve Growth Factor Invitrogen 13257-019
Dibutyryl cyclic AMP Sigma D-0627
poly-L-lysine Sigma P-5899
Mouse laminin Sigma L-2020
Retinoic acid Sigma R-2625
STAT3 antibody Cell signaling 9132
GFAP antibody Cell signaling 3670
GAP43 antibody Transduction laboratories 612262
BDNF antibody Millipore AB1534SP
Acetyl cholinesterase antibody Santz cruz Sc-11409
Synaptophysin antibody Abcam ab18008-50
NeuN antibody Chemicon MAB377
Synapsin antibody Novus NB300-104
Anti mouse FITC Jackson Immuno 115-095-146
Research Laboratories
Anti Rabbit Cy3 Jackson Immuno 711-165-152
Research Laboratories
BSA Sigma A1653
Triton-X 100 Acros 21568-2500
Paraformaldehye Fisher 4042
Coverslip (Big circle cover slip) Fisherbrand 12-545-102
Mounting medium (Prolong Gold) Invitrogen P36930
Pen membrane Applied biosystems LCM0521
Histogene LCM frozen section staining kit Applied biosystems KIT0401
RiboAmp RNA Amplification kit Applied biosystems KIT0201
Picopure RNA Isolation kit Applied biosystems KIT0202
CapsureMacro LCM caps Applied biosystems LCM0211

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
  2. Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
  3. Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
  4. Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
  5. Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
  6. Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
  7. Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
  8. Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
  9. Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
  10. Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
  11. Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
  12. Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
  13. Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
  14. Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
  15. Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics