Summary
Humane neuroprogenitor celler (NPCs) blev udvidet under prolifererende forhold. NPC blev differentieret i neuron-rige kulturer i nærvær af en kombination af neurotrophiner. Neuronale markører blev påvist ved immunfluorescens-farvning. At isolere en ren population af neuroner blev NPC'ere differentieres på PEN membran dias og laser capture mikrodissektion blev udført.
Abstract
Neuroprogenitor celler (NPCs) isoleret fra det menneskelige føtal hjerne blev udvidet under proliferative tilstande i tilstedeværelse af epidermal vækstfaktor (EGF) og fibroblast vækstfaktor (FGF) til at give en rigelig forsyning af celler. NPC blev differentieret i nærvær af en ny kombination af nervevækstfaktor (NGF), hjerne-afledt neurotrofisk faktor (BDNF), dibutyryl cAMP (DBC) og retinsyre på skåle coatet med poly-L-lysin og muselaminin at opnå neuron -rige kulturer. NPC blev også differentieres i fravær af neurotrophiner DBC og retinsyre og i nærvær af ciliær neurotrofisk faktor (CNTF) til opnåelse af astrocyt-rige kulturer. Differentierede NPC'ere var præget af immunfluorescensfarvning for et panel af neuronale markører herunder Neun, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin og GAP43. Glial fibrillært surt protein (GFAP) og STAT3, astrocyt markører, blev påvist i 10-15% af differentierede NPC. For at lettecelletypespecifik molekylær karakterisering blev laser capture microdissection udført for at isolere neuroner dyrket på polyethylennaphthalat (PEN) membran lysbilleder. De er beskrevet i denne undersøgelse metoder giver værdifulde værktøjer til at fremme vores forståelse af den molekylære mekanisme af neurodegeneration.
Introduction
Livslang neurogenese vides at forekomme i subventricular zone af de laterale ventrikler og i subgranular lag af gyrus dentatus fra pattedyrhjernen voksen 1. Neuroprogenitor celler (NPCs), som stammer fra disse regioner er multipotente celler, der kan differentiere sig til neuroner, astrocytter og oligodendrocytter 2. NPC har vakt interesse på grund af deres potentiale til at blive transplanteret i patienter med forskellige neurodegenerative lidelser, herunder Parkinsons sygdom, amyotrofisk lateral sklerose, slagtilfælde og Alzheimers sygdom (AD) 3. Undersøgelser med NPC har generelt været fokuseret på denne transplantation vinkel men potentialet af NPC afledt neuroner som en cellekultur modellen til at bestemme mekanismen af neurodegenerering er ikke blevet fuldt udnyttet. Tidligere undersøgelser har generelt anvendt post-mitotiske neuroner isoleret fra gnaver hjernevæv, der skal isoleres for hvert forsøg, da de ikke erselvfornyende. Selvom menneskelig neuroblastomcellelinier herunder SH-SY5Y og SK-N-MC-celler kan udvides, de ikke har karakter af primære neuroner. Menneskelige NPC'ere, på den anden side, giver både fordele, fordi de kan udvides til flere passager og kan differentieres til at generere en celle population med kendetegnene for primære neuroner 4,5. I den aktuelle undersøgelse, beskriver vi en ny differentiering protokol til opnåelse af en konsekvent neuron-rig bestand fra kommercielt tilgængelige NPC isoleret fra human føtal hjerne. Fordi disse kulturer indeholder en lille procent af gliaceller, vi har brug for yderligere metoder til at isolere en ren population af neuroner til molekylær karakterisering. Laser capture mikrodissektion (LCM) er en hidtil ukendt teknik, som en homogen population af celler fra et vævssnit kan selektivt indfanges til genekspression analyse 6. Hjernen er en heterogen væv bestående af neuroner, glia og anden celle types. LCM er blevet anvendt til at bestemme neuron-specifik genekspression analyser 7-10. Vi har tidligere udført LCM af hippocampale neuroner fra AD (Tg2576) musehjerne sektioner til at vise reduceret ekspression af cyklisk AMP-responselement bindingsprotein (CREB) og BDNF specifikt i hippocampale neuroner 11. I den foreliggende undersøgelse beskriver vi procedurer for udvidelse af menneskelige NPC'ere, neuronal differentiering, immunfluorescensfarvning for neuronale markører og LCM til isolering af neuroner dyrket på PEN membran dias.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Udvidelse af menneskelige NPCs (figur 1)
- Genoplive den frosne bestand af menneskelige NPCs fra fostrets hjerne (Lonza, Walkersville, MD, USA) og kultur dem i suspension i T-75 kolber som neurosfærer (figur 1a) i neurobasalt medium indeholdende spredning kosttilskud, EGF (10 ng / ml) og FGF (10 ng / ml).
- Efter 3 dage i kultur overføre neurosfærerne til et 15 ml rør og centrifugeres ved 500 rpm i 5 min.
- Supernatanten efterlader ~ 100 ul medium over cellebundfaldet og overføres til et eppendorfrør. A 100 pi cellepellet er nok til at opdele i 2 T-75 kolber. Hvis mindre, reducere antallet af kolber som neuroprogenitor celler undlader at formere sig, hvis delt tynd.
- Tritureres pellet med en 200 ul spids 50x samtidig holde 200 pi spidsen mod bunden af røret. Opdel celle suspension ligeligt i to dele og tilføje dem til 2 T-75 kolber (1-2 split), en for fortsatekspansion og en anden for differentiering.
- Fortsæt kultur af neuroprogenitor celler til ekspansion (første kolbe) ved at ændre mediet hver 4-5 dage, indtil neurosfærerne nå deres oprindelige størrelse på 300-500 um. Skift medium ved centrifugering (500 omdrejninger 5 min), skal du kassere den gamle medium og tilføje nyt medie.
2. Differentiering af humane NPC i en Neuron-rige kultur (figur 2)
- For differentiering af neuroprogenitor celler i en neuron rig kultur, placere et enkelt dækglas i hver brønd på en 24-brønds plade og pels med 100 ug / ml poly-L-lysin ved at tilsætte 500 ul i hver brønd. Inkubér skålene i 30 minutter ved stuetemperatur.
- Aspirer poly-L-lysin og skyl pladen med sterilt vand.
- Dernæst coate brøndene i pladen med 500 pi af 5 pg / ml muselaminin og inkuberes i 30 minutter. Efter inkubation vaskes brøndene med PBS.
- 4 dage efter splitting cellerne (trin 1.4), overføres de små neurosfærer i kolben er mærket »til differentiering 'i de belagte skåle ved en densitet på ~ 500 neurosfærer per brønd af en 24-brønds plade.
- Efter 6 timer, når neurosfærerne tillægger fadet, fjerne spredning medium og tilsæt differentiering medium bestående af neurobasalt medium, B27 supplement, NGF (20 ng / ml), BDNF (10 ng / ml), DBC (100 mm), og retinsyre (2 uM).
3. Immunofluorescensfarvning af differentierede NPCs (Figur 3)
- Efter dyrkning af neuroprogenitor celler i neuronal differentiering medium i to uger, er en neuron-rig kultur opnået. Skyl neuroner gang i PBS og derefter lave dem i 4% paraformaldehyd i 30 min. Når fast, skylles cellerne tre gange med PBS.
- Inkubér cellerne med permeabilisering buffer (5% BSA og 0,2% Triton X-100 i PBS) ved stuetemperatur i 60 min.
- Inkubér skålene O / N ved 4 ° C ina shaker med følgende kombination af polyklonale og monoklonale antistoffer i 3% BSA i PBS: Neun (1:250) og synapsin (1:250), acetyl cholinesterase (1:500) og synaptophysin (1:250), BDNF (1 : 500) og GAP43 (1:250), STAT3 (1:500) og GFAP (1:1000).
- Vask dækglassene tre gange med PBS og derefter inkubere dem med anti-kanin-Cy3 og anti-muse-FITC sekundære antistoffer ved stuetemperatur i mørke i 90 min. Efter inkubation vaskes dækglassene tre gange med PBS.
- Placer 10 pi montering medium på en glasplade, tage dækglasset fra dyrkningsskålen med en pincet, og placer det på hovedet på montage medium. Forsigtigt, tørre overskydende montering medium og forsegle kanterne med neglelak.
- Undersøg immunofarvede neuroner i et fluorescens mikroskop.
4.. Laser mikrodissektion af neuroner (figur 4)
- Differentiere NPC'ere i et neuron-rig kultur på PEN-membran slider belagt med poly-L-lysin og muselaminin følge procedurerne beskrevet for figur 2.
- Udfør alle efterfølgende trin under RNAse-fri betingelser.
- Farv kulturer hjælp HistoGene Stain (Arcturus) for at visualisere cellerne.
- Find områderne rene neuronale populationer blottet for astrocytter hjælp køreplanen billede af hele dias med Veritas LCM systemet. Marker de neuroner ved hjælp af tegneværktøjer.
- Udfør laser indfangning af disse områder ved hjælp af computer-kontrollerede præcision og automatisering i en to-trins proces. Først IR (Infrarød) bliver fyret på flere steder med en laser magt indstilling på 70 mW og en puls på 2.500 usek at få membranen tillægger hætten. Dernæst markerede område udskæres under anvendelse af en UV skæreværktøj på et lavt niveau indstilling på 10 mV.
- Kombination af disse processer selektivt fanger de markerede områder fra PEN-membran på CapSure LCM makro hætter. Når hætten løftes membranen med neurons klæber til hætten.
- Isoler total RNA fra LCM prøver ved hjælp af en PicoPure RNA isolation kit (Arcturus), og behandle med DNase.
- Forstærk den isolerede RNA ved hjælp RiboAMP RNA amplifikationskittet efter anvisninger fra sættet.
- Udfør Realtids RT-PCR-analyse ved hjælp af TaqMan prober til påvisning af menneskelige neurofilament tung kæde (hNFHc).
Forkortelser:
AD, Alzheimers sygdom, BDNF, hjerne-afledt neurotrofisk faktor, CREB, cyklisk AMP-responselement bindende protein; DBC dibutyryl cyklisk AMP, EGF, epidermal vækstfaktor; FGF, fibroblast vækstfaktor; GFAP, gliafibrillært surt protein, LCM, laser fange mikrodissektion, NGF, nerve vækstfaktor; NPC neuroprogenitor celle; PEN polyethylennaphthalat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Udvidelse af NPC (figur 1)
Når neurosfærer er brudt ned til en enkelt cellesuspension ved triturering, pipettespidsen nødt til at røre bunden af røret, så at der er en vis modstand, når suspensionen pipetteres op og ned. Antallet af gange af trituration vil variere mellem individer og skal besluttes ved trial and error ved at undersøge den resulterende celle suspension under et mikroskop. Det er vigtigt at tilvejebringe tilstrækkelig tæthed af cellesuspensionen fordi spredning vil være hurtigere, når NPC'erne kommer i tæt kontakt. Hvis NPC ikke vokser, bør celledensiteten øges ved at reducere antallet af kolber. Vi har været i stand til at udvide neurosfærerne for op til 10-15 passager. Således rigelig forsyning af menneskelige NPC'ere kan genereres, reducere brugen af humant fostervæv. For fortsat levering af NPC'ere og neuroner, er det ønskeligt at udvide dem i første omgang til 3-4 passager og efterfølgendeHalvdelen af de NPC'ere kan udvides som neurosfærer og den anden halvdel kan differentieres for løbende eksperimenter. Alternativt kan NPC'ere også blive udvidet til flere passager, frosset i flydende nitrogen som i tilfælde af cellelinier til at generere større udbud af aktier, og genoplivet efter behov. Det er også ønskeligt at udføre eksperimenter med neuroner, der stammer fra forskellige batches af NPC'ere.
Neuronal Differentiering af NPC (figur 2)
NPC er multipotente celler og kan differentieres til neuroner, astrocytter eller oligodendrocytter, afhængigt af dyrkningsbetingelserne. Vores differentiering protokol involverede udsåning af 4 dage gamle neurosfærer i coatede retter (figur 2A). Vi observerede, at det er vigtigt at frø tilstrækkelig tæthed af neurosfærer så de differentierende neuroner spredt rundt og danne et tæt net af neuronale processer. Billeder efter 1 (figur 2B) og 4 dages (Figure 2C) såning bliver vist. Neuron-rige kulturer der giver 80-90% neuroner og 10-15% astrocytter blev opnået efter differentiering af NPC i nærvær af en kombination af NGF, BDNF, DBC og retinsyre i to uger (figur 2D). Til vor bedste viden, er protokollen beskrevet i denne undersøgelse for neuronal differentiering ikke tidligere blevet rapporteret af andre. I områder med lav befolkningstæthed, NPC'ere differentieret i astrocytter (Figur 2E). For at opnå en astrocyt-rig kultur, kan NPC dyrkes i nærvær af CNTF (10 ng / ml) og i fravær af NGF, BDNF, DBC og retinsyre. Således neuron-astrocyt sammensætning kan manipuleres under differentiering, afhængigt af formålet med forsøget.
Karakterisering af differentierede neuroner (figur 3)
For yderligere at karakterisere disse differentierede NPC'ere, vi udførte dobbelt immunfarvning for neuronale markører wi'te polyklonale og monoklonale antistoffer, efterfulgt af udsættelse for kanin og mus sekundære antistoffer knyttet til Cy3 (rød) og FITC (grøn) hhv. Følgende neuronale markører blev påvist: 3A:. Neun og synapsin 3B:. Acetyl cholinesterase (Ache) og synaptophysin Figur 3C: BDNF og GAP43. Således differentierede NPC'ere har karakter af primære neuroner. Desuden blev astrocyt markører STAT3 og GFAP påvises i en lille population af celler (figur 3A). Derfor er der behov for yderligere metoder til neuron-specifik genekspression analyse.
Laser-mikrodissektion (LCM), i neuroner (figur 4)
Selvom LCM kan anvendes til isolering af celler fra en kultur skålen, vores indledende forsøg på LCM med neuroner mislykkedes, fordi de er fast forbundet til de overtrukne skåle. For at overvinde dette problem, vi differentierede NPC'ere on objektglassene med PEN membran skær overtrukket med poly-L-lysin og muselaminin. Objektglasset blev anbragt i en 100 mm celledyrkningsskål (figur 4A). Ordningerne af membranen slide PEN og LCM hætter er vist i figur 4B. Kulturer blev farvet med HistoGen farvning (Arcturus) at visualisere celler (figur 4C). Objektglasset blev anbragt i mikroskopet i Arcturus Veritas instrumentet. De neuroner til at blive fanget blev markeret med tegneværktøjer (figur 4D). CapSure HS Caps blev placeret på PEN-membran. Ved hjælp af en kombination af UV laserskæring og IR laser capture blev de markerede områder opsamlet på hætten. De optagne neuroner vises på hætten ved lav (Figur 4F) og høj (Figur 4F) forstørrelse.
Figur 1.Udvidelse af menneskelige NPC'er. A. NPC blev dyrket i suspension i T75-kolber som neurosfærer. B. Når neurosfærerne nået størrelse på 300-500 um, blev de overført til 15 ml rør og centrifugeret ved 1.000 rpm i 5 min. C. Supernatanten blev kasseret, og cellepelleten i 200 pi medium blev overført til Eppendorf-rør og findelt. D. Neurosfærer klar til at blive delt, er vist. E. Broken neurosfærer efter trituration vises.
Figur 2. Differentiering af humane NPC'er. A. Neurosfærer blev brudt ved triturering og dyrket i fire dage for at generere nye neurosfærer. B. Fire daggamle neurosfærer blev podet i skåle coatet med poly-L-lysin og muselaminin. C. Differentianing af NPC blev observeret i nærvær af NGF, BDNF, DBC og retinsyre i tre dage efter podning. D. Neuron-rige kultur blev opnået efter to uger. E. NPC differentieret i astrocytter i områder med lav densitet. F. NPC differentieret i en astrocyt-rige kultur i nærvær af CNTF (10 ng / ml) og i fravær af NGF, BDNF, DBC og retinsyre.
Figur 3. Neuronal og astrocyt markører i. NPC'ere differentierede i to uger differentierede humane NPC'ere blev fikseret og dobbelt immunofarvet for angivne mål med polyklonale og monoklonale antistoffer, efterfulgt af udsættelse for kanin og mus sekundære antistoffer knyttet til Cy3 (rød) og FITC (grøn) hhv. Følgende neuronale markører blev påvist: A. Neun og synapsin.B. Acetyl cholinesterase (AChE) og synaptophysin. C. BDNF og GAP43. Desuden blev følgende astrocyt markører detekteres D. STAT3 og GFAP.
Figur 4.. Laser capture mikrodissektion af neuroner. A. NPC'ere blev differentieret på en PEN-membran dias belagt med poly L lysin og muselaminin. Slæden blev placeret inde i en 100 mm celledyrkningsskål. B. arrangementer af PEN-membran slide og LCM cap i Arcturus Veritas instrument vises. C. Kulturer blev farvet med HistoGen plet (Arcturus) for at visualisere cellerne. D. neuroner til at blive fanget blev markeret med tegneværktøjer. De optagne neuroner vises på hætten ved lav (E) og høj (F) magnifikation. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vi beskriver i denne undersøgelse en neuron-rige cellekulturmodel ved differentiering af selvfornyende humane neuroprogenitor celler og en fremgangsmåde til at isolere en ren population af neuroner ved hjælp af laser capture microdissection. Vi har anvendt en kombination af NGF, BDNF, DBC og retinsyre for neuronal differentiering af NPC. DBC anvendes til at aktivere CREB, en transkriptionsfaktor, der øger neurogenese 12. Retinsyre inducerer cellecyklus exit og reducerer glial befolkning 13. Det er beskrevet i denne undersøgelse metode inkorporerer ændringer end vores tidligere rapport 14. Vi havde tidligere brugt trinnet triturering neurosfærerne til en enkelt cellesuspension og derefter såning det overtrukne skåle. Dette kan føre til ineffektive neuronal differentiering i områder med lav densitet (figur 2E). Vi har nu indført proceduren for såning fire dage gamle små neurosfærer (figur 1B) for at sikre kontakt mellem differentieringTing neuroner (figur 1C). Endvidere er differentieringen tillæg (Stem Cell Technologies) erstattet med B27 supplement (Invitrogen), 4-5 dage efter podning. Den nuværende metode giver 80-90% neuroner konsekvent. Disse neuroner med et omfattende netværk af processer kan opretholdes i kultur i 2-3 måneder, en klar fordel i forhold neuronal model som følge af differentiering af humane neuroblastom-cellelinjer. Immunfarvning adskillige neuronale markører herunder neun, synapsin, acetylcholinesterase, synaptophysin og GAP43 blev observeret med differentierede NPC (fig. 3). STAT3 og GFAP, var markører for astrocytter også påvist i en lille population af celler. Ved at øge koncentrationen af retinsyre til 2-5 uM, kan astrocyt befolkning blive yderligere reduceret. Dog kan sådanne kulturer ikke opretholdes for en lang varighed, fordi gliaceller understøtter neuronal overlevelse ved sekretion af vækstfaktorer. Vi har observeret, at deter ønskeligt at øge retinoid koncentration 3-5 dage, før du udfører forsøgene.
Heterogene karakter af differentierede neuroner præsenterer udfordringer i forhold til at bestemme celle-typespecifikke genekspression profilering. Derfor har vi optimeret betingelserne for LCM af dyrkede neuroner (figur 4). I den aktuelle undersøgelse, vi differentierede NPC'ere på lysbilleder med PEN membran indsætter og udført LCM fordi denne teknik præsenterede vanskeligheder med neuroner dyrket på regelmæssig cellekultur retter, som de er fast tilknyttet. Selv om målene for LCM kan opfyldes ved immunohistokemisk analyse LCM giver flere fordele, herunder evnen til at forstærke signalet på RNA-niveau, udføre multiplex analyse og nøjagtig kvantificering. Når det kombineres med microarray LCM muliggør ekspression analyse af tusinder af gener i udvalgte celletyper 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Merit anmeldelse tilskud (NEUD-004-07F) fra Veterans Administration (til SP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Neuroprogenitor cells (NPCs) | Lonza | PT-2599 | |
| Neurocult NS-A human basal medium | Stem cell technology | 5750 | |
| Neurocult NS-A Proliferation supplement | Stem cell technology | 5753 | |
| Neurocult NS-A Differentiation supplement | Stem cell technology | 5754 | |
| B-27 Supplement (50x) | Invitrogen | 17504-044 | |
| Human epidermal growth factor | Stem cell technology | 2633 | |
| Fibroblast growth factor | Sigma | F0291 | |
| Brain Derived Neurotrophic Factor | Cell signaling | 3897S | |
| Nerve Growth Factor | Invitrogen | 13257-019 | |
| Dibutyryl cyclic AMP | Sigma | D-0627 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P-5899 | |
| Mouse laminin | Sigma | L-2020 | |
| Retinoic acid | Sigma | R-2625 | |
| STAT3 antibody | Cell signaling | 9132 | |
| GFAP antibody | Cell signaling | 3670 | |
| GAP43 antibody | Transduction laboratories | 612262 | |
| BDNF antibody | Millipore | AB1534SP | |
| Acetyl cholinesterase antibody | Santz cruz | Sc-11409 | |
| Synaptophysin antibody | Abcam | ab18008-50 | |
| NeuN antibody | Chemicon | MAB377 | |
| Synapsin antibody | Novus | NB300-104 | |
| Anti mouse FITC | Jackson Immuno | 115-095-146 | |
| Research Laboratories | |||
| Anti Rabbit Cy3 | Jackson Immuno | 711-165-152 | |
| Research Laboratories | |||
| BSA | Sigma | A1653 | |
| Triton-X 100 | Acros | 21568-2500 | |
| Paraformaldehye | Fisher | 4042 | |
| Coverslip (Big circle cover slip) | Fisherbrand | 12-545-102 | |
| Mounting medium (Prolong Gold) | Invitrogen | P36930 | |
| Pen membrane | Applied biosystems | LCM0521 | |
| Histogene LCM frozen section staining kit | Applied biosystems | KIT0401 | |
| RiboAmp RNA Amplification kit | Applied biosystems | KIT0201 | |
| Picopure RNA Isolation kit | Applied biosystems | KIT0202 | |
| CapsureMacro LCM caps | Applied biosystems | LCM0211 |
References
- Doetsch, F. The glial identity of neural stem cells. Nat Neurosci. 6, 1127-1134 (2003).
- Galli, R., Gritti, A., Bonfanti, L., Vescovi, A. L. Neural stem cells: an overview. Circ. Res. 92, 598-608 (2003).
- Kim, S. U., de Vellis, J. Stem cell-based cell therapy in neurological diseases: a review. J. Neurosci. Res. 87, 2183-2200 (2009).
- Breier, J. M., et al. Neural progenitor cells as models for high-throughput screens of developmental neurotoxicity: state of the science. Neurotoxicol. Teratol. 32, 4-15 (2010).
- Christie, V. B., et al. Retinoid supplementation of differentiating human neural progenitors and embryonic stem cells leads to enhanced neurogenesis in vitro. J Neurosci Methods. 193, 239-245 (2010).
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Vincent, V. A., DeVoss, J. J., Ryan, H. S., Murphy, G. M. Analysis of neuronal gene expression with laser capture microdissection. J. Neurosci. Res. 69, 578-586 (2002).
- Robles, Y., et al. Hippocampal gene expression profiling in spatial discrimination learning. Neurobiol. Learn Mem. 80, 80-95 (2003).
- Su, J. M., et al. Comparison of ethanol versus formalin fixation on preservation of histology and RNA in laser capture microdissected brain tissues. Brain Pathol. 14, 175-182 (2004).
- Shimamura, M., Garcia, J. M., Prough, D. S., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection and analysis of amplified antisense RNA from distinct cell populations of the young and aged rat brain: effect of traumatic brain injury on hippocampal gene expression. Brain Res. Mol. Brain Res. 122, 47-61 (2004).
- Pugazhenthi, S., Wang, M., Pham, S., Sze, C. I., Eckman, C. B. Downregulation of CREB expression in Alzheimer's brain and in Abeta-treated rat hippocampal neurons. Mol. Neurodegener. 6, 60 (2011).
- Dworkin, S., Mantamadiotis, T. Targeting CREB signalling in neurogenesis. Expert Opin. Ther. Targets. 14, 869-879 (2010).
- Trujillo, C. A., et al. Novel perspectives of neural stem cell differentiation: from neurotransmitters to therapeutics. Cytometry A. 75, 38-53 (2009).
- Pugazhenthi, S., et al. Varicella-zoster virus infection of differentiated human neural stem cells. J. Virol. 85, 6678-6686 (2011).
- Kamme, F., et al. Single-cell microarray analysis in hippocampus CA1: demonstration and validation of cellular heterogeneity. J. Neurosci. 23, 3607-3615 (2003).
