Manuel Isolering af Adipose-afledte stamceller fra humane Lipoaspirates

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

I 2001 forskere ved UCLA beskrev isolering af en population af voksne stamceller, der betegnes adipøst afledte stamceller eller ASCs fra fedtvæv. Denne artikel beskriver isoleringen af ​​ASC'er fra lipoaspirates ved hjælp af en manual, enzymatisk fordøjelse protokol hjælp collagenase.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Zhu, M., Heydarkhan-Hagvall, S., Hedrick, M., Benhaim, P., Zuk, P. Manual Isolation of Adipose-derived Stem Cells from Human Lipoaspirates. J. Vis. Exp. (79), e50585, doi:10.3791/50585 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

I 2001 forskere ved University of California, Los Angeles, beskrev isoleringen af ​​en ny population af voksne stamceller fra liposuctioned fedtvæv, der betegnes de oprindeligt Forarbejdet Lipoaspirate Celler eller PLA celler. Siden da har disse stamceller blevet omdøbt Adipose stamceller eller ASCs og har gået på at blive en af ​​de mest populære voksne stamceller populationer inden for stamcelleforskning og regenerativ medicin. Tusindvis af artikler nu beskriver anvendelsen af ​​ASC'er i en række regenerative dyremodeller, herunder knogleregenerering, perifer nerve reparation og hjerte-kar-teknik. Nylige artikler er begyndt at beskrive det utal af anvendelser ASC'er i klinikken. Det er vist i denne artikel protokol beskriver grundlæggende fremgangsmåde for manuelt, og enzymatisk isolere ASC'er fra store mængder af lipoaspirates opnået fra kosmetiske procedurer. Denne protokol kan nemt skaleres op eller ned for at accommodspiste mængde lipoaspirate og kan tilpasses til at isolere ASC'er fra fedtvæv opnået ved abdominoplasties og lignende procedurer.

Introduction

I 2001 blev en formodet population af multipotente stamceller fra fedtvæv er beskrevet i tidsskriftet Tissue Engineering 1. Disse celler blev givet navnet Forarbejdet Lipoaspirate eller PLA celler på grund af deres afledning af forarbejdet lipoaspirate væv opnået gennem kosmetisk kirurgi. Det beskrives i denne artikel isolation metode var baseret på eksisterende enzymatiske strategier for isolation af stroma vaskulære fraktion (SVF) fra fedtvæv 2. Den SVF er blevet defineret som et minimalt forarbejdet population af røde blodlegemer, fibroblaster, endotelceller, glatte muskelceller, pericytter og præ-adipocytter, der endnu ikke at overholde en vævskultur substrat 2, 3. Dyrkning af denne SVF tiden foreslås at fjerne mange af disse kontaminerende cellepopulationer og resultere i en vedhængende, fibroblast befolkning. Disse fibroblaster er blevet identificeret i litteraturen for de sidste 40 år som værende pre-adipocytter. Vores forskergruppe viste imidlertid, at disse celler besad mesodermal multipotency og omdøbt den vedhængende SVF befolkningen som PLA celler. Efterfølgende undersøgelser af utallige andre forskergrupper har føjet til dette potentiale, hvilket tyder på både endodermalt og ektodermal potentialer (for en oversigt, se 4). Siden da har mange yderligere vilkår for disse celler dukkede op i litteraturen. For at give en vis form for enighed, blev udtrykket Adipose stamceller eller ASCs vedtaget på nd årlige IFATS konference 2.. Som sådan vil udtrykket ASC bruges i denne artikel.

Det beskrives i denne artikel protokol er en forholdsvis enkel procedure, der kræver standard laboratorieudstyr og bruger enkle reagenser, såsom fosfor saltvand, standard vævsdyrkningsmedier reagenser og collagenase. Det kan producere store antal af ASC'er afhængigt af mængden af ​​udgangsmateriale fedtvæv volumen og efterfølgende cULTUR tid. Behandlingen af ​​en så stor mængde af fedtvæv kan dog præsentere nogle fysiske problemer, der kan mindskes til en vis grad ved hjælp af denne protokol. Hertil kommer, at denne protokol kræver sterile vævskultur faciliteter og godkendte biosikkerhed emhætter og derved nødvendiggør brugen af ​​en godkendt vævskultur facilitet. Dette krav kan også mindske nytten af ​​ASC befolkning i kliniske anvendelser, medmindre de er isoleret i god fremstillingspraksis (GMP)-godkendte anlæg beregnet til isolering og ekspansion af materialer til klinisk brug. Som et alternativ, ville automatiserede systemer, der kan isolere ASC'er i et lukket system på operationsstuen undgå dette vigtige spørgsmål og give mulighed for øjeblikkelig brug af ASC, uden behov for efterfølgende in vitro ekspansion. Til dato er der seks automatiserede systemer, der er kommercielt tilgængelige til isolering af celler fra humant væv. Disse systemer kan gøre det muligt at isolere enbetydeligt antal ASC'er fra store mængder af fedtvæv umiddelbart efter sin høst. Disse ASCs kunne så blive genindført i patienten for en række regenerative formål uden at patienten nogensinde at skulle forlade operationsstuen. I tillæg til denne protokol, der beskriver manuel isolering af ASCer er en protokol til automatiseret isolation af ASC'er bruger Celution System også givet i en følgesvend artiklen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Den her viste protokol beskriver manuel isolering af ASC'er fra lipoaspirates opnået gennem kosmetiske procedurer ved hjælp af enzymatisk nedbrydning og differentieret centrifugering. Denne protokol blev først offentliggjort i tidsskriftet Tissue Engineering i 2001 1, hvor de resulterende celler blev kaldt Forarbejdede Lipoaspirate Celler eller PLA celler på grund af deres isolation fra lipoaspirates. Imidlertid er udtrykket PLA celle nu blevet erstattet med udtrykket adipøst afledte stamceller eller ASCs give feltet en slags overensstemmelse i form af kontoplanen. De celler isoleret gennem denne protokol er blevet vist af mange at besidde mesodermal potentiale, både in vitro og in vivo (for en gennemgang se 4). Desuden har ectodermal og endodermale potentialer af ASC også blevet udforsket 4. Isoleringen teknik er enkel og ligetil og kræver cirka en time for at fuldføre. Den resulterende celles dyrkes under standard vævsdyrkningsbetingelser. Med kultur tid, bliver ASC befolkning mere homogen, bestående af fibroblastceller der udvider nemt og viser god levedygtighed på lang sigt i kultur.

Bemærk: Følgende stykker udstyr, der kræves, er opført i slutningen af denne artikel. Alle glasvarer, medier og reagenser skal steriliseres ved autoklavering eller filtreres gennem 0,22 um filtre. Aseptiske vævsdyrkningsteknikker skal følges på alle tidspunkter. For at sikre dette skal alle materialer, placeret i biosikkerhed kabinet steriliseres ved at sprøjte med en 70% ethanol-opløsning og aftørring med rene papirservietter.

1.. Forud for Harvest, forberede følgende:

  1. Steril 1X phospho-bufret saltvand (PBS) til vask af lipoaspirates. Forbered cirka 1 L 1X PBS for hver 100 ml lipoaspirate. Autoklaver PBS og alleow at afkøle til stuetemperatur før brug. Som option kan antibiotikum / antimykotikum føjes til en slutkoncentration på: 100 IU / ml penicillin, 100 ug / ml streptomycin og 2,50 mg / ml amphotericin B, når PBS er afkølet.
  2. Sterile 0,075-,1% collagenase type IA (fra Clostridium histolyticum) til enzymatisk fordøjelse af lipoaspirate. Koncentration vil afhænge af kvaliteten og kilden til collagenase - altså rå vs renset. Andre collagenase typer kan benyttes (f.eks kollagenase type II eller IV) ved tilsvarende koncentrationer. Forbered i 1x PBS og sterilt filter ved hjælp af en 1000 ml filtreringssystem med et 0,22 mm filter (figur 1A). Dog kan sterile glasflasker forsynet med en flaske topfilter også anvendes. Fremstille og anvende ved stuetemperatur. Collagenase løsninger kan opbevares på kort sigt ved 4 ° C indtil brug. Må ikke nedfryses collagenaseopløsning da det kan mindske dets aktivitet.
  3. Steril kontrol Medium (CM) for collagenase inaktivering og dyrkning af ASC befolkning. Til 500 ml CM, kombinere følgende: 500 ml DMEM (4,5 g / L glucose, med L-glutamin), 50 ml føtalt bovint serum (varmeinaktiveret), 5 ml penicillin / streptomycin (10.000 IE penicillin, 10.000 ug / ml streptomycin). Som option kan 5 ml amphotericin B (250 mg / ml amphotericin B) også tilføjes. Steril filtrering af dette medie er påkrævet, hvis der anvendes ikke-sterile reagenser. Placer CM i et 37 ° C vandbad 30 min før brug til at opvarme mediet.
  4. Sterile glasvarer og plastvarer til isolering. Autoklavér en 1.000 ml bægerglas, og der afkøles til stuetemperatur før brug. Desuden har følgende plasticware klar: aseptisk serologiske pipetter (5 ml, 10 ml og 25 ml), 50 ml centrifugerør og vævskultur-behandlede kultur retter.

2. Isolering af ASCs fra Lipoaspirates

De fleste lipoaspirates opsamles i en aspiration beholderen (se figur 1B), og kan bestå af tre forskellige lag: 1) et øvre lag af olie på grund af lysis af modne adipocytter, 2) et midterlag af fedtvæv, og 3) en bund, flydende infranatant indeholdende saltvand og kontaminerende celletyper, såsom røde blodlegemer (RBC). Det øverste olie lag kan ikke være til stede i betydelige mængder. Hvis til stede, bør det aspireres olie forurening af det resulterende ASC kultur kunne påvirke levedygtigheden af ​​kulturen. Den nederste infranatant bør fjernes inden behandling for at minimere forurening af ASC kulturer med RBC. Dette vil efterlade midten, fedtvæv lag, som derefter vil blive vasket og fordøjes enzymatisk for at befri sin cellulære, stromal vaskulære fraktion (SVF).

  1. Vask af lipoaspirate: Åbn lipoaspirate beholder i vævskultur hood og omhyggeligt dekanteres lipoaspirate i en steril 1 liter bægerglas. Lad lipoaspirate lagene er adskilt indtil fedtvæv lag godt adskilt (fig. 1B).
    1. Aspirer olien lag (hvis til stede) ved hjælp af en steril, glaspipette og bunden saltvand infranatant under anvendelse af en 10 ml serologisk pipette. Dette vil fjerne at størstedelen af ​​kontaminerende røde blodlegemer og saltvand.
    2. Vurdere omfanget af det resulterende fedtvæv lag og tilføje sterilt 1x PBS ved en tilsvarende mængde. Rør aspirere med pipette aspiration for at blande den lipoaspirate med PBS. Lad de to lag til at bosætte sig. Som bemærket ovenfor kan 1x PBS suppleres med antibiotika / antimykotika.
    3. Aspirer infranatant under anvendelse af en 10 ml serologisk pipette.
    4. Fortsæt med at vaske fedt fraktion væv som beskrevet i trin 2.1.2. og 2.1.3. indtil fedt lag har en gul / guld farve. Aspirer the infranatant en sidste gang, forlader adipøst fraktion væv i bægerglasset. For at sikre tilstrækkelig fjernelse af infranatant, tillade lipoaspirate lag til at nøjes med 5 minutter efter sidste vask og før den endelige aspiration.
  2. Enzymatisk fordøjelse af lipoaspirate: Forbered steril collagenase 1A løsning som skitseret ovenfor i en filterenhed. Forbered en mængde svarende til den, der af fedt fraktion og sterilt filter.
    1. Efter filtrering af collagenaseopløsning, kasseres den øverste filterenhed, hæld forsigtigt den vaskede fedt fraktionen i collagenaseopløsning og stramt lukke flasken.
    2. Placer collagenase / fedt-blandingen i et 37 ° C vandbad og fordøje ved 37 ° C i 30 minutter. Vend forsigtigt collagenase / fedt blanding hver 5-10 min og læg tilbage i vandbad. Fedtvæv lag skal tage på en "blødere" udseende (Figure 1B), som fordøjelsen provenu. Yderligere fordøjelsesperiode (dvs. op til 2 timer) kan anvendes, hvis det fedtvæv lag stadig synes at have solide stykker af fedt i det.
  3. Isolering af ASCs: Sted fordøjet collagenase / fedt blanding tilbage i biosikkerhed kabinet. Vær sikker på at sterilisere filterenheden med 70% ethanol forud for at placere tilbage i kabinettet.
    1. 25 ml portioner af infranatant indeholder den SVF i sterile 50 ml centrifugerør.
    2. 25 ml CM til hvert rør. Lad CM at inaktivere collagenase ved at inkubere ved stuetemperatur i skabet i 5 min.
    3. Centrifuger i 10 minutter ved 1200 xg for at indsamle SVF som en pellet.
    4. I biosikkerhed kabinet, aspireres supernatanten fra hvert rør. Sørg for det øverste olie lag og eventuelle flydende adipocytter opsuges med denne supernatant (
    5. Kombiner de SVF pellets i en centrifuge rør ved hjælp af 30 ml CM og deler ligeligt over to nye 50 ml centrifugerør. Centrifuger som i trin 2.3.3. opsuges supernatanterne fra de to SVF pellets (ikke vist i figuren).
      EKSTRA: Hvis der ønskes RBC, resuspender hver SVF pellet i 10 ml af en RBC-buffer (160 mM NH4CI) og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Centrifuger som i trin 2.3.3. opsuges supernatanterne at give de SVF pellets (ikke vist i figuren).
    6. Kombiner de to SVF pellets ind i en ny centrifuge rør ved hjælp af 5-10 ml CM (figur 1B).
    7. At bortfiltrere større vævspartikler, pipette den resuspenderet SVF pellet på en 100 um mesh-filter placeret på toppen af en ny 50 ml centrifugerør og tillade at filtrere ved hjælp af tyngdekraften flow.
    8. Pipette portioner af resuspenderet(Og filtreret) SVF pellet indeholdende ASC'er fletvæv-kultur behandlet kultur retter. Supplér hver skål med en passende mængde af CM.
    9. Kultur cellerne i CM i 3-4 dage ved 37 ° C, 5% CO2 uden udskiftning af medie.

Efter denne indledende kultur periode, kan dyrkningsmediet aspireres og kontaminerende røde blodlegemer fjernes forsigtigt ved vask med steril 1X PBS. Udskift med CM og fortsætte med at dyrke ASC'er efter behov. Den type vævsdyrkningsskål anvendes, og hvordan det resuspenderede SVF pellet fordeles mellem disse retter vil afhænge af antallet af celler ønskede Følgende konventionelle vævskultur.

3. Karakterisering af ASC Befolkning: Flowcytometri og multilineage Differentiering

Når isolerede, bør karakterisering af ASC population udføres. Konventionelle metoder til dette omfatte flow cytometri at karakterisere celleoverfladen CD antigen profil af celler og in vitro differentiering at bekræfte deres multilineage differentiering kapacitet. Mens flere slægter kan vurderes i ASCs denne protokol skitserer differentieringen af ASC'er i celler i adipogene, osteogene og chondrogene slægter som et middel til bekræftelse multilineage mesodermale potentialer 5.

In vitro multi-slægt Differentiering af ASCs

  1. Osteogent Differentiering af ASC'er: Før induktion, forberede Osteogent Medium (OM) som følger: Til den ene 500 ml flaske DMEM (4,5 g / ml glukose) tilsæt 25,0 ml FBS (5,0% slutkoncentration) og 5,0 ml af penicillin / streptomycin (10.000 IE / ml og 10.000 mg / ml slutkoncentrationer, henholdsvis). Til dette, tilføj følgende osteogene induktion til at give de angivne endelige koncentrationer: dexamethason (0,1 uM endelig), L-ascorbinsyre 2-fosfat (50,0 uM endelige) Og β-glycerophosphat (10,0 mM endelig).
    1. Forud for induktion, høst og pladen de dyrkede ASC'er i den ønskede vævsdyrkningsskål således at en sammenflydning på omkring 50% er opnået. For hver eksperimentel fad forgyldt, tallerken en ekstra skål til en ikke-induceret kontrol. Kultur natten i CM.
      Bemærk: 50% konfluens anbefales for at give mulighed for fortsat spredning, der kan opstå i løbet af induktion
    2. På dagen for induktion, skal du fjerne mediet og tilføje følgende: OM til de ønskede osteogene eksperimentelle brønde og CM til kontrolbrøndene. Mængden af ​​anvendte medier, vil afhænge af størrelsen af ​​den vævsdyrkningsskål. I 12-brønds skåle, 1,0 ml medier per brønd er tilstrækkelig. For 6-brønds skåle, 2,0 ml medier per brønd er tilstrækkelig. For 100 mm skåle, bør anvendes 10,0 ml medier pr skål.
    3. Kultur cellerne i mindst 14 dage med udskiftning af det passende medium hver 3-4dage. Meget osteogene ASC befolkninger kan vise tegn på ekstracellulær mineral deposition så tidligt som 7 dage induktion.
    4. Osteogent differentiering (dvs. ekstracellulær mineral deposition) kan bekræftes ved hjælp af en von Kossa histologisk pletten for calciumphosphat. Denne plet vil producere et sort-brunt bundfald identificere tilstedeværelsen af ekstracellulært calciumphosphat (se figur 2).
      At plette med von Kossa reagens:
      1. Fjern OM fra de eksperimentelle celler og CM fra kontrol celler
      2. Fikseres cellerne i 60 min i 4,0% paraformaldehyd udarbejdet i 1x PBS.
      3. Vask cellerne to gange med 1x PBS.
      4. Inkubér cellerne med 2,0% sølvnitrat (fremstillet i vand) i mørke i 30 minutter.
      5. Fjern sølvnitrat, vaskes to gange med destilleret vand og lufttørre cellerne.
      6. Udsætte celler for UV-lys i 60 minutter for at udvikle calcium fosfat bundfald.
      7. Vask cellerne flere gange med 1XPBS.
      8. Kontrastfarve cellen med hematoxylin hvis det ønskes.
  1. Adipogene Differentiering af ASC'er: Før induktion, forberede adipogenisk Medium (AM) som følger: Til den ene 500 ml flaske DMEM (4,5 g / ml glukose) tilsæt 50,0 ml FBS (10,0% slutkoncentration) og 5,0 ml af penicillin / streptomycin (10.000 IE / ml og 10.000 ug / ml slutkoncentrationer, henholdsvis). Til dette, tilføj følgende adipogeniske induktion til at give de angivne endelige koncentrationer: dexamethason (1,0 uM endelig), 3-isobutyl-1-methylxanthin (IBMX - 0,5 mM endelig), indometacin (0,2 mM endelig) og insulin (10,0 uM endelig ).
    1. Før induktion, høst og plade dyrkede ASC'er i den ønskede vævsdyrkningsskål således at en konfluens på ca 80% er opnået. For hver eksperimentel fad forgyldt, tallerken en tilføjelseal skål for en ikke-induceret kontrol. . Kultur natten i cm Bemærk: adipogenisk differentiering af ASC'er synes at være mere effektivt med øget sammenflydning.
    2. På dagen for induktion, skal du fjerne mediet og tilsæt følgende: AM til de ønskede osteogene eksperimentelle brønde og CM til kontrolbrøndene. Mængden af ​​anvendte medier, vil afhænge af størrelsen af ​​den vævsdyrkningsskål. For 12 brønde retter 1.0.ml medier per godt, er tilstrækkelig. For 6-brønds skåle, 2,0 ml medier per brønd er tilstrækkelig. For 100 mm skåle, bør anvendes 10,0 ml medier pr skål.
    3. Dyrke cellerne i mindst 14 dage med udskiftning af det passende medium hver 3-4 dage. Meget Adipogeniske ASC befolkninger kan vise tegn på lipid vakuole dannelse så tidligt som 7 dage induktion.
    4. ASC'er gennemgår adipogenisk differentiering vil udvikle flere lipidvakuoler, der let kan visualiseres under lysmikroskop. Desuden adipogenisk differentieringbekræftes ved hjælp af en Oil Red O histologisk plet, der vil akkumulere inden for disse vakuoler (se figur 2).
      At plette med Oil Red O:
      1. Fjern medier fra forsøgs-og kontrol celler og lave dem i 60 min ved hjælp af en 10% formel calcium fiksativ. For at forberede denne fiksativ kombinere følgende: 1,0 g CaCl2, 25,0 ml 16% paraformaldehyd (4,0% endelig) og 75,0 ml destilleret vand.
      2. Vask cellerne to gange med 1x PBS.
      3. Vask cellerne kortvarigt med 70% ethanol.
      4. Inkuberes cellerne ved stuetemperatur i 5 minutter med Oil Red O løsning. For at forberede Oil Red O opløsning opløses 2,0 g Oil Red O pulver i 50,0 ml 70% ethanol og 50,0 ml acetone.
      5. Vask cellerne med 70% ethanol og derefter med vand fra hanen.
      6. Visualisere cellerne hurtigt efter farvning på grund af fading af pletten med tiden.
  1. Chondrogene Differentiering af ASC'er: chondrogensupplering differentiering opnås gennem en high-density kultur teknik kaldet "mikromasse kultur". Forud for kultur, forberede chondrogensupplering Medium (ChM) som følger: Til en 500 ml flaske DMEM (4,5 g / ml glucose) tilsættes 5,0 ml FBS (1% slutkoncentration) og 5,0 ml penicillin / streptomycin (10.000 IE / ml og 10.000 ug / ml slutkoncentrationer, henholdsvis). Til dette, tilføj følgende chondrogene induktion til at give de angivne endelige koncentrationer: L-ascorbinsyre-2-fosfat (50,0 mg / ml endelig), insulin (6,25 mg / ml endelig), transferrin (6,25 mg / ml endelig) og TGFβ1 (10,0 ng / ml).
    1. Høste ASCs og centrifugeres i 5 min ved 1.200 xg for at sammenpresse cellerne. Tæl cellerne for at bestemme densiteten af ​​cellesuspensionen.
    2. Til fremstilling af de mikromassekulturer pellets forberede to cellesuspensioner: en eksperimentel suspension fremstillet i ChM ved en densitet på 1 x 10 7 cellers / ml, og en kontrol suspension fremstillet i CM ved en densitet på 1 x 10 7 celler / ml.
      1. Placer 10,0 pi "dråber" af den cellulære suspension i individuelle brønde i en multi-godt fad. Tillad at holde i 2-3 timer ved 37 ° C.
      2. Forsigtigt overlay belagte dråber med enten ChM eller CM være omhyggelig med ikke at dissociere cellerne.
      3. Kultur cellerne i op til 14 dage i ChM eller CM med ændringer i medium hver 3-4 dag. Celler dyrket i ChM vil kondensere i denne tid til at danne en høj densitet mikromasse pellet med lidt at ingen celler i en omkreds monolag. Kontrol celler dyrket vil ikke gennemgå denne kondens, og mange vil blive fundet som et monolag.
      4. For at bekræfte chondrogenese fastsætte pellets i 15 min i 4,0% paraformaldehyd (udarbejdet i 1x PBS) ved stuetemperatur. Farv for tilstedeværelsen af ​​sulfaterede proteoglycaner ved hjælp af en Alcian blå histologiske pletten.
        At pletten med Alcian blå:
        1. Vask paraformaldehyde-faste pellets gang i 1x PBS.
        2. Inkubér pellets i 0,1 N HCI (pH 1.0) i 5 minutter til at sænke deres pH.
        3. Fjern HCI, og der tilsættes 1% Alcian Blue-reagens (fremstillet i 0,1 N HCI, pH 1,0). Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur.
        4. Fjern Alcian blå reagens og vaske pellets med 0,1 N HCI (pH 1,0) for at fjerne overskydende farve.
        5. Ekstra skylninger bruger vand fra hanen kan bruges til at reducere baggrunden farvning.
        6. Som et alternativ kan mikromassekulturerne pellets høstes, fikseret natten over i 10% formalin, indlejret i paraffin og sektionerne farvet for Alcian Blå.

4.. Flowcytometrisk Karakterisering af ASC'er

Karakterisering af celleoverfladen CD antigen profil kan opnås gennem konventionel flowcytometri.

  1. Udarbejdelse af ASC'er for flowcytometri: Priortil analyse, forberede en Flowcytometri Buffer (FCB), består af følgende: 1,0% BSA, 2,0% FBS og 0,025% saponin udarbejdet i 1x PBS.
    1. Harvest ASC'er og centrifugere cellerne i 5 minutter ved 1200 xg for at frembringe en pellet.
    2. Resuspender cellerne i steril 1X PBS og tæl cellerne under anvendelse af et hæmocytometer. Bestem celledensiteten af ​​suspensionen.
    3. Opdel suspensionen op i portioner af 5 x 10 5 celler alt og centrifuge til pelletering.
    4. Fjern PBS supernatanten og fikseres cellerne i 60 min ved -20 ° C med et overskud af iskold 70% ethanol. Hvis det er nødvendigt, kan disse celler der er lagret i 70% ethanol i en -20 ° C fryser indtil brug.
    5. Efter fiksering, forsigtigt aspireres ethanol og forsigtigt vaske pellet to gange med et overskud af FCB. At vaske:
      1. Tilføj et overskud af FCB og forsigtigt pellet resuspenderes.
      2. Centrifuger i 5 minutter ved 1200 xg for at opsamle cellerne ensa pellet.
      3. Aspirer forsigtigt FCB supernatant.
      4. Gentag.
    6. Tag den endelige FCB vask supernatant fra hver portion og resuspender i 100 ul FCB. Tilsæt ønskede fluorokromkonjugerede primære antistof ved hjælp af producentens foreslåede fortynding. Inkubér cellerne på is med antistoffet i 30 minutter.
      Bemærk: Hvis fluorokromkonjugerede primære antistoffer ikke er tilgængelige, kan der anvendes ikke-konjugerede primære antistoffer.
    7. For hvert fluorochrom (fx FITC, PE) inkuberes en alikvot af celler med 100 ml FCB indeholdende isotype-matchede IgG'er som en negativ kontrol.
    8. Inkuber én portion i 100 ml FCB ikke indeholder antistoffer som en ekstra kontrol.
    9. Vask hver portion af celle to gange med FCB som beskrevet i trin 4.1.5. Efter den sidste vask resuspenderes portioner i 100 ml FCB og fortsætte med flow analyse.
      Bemærk: Hvis der blev anvendt ikke-konjugerede primære antistoffer: Efter dette vasketrin inkuberes alikvoter på is i 20 minutter med FCB suppleret med passende fluorochrom-konjugeret sekundært antistof ved hjælp af producentens foreslåede fortynding. Vask to gange som beskrevet i trin 4.1.5.
  2. Flow analyse af ASC'er: Til flow analyse, bør et minimum af 10.000 hændelser tælles. Ufarvede og isotypeparret kontrol bør anvendes til at indstille portene ved fremadspredning (FSC) og sidespredning (SSC). Til dette bør ingen antistof kontrol (dvs. ufarvede) fra trin 4.1.8 anvendes for at fjerne snavs og døde ASC'er. De isotype-matchede IgG kontrol i trin 4.1.7. skal anvendes til at fastlægge områder af positiv fluorescens.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen ovenfor skitserede beskriver en manual, enzymatisk fremgangsmåde til isolering af en SVF fra et stort volumen lipoaspirate prøve. Inden for denne SVF er talrige cellepopulationer, herunder ASC. Talrige undersøgelser foreslår, at dyrkning af denne SVF under standard vævskulturbetingelser vælger for en Tilhænger fibroblast befolkning sandsynligvis primært at være sammensat af ASC type. I overensstemmelse med dette har vi vist, ved hjælp af flowcytometri og immunofluorescens, at dyrkede SVF pellets bliver i det væsentlige fri af de vigtigste kontaminerende celletyper, nemlig RBC, glatte muskelceller og celler fra endotel afstamning 1. Den resulterende ASC befolkning er relativt homogent i udseende og består af fibroblast-lignende celler (figur 2). Disse adhærente ASC'er vokse godt i kultur under standard vævskultur-betingelser, og udviser en moderat population fordoblingstid 1 gør dem egnede til mange molekylære og celle biology undersøgelser in vitro og regenererende undersøgelser in vivo. Men i lyset af den heterogene karakter af den isolerede SVF er nødvendig validering af ASC befolkning. Talrige undersøgelser har brugt flowcytometri for at karakterisere cd'en antigene profil af dyrkede ASC'er som et potentielt middel til at identificere disse celler både in vitro og in vivo 5-9. Tabel 1 opsummerer resultaterne fra mange af disse studier. Mens udtryk for nogle af disse CD-antigener er stadig kontroversielt, er det generelt enighed om, at dyrkede ASCs er CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90 og CD140a positiv. Fraværet af en lang række hæmatopoietiske CD-antigener, såsom CD31 og CD45, er i overensstemmelse med mesodermal oprindelse ASC, selvom ekspressionen af ​​specifikke hæmatopoietiske markører som CD34 forbliver uløst på dette tidspunkt. For nylig ASC antigene profiler, som bestemt ved flowcytometri er blevet anvendt til at selektere for specifik SUBPOPgørelser 10-12 i håb om at producere ASC'er med forbedrede differentiering kapacitet.

Da de mest populære middel til validering, in vitro induktion af ASC befolkning ved hjælp af definerede dyrkningsbetingelser resulterer i deres differentiering i mesodermale, ektodermal og endodermale slægter (for en oversigt, se 4) (Figur 2). Mens in vitro tri-kimlag potentiale har resulteret i brugen af ASC'er for en bred vifte af regenerative modelsystemer, differentiering i osteogent, adipogenisk og chondrogene celler er normalt tilstrækkeligt til at identificere ASC og bekræfte sin multipotency. I vores hænder, adipogenisk differentiering af ASC'er resulterer i celler, der indeholder lyse lipidvakuoler der pletten med Oil Red O 5. Osteogene differentiering påfører alkalisk fosfatase-positive celler og ophobning af ekstracellulære mineral, som farver ved hjælp af en calciumphosphat Von Kossa Stain 5..Chondrogen differentiering under high-density mikromasse betingelser producerer træpiller, der indeholder sulfaterede proteoglycaner (detekteret ved hjælp af en Alcian blå plet) og udtrykker kollagen type 2 5. Både skeletmuskulatur og glat muskulatur differentiering kan ses med ASC'er farvning for skeletmuskel myosin og MYOD1 og glat muskel-actin 5, 13, 14. Differentiering i ectodermal afstamning er foreslået gennem antagelsen af en neuronal-lignende morfologi af inducerede ASCs og udtryk for mange neuronale markører, herunder at Neun, en neuronal transskription faktor 5.. Endelig induktion af ASC'er mod en lever / endodermal afstamning baseret på fastsatte betingelser 15 resultater i celler, der udtryk alfa-føtoprotein, en velkendt markør for leveren hepatocytter. Disse markører, sammen med mange andre, der er offentliggjort i løbet af de sidste 10 år antyder kraftigt, at ASC er en pluripotente stamcelle befolkning, der nemt kan vedligeholdes ogopformeret in vitro og induceret mod celler af de tre embryonale kim slægter. Koblet til deres regenerative potentiale in vivo (til gennemgang se 4), kan ASC være et effektivt supplement til de redskaber, af regenerativ forsker eller kliniker.

Figur 1
Figur 1. Manual, enzymatisk isolation af menneskelige ASC'er fra lipoaspirate prøver. A. Forberedelse til isolation: Forud for isolation af følgende komponenter bør være forberedt: 1) 1x PBS (uden calcium eller magnesium), steriliseret via autoklavering, 2) en opløsning af 0,075 til 0,1% collagenase type IA, som er udarbejdet i 1x PBS og steriliseret gennem filtrering ved hjælp af en 0,22 um filter enhed, 3) Kontrol Medium (CM) til efterfølgende kultur i ASC befolkning. B. Isolering af ASCs: En trin-for-trin guide til isolering af stroma vaskulære fraktion (SVF) fra lipoaspirates vises. Skridt omfatter vask af lipoaspirate med sterilt 1x PBS, fordøjelse ved hjælp af kollagenase type IA, indsamling af SVF ved centrifugering, og SVF filtrering. Efterfølgende dyrkning af SVF vil resultere i en Tilhænger fibroblast befolkning, der indeholder ASC befolkning. Klik her for at se større figur.

Figur 2
Figur 2. Multi-slægt differentiering potentiale vedhængende ASC befolkning. Dyrkede SVF-celler resulterer i en relativt homogen population af adhærerende, fibroblastiske ASC'er. Induktion af ASC befolkning under definerede betingelser resulterer i celler i adipogene, osteogeniske, chondrogent, skelet myogenic og glatte myogene afstamninger.Desuden kan ASC'er også opdeles i celler af ektodermal afstamning, udtrykker Neun, en markør for neuroner og alpha-føtoprotein (AFP) en etableret markør for endodermal / hepatisk cellelinie. Nogle histologi og immunfluorescerende billeder er taget fra tidligere offentliggjorte resultater 1,5,6,7,8,9. Differentiering afstamning sammen med histologiske, immunohistologiske eller fluorescerende pletten er vist. Klik her for at se større figur.

Expression profil
positivt udtryk negative udtryk
CD9, CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49a, CD49b, CD49d, CD49e,
CD51, CD54, CD55, CD59, CD61, CD63, CD71, CD73, CD90, CD105, CD138, CD140a, CD146, CD166, HLA-ABC, STRO-1
CD11a, CD11b, CD11c, CD14, CD16, CD18, CD31, CD41a, CD49f, CD45, CD50, CD56, CD62E, CD62L, CD62P, CD104, CD106, CD133, CD144, CD146,
HLA-DR, SMA, ABCG2
foreslåede fænotype af ASCs
(Fælles mellem to eller flere undersøgelser)
CD10, CD13, CD29, CD34, CD44, CD49d, CD54, CD90, CD140a,
HLA-ABC, STRO-1
CD11a, CD11b, CD11c, CD14,
CD31, CD45, CD106, CD144
kontroversielle markører i ASCs
(Differential resultat multiple undersøgelser)
CD105, CD117, CD140b, CD146, CD166, SMA, HLA-DR
stromal cell markører CD29, CD44, CD73, CD90, CD166
hæmatopoietiske markører CD31, CD34, CD45, ABCG2
markører i fælles mellem 2 eller flere undersøgelser vist i fed
SMA = glat muskulatur actin
HLA = human leukocyt antigen
ABCG2 = multi-drug transportør protein G2

Tabel 1. Celleoverfladeekspression profiler af menneskelige ASCs.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Fedtvæv til isolering af ASC'er kan komme i mange former: fra faste stykker af væv opnået ved resektion eller lipoplasty til mindre stykker opnået enten gennem sprøjte udvinding eller suge-assisteret lipoplasty (dvs. fedtsugning). Hvorvidt flere SVF celler (og dermed ASCs) kan fås fra resekteres eller indsugning adipose prøver er uklart, da modstridende undersøgelser er blevet præsenteret 16, 17. Det er muligt, at begge former af fedtvæv er mere end egnet til isolering af SVF celler og ASCs så længe operatøren er dygtige i deres isolation teknik. , Fedtsugning har imidlertid holde en fordel i forhold resektion i det er det mindre invasiv og kræver betydeligt mindre postoperativ pleje. Mens de typer af fedtsugning er steget i det seneste årti, herunder teknikker, såsom ultralyd-assisteret, servoforstærkede og laser-assisteret fedtsugning 18, det mest almindelige er tumescent fedtsugning,hvor fedt rum er oversvømmet med store mængder af sterilt saltvand, anæstetika og vasokonstriktorer før aspiration 19. Valget af teknik kan variere fra kirurg til kirurg. Men mens midlerne til udvinding kan synes uvæsentligt for forskeren, er det vigtigt at indse, at teknikken kan have en effekt på ASC nummer og levedygtighed. For eksempel kan øge fedtsugning vakuum pres negativ indflydelse SVF celleudbytte 20. Desuden falder i ASC spredning er blevet målt ved ultralyd-assisteret fedtsugning 17.

Men fremkommet, bør aspirere hurtigt blive behandlet som opbevaringstemperaturer kan påvirke SVF levedygtighed og eventuel ASC udbytte. Undersøgelser foretaget af Matsumoto et al. Har vist, at ASC udbytte falder, hvis aspiratets opbevares ved stuetemperatur i længere tid end 24 timer 21. Hvis det er nødvendigt, kan 24 timers opbevaring ved 4 ° C anvendes uden nogen skadelig virknings på de biologiske egenskaber af ASC befolkning, men igen, cellelevedygtighed kan reduceres, hvis denne opbevaringstid øges ud over dette punkt. Den lette lipoaspirate behandling er direkte relateret til den samlede volumen. Mindre mængder, opnået gennem sprøjte ekstraktion, er relativt nemme at behandle. Større volumen aspirater, opnået gennem fedtsugning, kan imidlertid præsentere fysiske udfordringer. For eksempel kan noget så simpelt at overføre fedt fra aspiration beholderen, således at det kan vaskes give problemer når aspirat volumen er stort. Protokollen er beskrevet i denne artikel er beregnet til at afhjælpe nogle af disse udfordringer.

I det store og har isolering af ASC befolkninger mod lipoaspirates vha. beskrevet i denne artikel enzymatiske metode ikke ændret sig væsentligt i løbet af de sidste 10 år. Der er mange protokoller tilgængelige via PubMed, der er fremragende i deres beskrivelse af isoleringen af ​​ASC'er fra lipoaspirates. Most af dem skitsere en meget lignende protokol med mindre modifikationer. Dybest set, er det lipoaspirate vaskes af forurenende stoffer, fordøjet enzymatisk at frigive SVF og SVF indeholdende ASC befolkning, indsamles via centrifugering. De fleste store volumen lipoaspirates ankommer i en form for vakuum beholder - konfigurationen, som kan variere fra kirurg til kirurg. Denne protokol anbefaler fjernelse af aspirat i et stort, steril bæger før vask, da selve beholderen kan være en kilde til forurening, hvis ikke ordentligt renset, inden det kommes i biosikkerhed hætte. Når overføres, og lov til at bundfælde ved tyngdekraft, vil aspirat adskilt i tre lag: en top, olielag, som resulterer fra lysis af modne adipocyter, en midterste fedtvæv lag og et bundlag af saltvand og kontaminerende røde blodlegemer. Olien lag skal fjernes, som vi har bemærket, at det kan være toksisk for de resulterende cellekulturer (upublicerede observationer). Også denne protocol anbefaler, at infranatant saltvand og RBC'er før den første vask med henblik på at reducere antallet af potentielle kontaminerende RBC'er når ASC'er dyrkes vil fjernet. Imidlertid har en undersøgelse af Francis et al. Foreslået, at denne infranatant også kan være en kilde til ASCs 22. Brugen af ​​en 10 ml serologisk pipette gør fjernelse af dette infranatant relativt let. Hvad der stadig er fedt lag, kan derefter let vaskes under anvendelse af sterilt PBS, eller hvis det ønskes, steril PBS suppleret med antibiotika og antimykotisk at mindske risikoen for kontaminering 23-25. Efter vaskning fedtvæv enzymatisk fordøjet under anvendelse af en steril opløsning af collagenase type IA. Anvendelsen af ​​en filterenhed, såsom Millipore enhed vist i denne video kombinerer en bekvem måde aseptisk filtrering collagenase i en lukket beholder, som den vaskede fedtvæv kan tilsættes til efterfølgende vandbad fordøjelse ved 37 ° C.

Den type collagenase brugt har varieret fra gruppe til gruppe med collagenase type IA synes at være mere fremherskende 1, 24, 25. Men der er over 11 forskellige typer af kollagenase kommercielt tilgængelige, hver med fordøjelse affiniteter for specifikke væv. For fordøjelsen af fedtvæv, selskaber såsom Sigma Aldrich anbefale collagenase type I og II, og begge typer er godt repræsenteret i dagens litteratur 1, 24-27. I deres oprindelige artikel, Zuk et al. Bruge kollagenase type IA stammer fra kvæg kilder i en koncentration på 0,075% 1. Men de fleste kommercielle kilder kollagenase type IA nu fås fra anaerobe bakterier Clostridium histolyticum eller E. coli genetisk modificeret med C. histolyticum gener. Mange virksomheder tilbyder en lang række præparater af kollagenase type IA, fra rå til dem forberedt gennem ammoniumsulfatpræcipitation. Denproceduren skitseret i denne JOVE artikel bruger et råt præparat af type IA collagenase, der indeholder ikke blot collagenase aktiviteter, men også ikke-specifik protease, clostripain og tryptiske enzymatiske aktiviteter. Mens disse yderligere enzymer er afgørende for fordøjelsen effektivitet 28 er der dem, der rapporterer parti til parti variation forbundet med rå kollagenase type IA 28, 29 og øge deres koncentrationer af collagenase op til 0,2% for at opnå en effektiv fordøjelse 23. Disse grupper med rå kollagenase type IA anbefaler også et tilskud med bovint serumalbumin (0,1-1,0% BSA) for at forbedre enzymets ydeevne og øge stabiliteten af ​​celler i fedtvæv matrix. Dog kan dette ikke være nødvendigt, da protokollen beskrevet i denne artikel bruger collagenase uden tilskud af nogen skadelig virkning på fordøjelsen effektivitet.

For dem, der ønsker at anvende en mere defineret collagenase composition, kommercielle kilder indeholder højtoprenset collagenase sammen med en nøjagtig blanding af proteaser er nu tilgængelige. Disse præparater rense klostridiale collagenase type I og II til høj aktivitet og kombinerer dem med kendte neutrale protease aktiviteter, såsom dispase og termolysin. Effektiv fedt fordøjelse ved hjælp af collagenase og termolysin er blevet rapporteret af Zachar et al. 27.. Efter aftale med dette arbejde, Pilgaard et al. 30. rapporterer også fremragende fordøjelse effektivitet ved hjælp af flere blandinger af collagenase og termolysin. Men de observerer bedre fordøjelse effektivitet ved hjælp præparater af collagenase og dispase.

Fordøjelse gange til isolering af celler fra fedtvæv kan variere fra undersøgelse til undersøgelse. Mange publicerede protokoller anbefale fordøjelsesperiode på 1-2 hr 27, 30. Men det er vigtigt at indse, at store fordøjelsesperiode i sidste ende kan påvirke antallet af levedygtige ASCs og deres stamcelle-fænotype. Pilgaard og kolleger har konstateret, at 2 timer fordøjelse ved 37 ° C giver den bedste balance mellem væv dissociation og ASC-funktionalitet 30, med Zachar et al. Anbefaler, at fordøjelsen, forbi 45 min, skal overholdes hvert 15. minut indtil 2 Maxpuls med fordøjelsen blive stoppet, når fedtvæv tager på en mere homogen fremtoning 27. Vi er enige i denne anbefaling. Men det er vores erfaring, at de fleste collagenase type IA forberedelser på 0,075 til 0,1% er i stand til at fordøje store mængder af lipoaspirates i 30-45 min, og at disse tider er tilstrækkelige til at befri et tilstrækkeligt antal celler. Derfor er denne protokol anbefaler en fordøjelse tid på 30 min. Hvis der er behov for mere tid, skal konsistensen af lipoaspirate blive overvåget og fordøjelse standses, når lipoaspirate antager en "cremet" eller "soupy" udseende (figur 1).

Når the fordøjelsen er fuldstændig, isolering af det frigjorte SVF simpelthen udføres ved anvendelse af centrifugering. Men ligesom aspiration pres, kan de fysiske virkninger af centrifugering have en effekt på SVF levedygtighed og antallet af ASCs rådighed for kulturen. En undersøgelse foretaget af Kurita og kolleger 31 har vist, at hastigheder på over 3.000 xg kan beskadige ASC. Dog bør hastigheder være stort nok til at sikre tilstrækkelig pelletering af SVF. Som regel de fleste protokoller, herunder denne ene, anbefale en centrifugering hastighed på 1.200-1.500 x g. Der bør udvises forsigtighed ved forskeren for at sikre, at de forstår sammenhængen mellem centrifugalkraften (målt i g) og centrifugering hastigheder (målt som rpm), da forholdet afhænger af den specifikke centrifugerotor. Men som regel lavere centrifugale kræfter, såsom 1.200 xg, ofte svarer til centrifugering hastighed og kan anvendes sikkert i flæng.

Efter spinding flere distinct lag er observeret i centrifugeglas (figur 1): et øverste lag af olie og "fluffy" hvide adipocytter, en midte collagenase lag og en pelleteret celle. Pelleten selv kan have to forskellige lag: et øvre lag af RBC'er og en nedre hvid SVF pellet indeholdende de ASC'er. Denne protokol anbefaler forsigtig opsugning af olie og adipocytter, da olien kan være toksisk for cellekulturen og adipocyter har vist sig at være i stand til dedifferentiering tilbage til en mere primitiv celletype 32. Dog kan disse adipocytter udtages på dette tidspunkt, hvis det ønskes. På grund af disse forureninger, denne protokol anbefaler en ekstra vask skridt for at sikre deres passende fjernelse. Dette trin giver også forskeren at kombinere flere SVF pellets til efterfølgende let filtrering. Filtrering sandsynligvis være nødvendig på grund af tilstedeværelsen af ​​store stykker af fibrotisk materiale og cellulære aggregater efter fordøjelsen. Disse materialer er let fjernesved simpel tyngdekraft-baseret filtrering gennem 70 eller 100 um mesh filtre. En portion af filtratet kan tages for at tælle antallet af celler med kerne, hvis det ønskes, og det resterende filtrat belagt for ASC vedhæftning og ekspansion.

Trods flittige forsøg på at fjerne så mange RBC som muligt, vil ingen ASC forberedelse være helt uden RBC forurening. I vores oprindelige artikel, foreslog vi fjernelsen af disse RBC gennem resuspension af pellet i en hypotonisk opløsning på 160 mM NH4CI. De fleste af de efterfølgende isolation artikler indeholder dette skridt, og anbefaler brugen af NH 4 Cl-baserede løsninger eller sterilt vand 22-24, 27, 33, selv om der skal tages hånd om at bruge sterilt vand, for at minimere den tid, de SVF cellerne udsættes til hypotonisk opløsning 27. Dog kan dette trin ikke nødvendigt, da RBC er en ikke-klæbende celle befolkning og kan nemt fjernes efter en overnatning kulturASC befolkning. Selv anekdotiske i bedste fremgår disse RBC'er for at forbedre den første ekspansion af de resulterende adhærente celler (Zuk, upublicerede observationer). Som sådan er denne protokol eliminerer RBC skridt og foreslår, at de første ASC kulturer få lov til at udvide i tilstedeværelsen af ​​disse RBC'erne for de første 3-4 dage uden nogen ændring af dyrkningsmediet. Årsagen til denne observation kan være på grund af nogle type parakrin signalering fra kontaminerende blodlegemer eller kan simpelthen skyldes bedre levedygtighed med udelukkelse af RBC trin. Efter dette, kan dyrkningsmediet aspireret, og de fleste af RBC'er fjernet ved forsigtigt at vaske pladerne med sterilt 1x PBS. Over tid vil de resterende RBC sidst dø og blive fjernet fra kulturen.

Undersøgelser foretaget af Zachar og Boquest har anslået, at 25-50% af den resuspenderede SVF pellet klæber til vævskulturplast 23, 27. Den resulterende "passage 0" ASC cultures er heterogene, bestående af små, runde celler menes at være ASCs og mere uregelmæssigt formede celler foreslås at være endotel oprindelse. Mens undersøgelser af mange grupper, herunder vores har bekræftet fravær af kontaminerende celletyper såsom SMC'er, hæmatopoietiske celler og fibroblaster i ASC kulturer 1, kan tilstedeværelsen af yderligere celletyper ikke udelukkes. . Faktisk har Tallone m.fl. karakteriseret passage 0 kulturer og observerede fire forskellige populationer: 1) små, runde, hurtigt forny celler, 2) spindel-formet fibroblastceller menes at være ASC, 3) langsomt replikerende store celler med en mere begrænset potentielle (dvs. præ-adipocytter) og 4) cuboidal endotelceller, der går tabt med passage 34. Efterfølgende undersøgelser har vist, at den runde, hurtigt forny cellepopulation har den højeste multipotentiality og udtrykke typiske stamcellemarkører 35, 36. Desuden kan de danne "sphæroider" grundetderes hurtige spredning og er ofte omgivet af spindel-formet fibroblaster. Som sådan er det muligt at spindelformede ASC befolkning foreslået ovenfor kan stamme fra disse celler. Efter indledende udvidelse af disse passage 0 ASC kulturer, menes det, at fortsat dyrkning over tid vælger for ASC, med de deraf følgende kulturer, under forudsætning af en mere fibroblastic, homogen sammensætning. Men rester af kontaminerende celler kan ikke helt udelukkes, og derfor bør ASC befolkning stadig betragtes heterogene.

Mens protokollen beskrevet i denne artikel er enkel, billig og kræver ikke nogen stykker af udstyr, der normalt ikke findes i en vævskultur facilitet, det har den ulempe at kræve en sådan facilitet. Talrige undersøgelser har undersøgt den translationelle anvendelser af ASC'er gennem dyremodeller og kliniske undersøgelser af ASC er begyndt at dukke op (for en oversigt, se 4

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne af dette manuskript er medopfindere om et patent ejet af Regents fra University of California og licenseret til Cytori Therapeutics.

Acknowledgments

Forfatterne ønsker at anerkende og takke de yderligere forskning personale, der har bidraget til udviklingen af ​​den beskrevne protokol og dens isolering af ASCer, herunder: Dr. H. Peter Lorenz, MD, Dr. Hiroshi Muzuno, MD, Dr. Jerry Huang, MD Dr. Adam Katz, MD, Dr. William Futrell, MD, Dr. Rong Zhang, DDS, ph.d., dr Larissa Rodriguez, MD, Dr. Zeni Alfonso, ph.d., og Dr. John Fraser, PhD. De præsenterede resultater blev finansieret delvist af forskningsbevillinger fra National Institutes of Health, herunder NIAMS og NIDCR Institutes.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagent
DMEM (Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium) Mediatech Cellgro 10-013-CV with 4.5 g/ml glucose, L-glutamine, sodium pyruvate
Penicillin/Streptomycin Mediatech Cellgro 30-002-CI 10,000 IU/ml penicillin/10,000 μg/ml streptomycin
Amphotericin B Mediatech Cellgro 30-003-CF 250 μg/ml amphotericin B
10X PBS (Phospho-buffered Saline) Mediatech Cellgro 25-053-CI without calcium, without magnesium
Trypsin/EDTA Mediatech Cellgro 20-031-CV 0.25 % trypsin/2.21mM EDTA
Collagenase type IA (from Clostridium histolyticum) Sigma C2674 crude preparation; <125 collagen digestion units/mg solid
FBS (Fetal Bovine Serum) heat inactivated Gemini Bioproducts 100106 USDA source, heat inactivated
10 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-104
25 ml serological pipettes Genesee Scientific 12-106
50 ml polypropylene centrifuge tubes Genesee Scientific 21-106
100 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-202
150 mm tissue culture dishes Genesee Scientific 25-203
500 ml Stericup Filter Units Millipore SCGPU05RE PES membrane, 0.22 μm pore
Cell strainers FisherBrand 22-363-549 100 μm nylon mesh
dexamethasone - water soluble Sigma D-2915
L-ascorbic-acid 2 phosphate Sigma A-8960
β-glycerophosphate disodium salt Sigma G-9422 also known as glycerophosphate
insulin Sigma I-6634 made from bovine pancreas
indomethacin Sigma I-7378
apo-transferrin Sigma T-4382
TGFβ1 R&D Systems 240-B-002 recombinant human
Oil Red O Sigma O-0625
Alcian Blue Sigma A-5268
Silver nitrate Sigma S-0319
Hydrochloric acid Fisher Scientific A144
Paraformaldehyde Fisher Scientific 30525-89-4 supplied as a 16 % stock
Name Company Catalog Number Comments
Equipment Needed
Class II A/B Biosafety hood Thermo Scientific ensure hood has vacuum lines for aspiration
Benchtop centrifuge Hermle Labnet Z383 Swing-out rotor for 50 ml tubes required, capable of 1200xg
Water bath Fisher Scientific Isotemp S52602Q 5-10L capacity, capable of 37C
Automated Pipette Aids Drummond Pipette Aid XL 4-000-105
CO2 Incubator Thermo Scientific Forma 310 direct heat or water jacketed

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zuk, P. A., et al. Multi-lineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering. 7, (2), 211-226 (2001).
  2. Rodbell, M. Metabolism of isolated fat cells. J. Biol. Chem. 239, 375-380 (1964).
  3. Poznanski, W. J., Waheed, I., Human Van, R. fat cell precursors. Morphologic and metabolic differentiation in culture. Lab Invest. 29, (5), 570-576 (1973).
  4. Zuk, P. A. Adipose-derived Stem Cells in Tissue Regeneration: A Review. ISRN Stem Cells. in press (2012).
  5. Zuk, P. A., et al. Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Mol. Biol. Cell. 13, 4279-4295 (2002).
  6. Mitchell, J. B., et al. Immunophenotype of human adipose-derived cells: temporal changes in stromal-associated and stem cell-associated markers. Stem Cells. 24, (2), 376-385 (2006).
  7. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Phenotypical and functional characterization of freshly isolated adipose tissue-derived stem cells. Stem Cells Dev. 16, (1), 91-104 (2007).
  8. Yoshimura, K., et al. Characterization of freshly isolated and cultured cells derived from the fatty and fluid portions of liposuction aspirates. J Cell Physiol. 208, (1), 64-76 (2006).
  9. Zannettino, A. C., et al. Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. J Cell Physiol. 214, (2), 413-421 (2008).
  10. Chung, M. T., et al. CD90 (Thy-1) Positive Selection Enhances Osteogenic Capacity of Human Adipose-Derived Stromal Cells. Tissue Eng Part A. (2012).
  11. Li, H., et al. Adipogenic potential of adipose stem cell subpopulations. Plast Reconstr Surg. 128, (3), 663-672 (2011).
  12. Rada, T., Reis, R. L., Gomes, M. E. Distinct stem cells subpopulations isolated from human adipose tissue exhibit different chondrogenic and osteogenic differentiation potential. Stem Cell Rev. 7, (1), 64-76 (2011).
  13. Heydarkhan-Hagvall, S., et al. Human Adipose Stem Cells: A Potential Cell Source for Cardiovascular Tissue Engineering. Cells Tissues Organs. 187, (4), 263-274 (2008).
  14. Jack, G. S., et al. Processed lipoaspirate cells for tissue engineering of the lower urinary tract: implications for the treatment of stress urinary incontinence and bladder reconstruction. J Urol. 174, (5), 2041-2045 (2005).
  15. Banas, A., et al. Rapid hepatic fate specification of adipose-derived stem cells and their therapeutic potential for liver failure. J Gastroenterol Hepatol. 24, (1), 70-77 (2009).
  16. Schreml, S., et al. Harvesting human adipose tissue-derived adult stem cells: resection versus liposuction. Cytotherapy. 11, (7), 947-957 (2009).
  17. Oedayrajsingh-Varma, M. J., et al. Adipose tissue-derived mesenchymal stem cell yield and growth characteristics are affected by the tissue-harvesting procedure. Cytotherapy. 8, (2), 166-177 (2006).
  18. Ahmad, J., Eaves, F. F., Rohrich, R. J. 3rd, Kenkel, J. M. The American Society for Aesthetic Plastic Surgery (ASAPS) survey: current trends in liposuction. Aesthet Surg J. 31, (2), 214-224 (2011).
  19. Tierney, E. P., Kouba, D. J., Hanke, C. W. Safety of tumescent and laser-assisted liposuction: review of the literature. J Drugs Dermatol. 10, (12), 1363-1369 (2012).
  20. Mojallal, A., Auxenfans, C., Lequeux, C., Braye, F., Damour, O. Influence of negative pressure when harvesting adipose tissue on cell yield of the stromal-vascular fraction. Biomed Mater Eng. 18, (4-5), 193-197 (2008).
  21. Matsumoto, D., et al. Influences of preservation at various temperatures on liposuction aspirates. Plast Reconstr Surg. 120, (6), 1510-1517 (2007).
  22. Francis, M. P., Sachs, P. C., Elmore, L. W., Holt, S. E. Isolating adipose-derived mesenchymal stem cells from lipoaspirate blood and saline fraction. Organogenesis. 6, (1), 11-14 (2010).
  23. Boquest, A. C., Shahdadfar, A., Brinchmann, J. E., Collas, P. Isolation of stromal stem cells from human adipose tissue. Methods Mol Biol. 325, 35-46 (2006).
  24. Bunnell, B. A., Flaat, M., Gagliardi, C., Patel, B., Ripoll, C. Adipose-derived stem cells: isolation, expansion and differentiation. Methods. 45, (2), 115-120 (2008).
  25. Dubois, S. G., et al. Isolation of human adipose-derived stem cells from biopsies and liposuction specimens. Methods Mol Biol. 449, 69-79 (2008).
  26. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide. Stem Cells Dev. 19, (10), 1449-1470 (2010).
  27. Zachar, V., Rasmussen, J. G., Fink, T. Isolation and growth of adipose tissue-derived stem cells. Methods Mol Biol. 698, 37-49 (2011).
  28. Williams, S. K., McKenney, S., Jarrell, B. E. Collagenase lot selection and purification for adipose tissue digestion. Cell Transplant. 4, (3), 281-289 (1995).
  29. Wang, H., Van Blitterswijk, C. A., Bertrand-De Haas, M., Schuurman, A. H., Lamme, E. N. Improved enzymatic isolation of fibroblasts for the creation of autologous skin substitutes. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 40, (8-9), 268-277 (2004).
  30. Pilgaard, L., Lund, P., Rasmussen, J. G., Fink, T., Zachar, V. Comparative analysis of highly defined proteases for the isolation of adipose tissue-derived stem cells. Regen Med. 3, (5), 705-715 (2008).
  31. Kurita, M., et al. Influences of centrifugation on cells and tissues in liposuction aspirates: optimized centrifugation for lipotransfer and cell isolation. Plast Reconstr Surg. 121, (3), 1033-1041 (2008).
  32. Poloni, A., et al. Human dedifferentiated adipocytes show similar properties to bone marrow-derived mesenchymal stem cells. Stem Cells. 30, (5), 965-974 (2012).
  33. D'Andrea, F., et al. Large-scale production of human adipose tissue from stem cells: a new tool for regenerative medicine and tissue banking. Tissue Eng Part C Methods. 14, (3), 233-242 (2008).
  34. Tallone, T., et al. Adult human adipose tissue contains several types of multipotent cells. J Cardiovasc Transl Res. 4, (2), 200-210 (2011).
  35. De Francesco, F., et al. Human CD34/CD90 ASCs are capable of growing as sphere clusters, producing high levels of VEGF and forming capillaries. PLoS One. 4, (8), e6537 (2009).
  36. Haasters, F., et al. Morphological and immunocytochemical characteristics indicate the yield of early progenitors and represent a quality control for human mesenchymal stem cell culturing. J Anat. 214, (5), 759-767 (2009).

Comments

1 Comment

  1. Hello, I´m an psot graduation student from Brazil and this paper and video would help me a lot! So, can anyone tell me how can I get it? I didn´t find a place to pay and I dont know if I will get it through the university.

    Best Regards, Felipe

    Reply
    Posted by: Felipe R.
    May 8, 2014 - 4:21 PM

Post a Question / Comment / Request

You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

Usage Statistics