בידוד ואפיון כימי ליפידים מחיידקים גראם שליליים

Chemistry

Your institution must subscribe to JoVE's Chemistry section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

בידוד ואפיון של תחום שומנים בדם של lipopolysaccharide (LPS) מחיידקי גרם שלילי מספק תובנה מנגנוני תא שטח על בסיס של עמידות לאנטיביוטיקה, הישרדות והכושר בקטריאלי, ואיך כימי שומנים מגוונים מינים מולקולריים דיפרנציאלי לווסת תגובות חיסוניים מולדים מארחות.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Lipopolysaccharide (LPS) הוא המולקולה הגדולה פני תא של חיידקי גרם שלילי, שהופקדה על העלון החיצוני של bilayer הקרום החיצוני. ניתן לחלק LPS לשלושה תחומים: O-פוליסכריד דיסטלי, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם תחום בהיקף של שומנים מינים מולקולריים ושאריות 3-deoxy-D-manno באוק '2-ulosonic חומצה (Kdo). תחום שומנים בדם הוא רק המרכיב חיוני להישרדות תא חיידק. בעקבות הסינתזה שלה, שומנים בדם הוא שינוי כימי בתגובה ללחצים סביבתיים כגון pH או טמפרטורה, כדי לקדם את ההתנגדות לתרכובות אנטיביוטיות, וכדי להתחמק מזיהוי על ידי מתווכים של תגובת החיסון המולדת המארחת. הפרוטוקול המפרט את הבידוד קטן וגדולה בקנה מידה של שומנים בדם מחיידקי גרם שלילי. חומר מבודד מכן מאופיין כימי על ידי כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC) או ספקטרומטר מסה (MS). בנוסף למטריקס בסיוע לייזר desorption / יינון פעמי של fאור (MALDI-TOF) טרשת נפוצה, אנו גם מתארים את פרוטוקולי MS מקביל לניתוח שומנים מינים מולקולריים באמצעות יינון electrospray (ESI) מצמידים את ניתוק התנגשות מושרה (CID) וphotodissociation סגול מועסקים חדשים שיטות (UVPD). פרוטוקולי MS שלנו מאפשרים לקביעה חד משמעית של מבנה כימי, בעל חשיבות עליונה לאפיון של מולקולות שומנים המכילות שינויים כימיים ייחודיים או חדשניים. אנו גם מתארים את תיוג radioisotopic, והבידוד שלאחר מכן, של שומנים מתאי חיידקים לניתוח על ידי TLC. יחסית לפרוטוקולים מבוססי MS, TLC מספק שיטת אפיון יותר חסכונית ומהירה, אבל לא ניתן להשתמש בו כדי להקצות באופן חד משמעי שומנים מבנים כימיים ללא השימוש בסטנדרטים של מבנה כימי ידוע. במהלך שני העשורים האחרונים בידוד ואפיון של שומנים בדם הובילו לתגליות מרגשים רבות ששפרו את ההבנה של הפיסיולוגיה של חיידקי גרם שלילי, מנגנונים של התנגדות לאנטיביוטיקה שלנוtance, התגובה החיסונית המולדת האנושית, וספק הרבה מטרות חדשות בפיתוח של תרכובות אנטי בקטריאליים.

Introduction

Lipopolysaccharide (LPS) הוא מולקולת המשטח החיצונית העיקרית של כמעט כל יצורי גרם שלילי והוא מורכב משלושה תחומים מולקולריים: פוליסכריד דיסטלי O-אנטיגן, oligosaccharide ליבה, והשומנים בדם הקרום הקשורים תחום שהופקד על העלון החיצוני של 1,2 bilayer קרום חיצוני. השומנים תחום מורכב משאריות 3-deoxy-D-manno באוק '2-ulosonic (Kdo) ושומני מינים מולקולריים, שבו שומנים בדם יכול להיות מוגדרים כחלק מסיס בכלורופורם של LPS על הידרוליזה מתונה חומצת 1, 2. השומנים סטנדרטיים מולקולה יכולים להיות מוגדרים כימי כמו עמוד השדרה diglucosamine שהוא וbis-פוספורילציה-acylated שש; בקנה אחד עם מיני שומנים העיקריים שנצפו בcoli אורגניזם מודל Escherichia coli (E. coli) 1,2. תשעה גנים הביעו constitutively, נשמרו לאורך כל חיידקים גראם שלילית, הם אחראים לייצור של השומנים בדם תחום (איור 1) 1,2. רוב החיידקים סט נוסף של גנים, אשר משתנה במידת שימור פילוגנטי, המשתתפים בשינוי כימי נוסף של שומנים בדם 3. Dephosphorylation, הסרת חלק מרשתות acyl, והתוספת של moieties הכימי כגון סוכרים אמינו (למשל aminoarabinose) ו / או phosphoethanolamine הן הפעילויות (איור 1) נצפה הנפוצות ביותר. רבים מהאנזימים האחראים לשומני שינוי מופעלים ישירות על ידי אותות סביבתיים, כגון קטיונים דו ערכיים, או הביטוי שלהם מוסדר על ידי שתי מערכות תגובת רגולטור רכיב 3.

הכרה של מיני שומנים בדם על ידי מערכת החיסון המולדת המארח מתווכת על ידי גורם הקולטן חיוג כמו בידול 4/myeloid 2 (TLR4/MD2) שיתוף קולט 4. כוחות הידרופובי בין MD2 והשומנים בדם רשתות acyl, כמו גם בין TLR4 וקבוצות 1 ו -4 "פוספט של שומנים בדם לקדם את הקשר החזק של שפהid עם TLR4/MD2 4,5. שינויים שמשנים את מצב acylation או המטען השלילי של שומנים שומנים מבוססי ההשפעה TLR4/MD2 הכרה וגירוי במורד הזרם של תגובת החיסון המולדת מטהרי NF-κB ומתווכים של דלקת כגון TNFα ו6,7 IL1-β. שינויים שלהסוות את המטען השלילי של שומנים בדם גם למנוע פפטידים מיקרוביאלית קטיוני bactericidal מלהיקשר לגראם שלילי משטחי תא 3,8. שינויי שומנים רבים שיערו להגדיל את כושר חיידקים בתנאים סביבתיים מסוימים, כגון בתוך המארח האנושי או בנישה אקולוגית. מסיבה זו אנזימי שינוי רבים הם מטרות אטרקטיביות בפיתוח רציונלים של תרכובות מיקרוביאלית. הגיוון הכימי של מבני שומנים בדם, ביחס לאורגניזם ו / או בסביבה, ואת ההשלכות הביולוגיות של המבנים המגוונים הללו להפוך את האפיון המבני של שומנים בדם חשוב במאמץ לאהוא לומד של חיידקי גרם שלילי.

בידוד של מולקולות שומנים מכל חיידקים כרוך החילוץ של LPS מתא השטח בקטריאלי, צעד hydrolytic לשחרר את השומנים בדם, ואחרי הליך טיהור סופי 9-11. מצוטט לעתים קרובות ביותר הליך מיצוי LPS הוא הליך המיצוי במים החם-פנול, הוצג לראשונה על ידי סטפל וג'אן 10. לאחר כל LPS חילוץ נתונה הידרוליזה מתונה חומצה, אשר כימי מפרידה Kdo מ6'-הידרוקסיל של סוכר גלוקוזאמין הדיסטלי של שומנים בדם (איור 1). החסרונות רבים קיימים להליך המים חם פנול כוללים השימוש במגיב מפגע גבוה, הצורך להשפיל חומצות המופקים במשותף גרעין וחלבונים, וכמה ימים נדרשים כדי להשלים את הפרוטוקול 10.

המעבדה שלנו פיתחה עוד יותר את החילוץ ובידוד של שומנים בדם כפי שפותח לראשונה על ידי Caroff וRaetz 12,13. בהשוואה לנהלי מים חם פנול, השיטה המוצגת כאן היא מהירה ויעילה יותר ולהכיל מגוון רחב של נפחי תרבות מ5 מיליליטר לליטר מרובה. יתר על כן, בניגוד לעקירות מים חם פנול, השיטה שלנו לא בוחר למחוספס או חלקת סוגי LPS, מתן התאוששות אופטימלית של מיני שומנים בדם. בפרוטוקול שלנו, תמוגה הכימית של תאי חיידקיים שלמים מתבצעת באמצעות תערובת של כלורופורם, מתנול ומים, שבו ניתן pelleted LPS על ידי צנטריפוגה. שילוב של הידרוליזה מתונה חומצה ועקירות ממס (בליי-Dyer) משמשים לשחרור שומנים מפוליסכריד המצורף קוולנטית. השיטה של ליי ודאייר הוחלה לראשונה המיצוי של מיני שומנים ממגוון רחב של בעלי חיים וצמחי רקמות 14, הותאמו כאן להפריד פוליסכריד שעבר הידרוליזה מא שומנים בדם בשלב הפרדה סופי, שומנים מסיסים כלורופורם לחלק באופן סלקטיבי לאורגניים נמוך שלב. כדי לטהר עוד יותר שומנים בדם, הפוך שלב אוכרומטוגרפיה בעמודת מטבע אניוני יכולה לשמש 12.

לאחר הבידוד של מיני שומנים מכל תאים, במספר שיטות אנליטיות יכול לשמש כדי לאפיין את המבנה הכימי של חומר המבודד כגון תמ"ג, TLC, וניתוח המבוסס על MS. NMR מאפשר להבהרה מבנית שאינו הרסנית, ומספק פירוט מבני הקשורים לקשרי glycosidic, הקצאה חד משמעית של עמדות שרשרת acyl, והמחאת האתרים מצורפים לשינויים שומנים בדם כמו aminoarabinose או phosphoethanolamine 15-17. ניתוח NMR של שומנים לא נדון בפרוטוקול שלנו, אבל כבר תאר כראוי במקומות אחרים 15,16. לניתוח מהיר TLC מבוסס שיטות משמשות לעתים קרובות, אך אינו מספק מידע ישיר לגבי מבנה כימי בסדר. פרוטוקולים מבוססים MS הם השיטה המועסק בתדירות הגבוהה ביותר על מנת לאפיין מבני שומנים 18,19. יינון לייזר desorption מטריקס משויך (MALDI)-MS משמש לעתים קרובות בתחילה סקר מיני שומנים בדם בשלמותה. יונים טעונים ביחידים נוצרים מאנליטי נערך בהתאם לנהלי החילוץ שלנו. כפי שנדרש ניתוח מבני עדין יותר, המבוססות על שיטות MS / MS להוכיח אינפורמטיבי יותר מאשר MALDI-MS. מצמידים את electrospray יינון שומנים ביחידים או להכפיל טעונים יונים מבשר הם מקוטעים עוד יותר על ידי ניתוק התנגשות מושרה (CID) או photodissociation אולטרה סגול (UVPD) (ESI), כדי ליצור יוני מוצר מבני אינפורמטיבי 18,20,21. מוצרי אובדן ניטראליים משומנים בדם יונים מבשר גם בתדירות גבוהה שנוצרו במהלך ESI-MS מספקים שכבה נוספת של מידע מבני.

ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) הוכיחה להיות שיטה הכרחית ותכליתית להבהרה של מבני שומנים בדם. במהלך MS / MS, יונים מופעלים להניב דפוס פיצול אבחון שניתן להשתמש בם על מנת להבהיר את המבנה של יון המבשר. אווה נרחבת ביותרשיטת MS / MS ilable היא CID. שיטה זו מייצרת יונים שבר באמצעות התנגשויות של היונים המבשר הנבחרים עם גז אינרטי יעד, וכתוצאה מכך בתצהיר אנרגיה שמוביל לניתוק. CID הוכיח כלי קריטי בהקצאה של מבנה שומנים בדם למגוון רחב של מיני חיידקים 22-33.

למרות CID הוא שיטת MS / MS מיושם ביותר האוניברסלית, זה יוצר מערך מוגבל של יוני מוצר. 193 UVPD ננומטר הוא אלטרנטיבה ושיטת MS / MS משלים. בשיטה זו נעשה שימוש בליזר כדי להקרין יונים, והקליטה של ​​פוטונים התוצאה energization של היונים וניתוק שלאחר מכן. טכניקת MS / MS זה אנרגיה גבוהה יותר מייצרת מערך מגוון יותר של יוני מוצר מאשר CID ובכך מספקת דפוסי פיצול יותר אינפורמטיבי. בפרט, UVPD מעניק מידע על שינויים עדינים במינים שומנים המבוססים על שסעים בglycosidic, אמין, acyl ואיגרות חוב צמודות CC 18,21,34.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

צריכים להיות מוכנים כל הפתרונות עם מים ultrapure ומתנול HPLC כיתה וכלורופורם. פתרונות מוכנים המכילים חומרים ממסים אורגניים כגון מתנול, כלורופורם, או פירידין וחומצות או בסיסים מרוכזים צריכים להיות מוכנים ומשמשים תחת מנדף הכימי. ניתן לאחסן את כל הפתרונות ב RT. ממסים צריכים להימדד בגליל זכוכית סיימתי את הלימודים ומאוחסנים בבקבוקי זכוכית עם ממס PTFE לאורך כובעים. עבור אחסון לטווח ארוך צריכים להיות מאוחסנים ממסים המכיל כלורופורם בבקבוקי זכוכית בצבע ענבר כהים, כדי למנוע את הייצור של פוסגן, כלוריד חומצה תגובתי. צנטריפוגות צינורות PTFE וצלוחיות מאייד סיבוביות יש לשטוף עם מתנול וכלורופורם לפני השימוש. עקוב תקנות פדרליות, מדינה ו / או לסילוק פסולת מוסדי הכרחיות כאשר סילוק של ממסים ו / או פסולת רדיואקטיבית.

1. בקנה מידה גדולה ליפידים הפקה (50 מיליליטר ל1.5 L)

  1. הכן תערובת בליי-דאייר חד פאזיים: כלורופוספט טופס מתנול-1X שנאגרו מלוח (PBS), pH 7.4; 1:2:0.8 V / V). שלב 200 מיליליטר של כלורופורם, 400 מיליליטר של מתנול ו160 מיליליטר של PBS בבקבוק 1 ליטר ממס. בקבוק כובע ומערבבים על ידי היפוך (> 30x). שחרר את הפקק מעת לעת במהלך הערבוב לפרוק ולאחסן אטומים.
  2. הכן שני שלבי תערובת, כלורופורם בליי-דאייר equilibrated מראש: מתנול: מים (2:2:1.8 V / V). שלב 400 מיליליטר של כלורופורם, 400 מיליליטר של מתנול ו180 מיליליטר של מים בבקבוק 1 ליטר ממס. פקק של הבקבוק ומערבבים על ידי היפוך, כדי לוודא כדי לשחרר כובע מעת לעת במהלך הערבוב לפרוק. בואו לאזן O / N וחנות סגור.
  3. הכן את חיץ הידרוליזה חומצה קל (נתרן אצטט 50 מ"מ, pH 4.5; 1% נתרן גופרתי dodecyl (SDS)). ל500 מיליליטר של חיץ הידרוליזה חומצה קל, שוקל 2.05 גרם של נתרן אצטט ולהעביר לכוס 500 מיליליטר. מוסיף מים עד נפח של ~ 350 מ"ל ומערבבים, ואז מוסיף 50 מיליליטר של 10% SDS. לערבב ולהתאים את pH 4.5, להעביר לגליל סיים, ולהוסיף מים ל500 מיליליטר.
  4. להכיןכלורופורם: מתנול (4:1, V / V): מדוד של כלורופורם 100 מיליליטר ולהעביר ממס בקבוק. מדוד 25 מיליליטר של מתנול ולערבב עם כלורופורם. לאחסן בבקבוק זכוכית בצבע ענבר.
  5. לחסן 5 מיליליטר של תקשורת (מרק לוריא או אחרים) ממושבת חיידקים בודדת. לגדול O / N ב 37 מעלות צלזיוס, או בנדרש ° C לצמיחה. תרשים של הליך המיצוי מוצג באיור 2.
  6. למחרת, למדוד את קוטר חיצוני 600 ולהשתמש בתרבות 5 O מיליליטר / N לחסן 200 מיליליטר של התרבות לOD מתחיל 600 של 0.05. לגדל תאים עד OD 600 של 0.8-1.0 הוא הגיע.
  7. קציר תאים באמצעות צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 10 דקות. עוד ספינים עשויים להידרש לזנים שגלולה גרועה. יוצקים את supernatant תקשורת.
  8. לשטוף תא גלולה עם 50 מיליליטר של בופר פוספט 1x (PBS). חזור צנטריפוגה כדי גלולה תאים. יוצקים את supernatant ותא גלולה חנות ב -20 מעלות צלזיוס, או המשך לשלב 1.9.
  9. תאי resuspend ב 40 מיליליטרשל 1x PBS ומתחלקים בין שני 250 צינורות צנטריפוגה מיליליטר PTFE (מניב 20 מיליליטר של השעיה תא / צינור). הוסף 25 מיליליטר של כלורופורם ו50 מיליליטר של מתנול לכל צינור, עבור שלב אחד בליי-דאייר (כלורופורם: מתנול: מים; 1:2:0.8 V / V) (איור 2). מערבבים על ידי היפוך ולדגור על RT ל> 20 דקות כדי להבטיח תמוגה תא שלמה.
  10. צנטריפוגה את התערובת על 2,000 XG עבור 20 דקות. LPS יהיה גלולה יחד עם חלבונים וחומצות גרעין (איור 2), עם זאת, פוספוליפידים, שומני isoprenyl, ופפטידים קטנים, הידרופובי יישארו בsupernatant. בטל supernatant.
  11. שטוף את כדור LPS עם תערובת ~ שלב אחד 100 מיליליטר בליי-דאייר. צנטריפוגה XG ב 2000 עבור 20 דקות. בטל supernatant. כאשר מבודדים את השומנים מE. coli או סלמונלה, נדרש רק אחד לשטוף, עם זאת, ייתכן שיהיה צורך בצעדים לשטוף נוספים כדי להפחית את זיהום פוספוליפידים כאשר מבודדים את שומנים מכמה אורגניזמים.
  12. הוספת 27 מיליליטר של מילחיץ הידרוליזה חומצת ld (אצטט 50 מ"מ נתרן, pH 4.5; 1% SDS, ראה שלב 1.3) לגלולת LPS, ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה עד שרק חלקיקים קטנים יישארו. Sonicate לresuspend הומוגנית גלולה LPS בפתרון עם sonicator בדיקה קצה במחזור החובה קבוע ל20 שניות בפלט 50%. חזור על sonication של 2x מדגם (20 שניות / פרצו, 5 שניות ~ בין פרצים).
  13. דגימות רתיחה באמבט מים במשך 30 דקות. זהירות: ודא כובעים הדוקים, אך לא אטום לחלוטין. אורגניזמים חלקם, כמו Vibrio cholerae (V. cholerae) דורשים פעמים יותר דגירה (1 שעות) כדי להגדיל את התשואה כוללת של א 'השומנים הסרת בקבוקים מאמבט מים ולאפשר מדגם להתקרר לRT לפני שימשיך.
  14. כדי לחלץ שומנים לאחר הידרוליזה, להמיר את פתרון SDS לשני שלבים בליי-דאייר (איור 2) תערובת על ידי הוספת 30 מיליליטר של כלורופורם ו30 מיליליטר של מתנול, לכלורופורם: מתנול: מים (2:2:1.8, v / V) תערובת. מערבבים על ידי היפוך וצנטריפוגות המדגם 10 דקות ב 2,000 x גרם. חלץ את השלב נמוך יותר לתוך צינור צנטריפוגות PTFE נקי באמצעות פיפטה מזכוכית.
  15. מבצע חילוץ שני על ידי הוספת 30 מיליליטר של שלב נמוך יותר מתערובת equilibrated מראש שני שלבים בליי-דאייר (שלב 1.2), לשלב העליון מצעד 1.14. מיקס, אז צנטריפוגות XG ב 2000 10 דקות. חלץ את השלב נמוך יותר, וברכה עם השלב נמוך יותר חולץ בשלב 1.14.
  16. שטוף את השלבים ונקווה התחתונים (60 מיליליטר בסך הכל) על ידי הוספת 114 מיליליטר של שני שלב equilibrated מראש עליון שלב בליי-דאייר (שלב 1.2) כדי ליצור תערובת של שני שלבים בליי-דאייר (כלורופורם: מתנול: מים; 02:02: 1.8, V / V). מערבבים. צנטריפוגה XG ב 2000 10 דקות.
  17. הסר את השלב נמוך יותר בבקבוק זכוכית נקייה סיבובי מאייד ומדגם יבש באמצעות אידוי סיבובי (איור 2).
  18. הוסף 5 מיליליטר של כלורופורם: מתנול (4:1, V / V) לבקבוק הסיבובי, ומרחץ sonicate (> 30 שניות) כדי לסייע בהשעיה של שומנים מצדדים של בקבוק. השתמש פיפטה העברת זכוכית להעברת שומנים בדם לנקישפופרת זכוכית (13 x 100 מ"מ או גדול יותר) כתרים עם PTFE לאורך פקקי הברגה פנוליות. מדגם יבש מתחת לזרם של חנקן באמצעות מייבש חנקן.
  19. Resuspend שומנים בדם יבש ב 1 מיליליטר של כלורופורם: מתנול (4:1, V / V). העברה לבקבוקון קטן מדגם זכוכית (12 x 32 מ"מ) עם בסיס מחודד לresuspension כמותית יותר באמצעות נפחים קטנים (ראה טבלה של ציוד / ריאגנטים). לייבש באמצעות מייבש חנקן.
  20. מדגם מיובש ניתן לאחסן ב-20 ° C עד TLC שלאחר מכן (פרוטוקול 2) או MS ניתוח (פרוטוקול 3, 4 או 5). (שים לב: הסכום של מבודד חומר ושימוש בפרוטוקולים הבאים הוא הציע מבוסס על מה שזה מספיק עבור רוב האורגניזמים אותו מדגם השומנים ניתן להשתמש בפרוטוקולי 2-5, בשים לב לחומר% הוסר ראה דיון לפרטים נוספים...).

2. ויזואליזציה של יפידים מינים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה

  1. הכן את מערכת השלב הנייד TLC הממס (כלורופורם: פירידין: 88% חומצה פורמית: מים; 50:50:16:5 V / V). Combin200 מיליליטר דואר של כלורופורם, 200 מיליליטר של פירידין, 64 מיליליטר של 88% חומצה פורמית, ו20 מים מיליליטר בבקבוק 1 ליטר ממס. בקבוק כובע, מערבב על ידי מספר רב של פעמים היפוך, ולפרוק.
  2. השתמש טנק TLC כי תהיה להתאים 20 x 20 צלחות סנטימטר. טנק TLC קו עם ~ נייר כרומטוגרפיה 40 סנטימטר.
  3. לטנק TLC להוסיף 200 מיליליטר של כלורופורם: פירידין: 88% חומצה פורמית: מים (50:50:16:5, V / V) תערובת. לאפשר טנק מראש לאזן במשך> 3 שעות, לעתים קרובות O / N הוא מועדף ונוח יותר.
  4. הסר דגימות שומנים בדם יבשות ממקפיא (שלב 1.20) ולתת חם RT.
  5. עם סכין להסיר את סיליקה מהקצה העליון של צלחת TLC סיליקה ג'ל 60. באמצעות עיפרון משעמם, לצייר קו במקביל לתחתית הצלחת, 2 סנטימטר מהחלק התחתון. קו זה הוא המקור לאיתור דגימות. מארק במרווחים לאורך קו התייחסות זו כדי לזהות דוגמאות לגזרים 1 סנטימטר.
  6. ממיסים שומנים בדם יבשים משלב 2.4 ב200 μl של כלורופורם: מתנול (4:1, V / V), מערבולת וsonicate (3x, ~ שניות 15 כל אחד), תשואות ~ 100 -500 ng / שומנים μl אם מופק E. coli.
  7. באמצעות pipet זכוכית microcapillary, במקום עשירית מהנפח (20 μl) על גבי צלחת TLC, כפי שמסומן בשלב 2.5. לאפשר דגימות אוויר יבש על צלחת TLC ל~ 15 דקות. (שים לב: דוגמאות בצלוחיות זכוכית קטנה יכולות להיות יבשות באמצעות מייבש חנקן ומאוחסנות ב -20 מעלות צלזיוס לשימוש לאחר מכן בפרוטוקולים 3-5 שימו לב לחומרי% הוסרו.).
  8. מניחים צלחת TLC מכילה דגימות הבחינו לתוך טנק equilibrated מראש. ברגע שמול ממס מגיע העליון של צלחת TLC (~ שעה 2.5-3), להסיר את הצלחת ואוויר יבש (> 60 דקות). אקדח אוויר קר יכול לשמש כדי להבטיח יובש מוחלט.
  9. בעוד צלחת מתייבשת, להדליק פלטה ב250 מעלות צלזיוס במשך חריכה.
  10. במנדף הכימי מאוורר, להכין 10% תערובת חומצה גופרתית אתנול לחריכת שומנים נפתרו על צלחת TLC סיליקה (חומצה גופרתית מרוכזת: 100% אתנול; 01:09 V / V). מדוד 10 מיליליטר של חומצה גופרתית ולהוסיף לאט ל90 מיליליטר של 100% אתנול. זהירותלערבב באופן מלא ולהעביר למרסס מגיב chromatographic זכוכית.
  11. במנדף, השתמש מרסס מגיב chromatographic זכוכית לרסס את צלחת TLC המיובש עם 10% תערובת חומצה גופרתית אתנול. ריסוס תערובת באופן שווה על פני הצלחת.
  12. מניחים את צלחת TLC על הצלחת החמה 250 מעלות צלזיוס עד לדגימות שומנים חרוכות מופיעות ככתמים שחורים / חום (<1 דקות). לא לחשוף יותר מדי את הצלחת, כמו זה יגרום לכל הצלחת להשחים ולעשות הדמיה של מיני שומנים קשים.

3. אפיון מבני ליפידים באמצעות MALDI-TOF המוני ספקטרומטריית

  1. מצעד 1.20, (או צעד 2.7) להסיר שומנים מדגם ממקפיא ולתת חם RT. Resuspend שומנים בדם יבש מדגם ב~ 20 כלורופורם μl: מתנול (4:1, V / V) ומערבולת להשיג ~ 1-5 מיקרוגרם / μl שומנים פתרון אם מופק E. coli. (הערה: 10% פחות מרוכז, אם חומר המשמש מצעד 2.7).
  2. הכן את רכיבי מטריצת ATT. רווי 6 עזה-2-thiothymine באצטוניטריל 50%: להוסיף 500 μl מים ו500 μl של אצטוניטריל לצינור microcentrifuge 1.5 מיליליטר, ולאחר מכן להוסיף> 10 מ"ג 6 אזה-2-thiothymine כך שאצטוניטריל 50% הוא סופר רווי. פתרון רווי tribasic ציטרט אמוניום: הוסף> 1 מ"ג ל500 מים μl, לזרז צריך להיות ברור ממבט ראשון. פתרונות וורטקס ו צנטריפוגות לפני השימוש; משמש רק supernatant הרווי.
  3. הכן תערובת מטריצת ATT: ציטראט-thiothymine 6 אזה-2 רווי באצטוניטריל 50%, רווי tribasic אמוניום (20:01, V / V). מערבבים את מרכיבי מטריצה ​​יחד על ידי הוספת 20 μl של פתרון ATT ל1 μl רווי פתרון ציטראט אמוניום tribasic ב500 צינור microcentrifuge μl, מערבולת לערבב, ו צנטריפוגות לפני היישום לצלחת MALDI.
  4. הכן צלחת MALDI על ידי הוספת תערובת calibrant 0.5 μl לצלחת MALDI במקום בי הדגימות תופקדנה, על מנת לספק את נחישות יחס מסה / מטען מדויק ביותר.
  5. להפקיד 0.5 μlשל מטריצת ATT לצלחת MALDI בכל מקום שבו שומנים מדגם יופקד.
  6. הפקדה 0.5 μl של מדגם (2.5% מכלל מדגם) על המקום של מטריקס ATT, לערבב בצלחת, ורכישת ספקטרום על ידי מדגם סריקה עבור אותות יון אופטימליים (איור 3). הערה: סכומים עבור MS האות האופטימלית ביותר יכולים להשתנות עם האורגניזם וצריכים להיקבע באופן אמפירי. כדי להוסיף עוד חומר אחד יכול לזהות 0.5 μl מספר פעמים ומאפשרות תערובת הבחינה להתייבש בין תוספת של יותר מדגם. לדוגמא גם יכולה להיות מרוכזת (יבשה וresuspend בנפח קטן יותר) או מדוללת במידת צורך. גם חומר יותר התחלה (נפח של החל תרבית תאים) יכול לשמש (ראה דיון).

4. Electrospray יינון ספקטרומטריית מסה וההתנגשות המושרה דיסוציאציה ליפידים

  1. הכן כלורופורם: תערובת ממס מתנול (1:1, V / V) על ידי ערבוב מניית 200 μl של מתנול HPLC כיתה עם 200 כלורופורם HPLC כיתה מיליליטר בסול זכוכיתלפרוק את הבקבוק.
  2. העבר 200 μl של כלורופורם: תערובת ממס מתנול לבקבוקון עם שומנים בדם (למשל מצעד 1.20, 2.7, או מיובש לאחר פרוטוקול 3) וsonicate השומנים פתרון במשך 5 דקות או עד שכל החומר מומס.
  3. הגדר את ספקטרומטר המסה ליינון electrospray המצב שלילי.
  4. באמצעות מזרק 250 μl ומשאבת מזרק, באופן ישיר להחדיר את השומנים בדם המדולל מדגם בקצב זרימה של 2.0-3.5 μl / min.
  5. לייעל ולשפר את השומנים אות יון על ידי כוונון אופטיקה יון. ספקטרום המוני מלא עכשיו ניתן לאסוף ממיני שומנים בדם (איור 4).
  6. לבודד ולהפעיל את השומנים היעד על ידי בחירת CID כשיטת MS / MS.
  7. להגביר את מתח CID (או האנרגיה מנורמלת התנגשות, NCE) עד השומנים המבשר מינים הוא% על 10 שפע יחסי בהשוואה ליון המוצר הגבוה ביותר.
  8. לרכוש וספקטרה הממוצעת עד מספיק אות לרעש מושגת עבור היוני מוצר אלקטרוני. מספר הסריקות הדרושות תלוי בעוצמת האות של המבשר המקורי ויכול לנוע 3-300 סריקות (איור 5 א).

5. MS / MS על יפידים ידי אולטרה סגול Photodissociation

  1. הכן את המדגם וספקטרומטר מסה כמו בשלבים 4.1-4.5.
  2. הפעל את לייזר ממשק לספקטרומטר המסה. ספקטרומטר המסה היה לבוש עם לייזר אקסימר 193 ננומטר והותאם כדי לאפשר הפעלת UV בתא HCD של המכשיר. Photodissociation יושם באופן דומה לזה שתואר בעבר 35. אנו משתמשים בסעפת ואקום שונה עם חלון אופטי CAF 2 לשדר פוטונים לניתוק C-מלכודת גבוהה יותר אנרגיית תא (HCD). הלייזר מופעל בMS / MS על ידי היגיון טרנזיסטור טרנזיסטור (TTL) אות מספקטרומטר המסה לגנרטור דופק / עיכוב.
  3. להגדיר את התוכנה במכשיר, כך שהליזר יפעיל את לייזר אקסימר כשיונים להיכנס לתא HCD. זה דורש שינוי צנוע של התוכנה.
  4. הפעל את מחולל הפעימות כך שהליזר הוא פעמו כל 2 אלפית שני (500 הרץ).
  5. לבודד את השומנים יון מבשר על ידי בחירת HCD כשיטת MS / MS ולהתאים את אנרגיית collisional לNCE 1%. זה מאפשר הבידוד של יונים מבשר על ניתוק סגול בתוך תא HCD. למרות שנעשה שימוש בתא HCD, התוכנה המותאמת לביצוע UVPD בפרק זמן זה.
  6. הפעל את השומנים המבודדים יון על ידי הגדלת אנרגיית הלייזר והתאמת מספר פעימות לייזר. ניסוי UVPD טיפוסי יבוצע באמצעות עשרה פולסים 6 מיליליטר.
  7. כמו בשלב 4.8, לרכוש וספקטרה הממוצעת עד רעש אות למספיק מושגת עבור יוני מוצר UVPD. מספר הסריקות הדרושות תלוי בעוצמת האות של המבשר המקורי ויכול לנוע 3-300 סריקות (איור 5).

6. 32 P-תיוגליפידים ובידוד לאחר

  1. לחסן 5 מיליליטר של תקשורת (מרק לוריא או כל מדיה אחרת) ממושבה אחת. לגדול O / N ב 37 ° C או בטמפרטורה הנדרשת.
  2. למחרת, למדוד את קוטר חיצוני 600 ולהשתמש בתרבות O / N לחסן 7 מיליליטר של התרבות לOD מתחיל 600 של ~ 0.05, גדל בצינור תרבות סטנדרטי 20 x 150 מ"מ זכוכית חד פעמית. הוסף 2.5 μCi / מיליליטר של אורגני 32 פ לגדל תאים עד OD 600 של 0.8-1.0 הוא הגיע. אנא עקוב פדרלית, מדינה, ו / או הנחיות מוסדיות לטיפול הבטוח ונכון של חומרים רדיואקטיביים.
  3. קציר תאים ב16 x 125 צינורות צנטריפוגה מ"מ זכוכית עם PTFE מרופד כובע באמצעות צנטריפוגות קלינית זווית קבועה ב1,500 XG 10 דקות. הסר supernatant לתוך מיכל פסולת רדיואקטיבית מתאים. כל פסולת רדיואקטיבית (למשל נוזל, זכוכית, Biohazard) שנוצרה בשלבים הבאים צריכה להיות מסולק על פי פדרלי, מדינה, ו / או gui המוסדיdelines.
  4. לשטוף תא גלולה עם 5 מיליליטר של בופר פוספט 1x (PBS). צנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1,500 x גרם. בטל supernatant.
  5. תאי resuspend ב 5 מיליליטר של שלב אחד תערובת בליי-דאייר (איור 2) בהיקף של כלורופורם: מתנול: מים (1:2:0.8, V / V). מערבולת לערבב, ולדגור על RT ל> 20 דקות כדי להבטיח תמוגה תא שלמה.
  6. צנטריפוגה בצנטריפוגה קלינית ב1,500 XG עבור 20 דקות. בעדינות יוצק את supernatant, המכיל פוספוליפידים ושומני isoprenyl.
  7. Resuspend את כדור LPS ב1.8 מיליליטר של 50 נתרן אצטט מ"מ, pH 4.5; 1% SDS חיץ ידי vortexing. Sonicate מדגם באמצעות sonicator אמבטיה עד גלולה היא מפוזרת באופן שווה (~ 30 שניות).
  8. דגירה מדגם עבור 30 דקות באמבט מים רותחים. ודאו כובעים בטוחים הם הדוקים אך לא אטום.
  9. הסר מאמבט מים ולאפשר מדגם להתקרר על RT במשך 5-10 דק '.
  10. להמיר את הפתרון לתוך תערובת בליי-דאייר שני שלבים על ידי הוספת 2 מיליליטר של כלורופורם ו -2 מיליליטר שלמתנול, מניב כלורופורם: מתנול: תערובת מימית (2:2:1.8 V / V). מערבולת לערבב, ו צנטריפוגות במשך 10 דקות בצנטריפוגה הקלינית ב1,500 XG לשלבים נפרדים.
  11. חלץ את השלב נמוך יותר לתוך צינור צנטריפוגות הזכוכית נקי באמצעות פיפטה זכוכית (חילוץ הראשון).
  12. מבצע חילוץ שני על המדגם על ידי הוספת 2 מיליליטר של שלב בליי-דאייר שני שלבים equilibrated מראש נמוך יותר (שהוכן כמו בשלב 1.2) לשלב העליון שנותר משלב 11. וורטקס ו צנטריפוגות 10 דקות. הסר שלב נמוך יותר ולשלב עם השלב נמוך יותר ממיצוי הראשון.
  13. בשלב נמוך יותר ונקווה (~ 4 מיליליטר הנפח כולל), להוסיף 7.6 מיליליטר של equilibrated מראש עליון שלב (שלב 1.2), מניב פתרון שני שלבים בליי-דאייר (כלורופורם: מתנול: מים; 2:2:1.8, v / V). וורטקס ו צנטריפוגות במשך 10 דקות.
  14. הסר את השלב נמוך יותר לשפופרת זכוכית נקייה ויבש באמצעות מייבש חנקן. ניתן לאחסן דגימות יבשות ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

7. Visualiלאספקה ​​של 32 P-שכותרת יפידים מינים באמצעות כרומטוגרפיה בשכבה דקה

  1. הכן 32 שומנים P-שכותרת מדגם, טנק TLC, וצלחות TLC כפי שמתואר ב2.1-2.8 צעדים.
  2. ממיסים 32 מדגם P-שכותרת ב500 μl של 04:01 כלורופורם מתנול (V / V). sonicate ורטקס והאמבטיה כדי להתמוסס לחלוטין בחומרי שומנים בדם. הוסף 5 μl של מדגם לבקבוקון נצנץ המכיל 5 מיליליטר של קוקטייל נצנץ. רוזן במונה נצנץ ולחשב ספירות / דקות כוללת של מדגם.
  3. כאשר חזותי מיני שומנים radiolabeled, יכול לשמש 10 x 20 סנטימטר או 20 x 20 צלחות TLC סנטימטר. לצלחות סנטימטר 10x20, צריכים להיות הבחינו דגימות לאורך המוצא המסומן בשלב 2.5 כך שהממד הארוך ביותר של הצלחת הוא אנכי (כלומר דגימות הבחינו במוצא מסומן 2 סנטימטר מעל קצה 10 סנטימטר).
  4. בעזרת פיפטה microcapillary, במקום 10,000-20,000 עותקים לדקה / מדגם על צלחת ולאפשר כתמים להתייבש (> 15 דקות). דוגמאות אולי צריכה להיות מרוכזות על ידי ייבוש תחתחנקן וresuspended בנפח מתאים, כדי להשיג 10,000-20,000 ספירות / דקות / נקודה (2 μl או 2 μl בכל פעם ל< סך μl 10).
  5. מניחים צלחת TLC מכיל דגימות radiolabeled לתוך טנק equilibrated מראש. ברגע שמול ממס מגיע העליון של צלחת TLC (~ 3 שעות), להסיר את הצלחת ואוויר יבש (> 60 דקות). זהירות: צלחות TLC לרוץ בנוכחות פירידין חייבת להיות יבשות לחלוטין במנדף הכימי, כפי שכמויות זעירות של פירידין יכולות לגרום נזק למסכי phosphorimaging. אקדח אוויר קר יכול לשמש כדי להבטיח יובש מוחלט.
  6. עטוף את הצלחת בניילון הנצמד ולחשוף למסך Phosphorimager בO / נ קלטת autoradiography למחרת בבוקר, לסרוק את המסך כדי לקבל התמונה (איור 6). שימוש בתוכנה לניתוח צפיפות תמונה, שיטה זו מאפשרת לכימות מדויק, יחסית של מיני שומנים בדם.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

שומנים הקנוני של א ' Typhimurium serovar enterica coli וסלמונלה הוא דו סוכר-acylated שש של גלוקוזאמין עם קבוצות פוספט ב1 - ו 4 '-עמדות. במהלך צמיחה במדיה עשירה (לדוגמא, מרק לוריא) חלק מהשומנים מכיל קבוצת pyrophosphate ב1-עמדת מניב מיני טריס-פוספורילציה 36 (איור 1). Kdo (3-deoxy-D-manno-octulosonic חומצה), מצורף ב6'-הידרוקסיל ומשמש כגשר לקשר שומנים לתחומים שנותרו פחמימות (כלומר oligosaccharide ליבה ותחומים O-אנטיגן) של LPS. למרות שחיידקים גראם שלילי לשתף מסלול שימור לשומני יוסינתזה דומה לזה של א ' coli K-12, יש כמות גדולה של גיוון במבני שומנים בדם. גיוון זה נובע מהפעולה של אנזימים חבויים המשנים את מבנה השומנים בדם, אשר מופעל בתגובה לגירויים סביבתיים. לexample, בס enterica קבוצות פוספט של שומנים בדם יכולות להיות שונה עם סוכר קטיוני L-4-aminoarabinose (איור 1; כחול) או עם שאריות phosphoethanolamine (איור 1; מגנטה). בסלמונלה שינויים אלה מוסדרים על ידי מערכות רגולטור תגובת שני מרכיבים, הוסיף בתגובה לנמוך [Mg 2 +], pH המתון-חומצי, ואת הנוכחות של פפטידים מיקרוביאלית קטיוני. בנוסף בסלמונלה, palmitate ניתן להוסיף לטופס שומנים-acylated hepta, אשר מקדמת התנגדות לפפטידים מיקרוביאלית קטיוני (איור 1; ירוק) 8. שינויים נוספים כוללים, אך אינם מוגבלים, להסרה של קבוצות פוספט ורשתות acyl, או dioxygenase זרז תוספת של קבוצת הידרוקסיל לשרשרת acyl המשנית צמוד 3'נצפתה במספר אורגניזמים 1,3.

בידוד של שומנים בדם ללא פגע מכל תאים על ידי השינוי של השיטה של ​​קארוff וRaetz מתואר בפרוטוקול 1 (איור 2). שיטת בידוד זה נעשתה שימוש כדי להעריך ש10 6 מולקולות של שומנים בדם קיימות לתא חיידק של א ' coli 37. הפרוטוקולים הבאים 1 ו -3, הספקטרום השלילי יון MALDI-TOF ההמוני של שומנים מE. coli K-12 (W3110) מניב יון deprotonated ביחידים ([MH] -) בשעה מ '/ z 1,796.20 כמינים שנצפו majorly (איור 3). MALDI-TOF MS בוצע במצב השלילי reflectron כדי לשפר את הרזולוציה ספקטרלית. לחלופין, המדגם זהה השומנים נתון למצב שלילי ננו 'חדשות ארכיאולוגיות (4 לפרוטוקול) מניב יוני שומנים ברובה deprotonated כפליים במ' / z 898.1 כונה על ידי [M-2H] - 2 (איור 4). יוני השומנים deprotonated ביחידים [MH] - במ '/ z 1,796.20 ניתנים לצפייה, אבל הם של שפע יחסי נמוך ל[ M-2H] 2 - יונים (איור 4). מינים טעונים כפל predomiנייט בעת שימוש ESI. פיצול על ידי בולשת בריטית (איור 5 א) או UVPD ננומטר 193 (איור 5) בוצע על [MH] - השומנים מ '/ z יון 1,796.20. טכניקות אלה יכולים לשמש כדי להקצות יותר טובים מבנים כימיים, במיוחד של מיני שומנים המכילים שילובים מורכבים של שינויים, או שינויים כימיים uncharacterized בעבר. פרופילי פיצול מוצגים עם קווים מקווקוים מייצגים אתרי מחשוף והם מתאימים עם ערכי m / z מתחת לכל מבנה ובלבד (איור 5). הערכים מ '/ z ואתרי מחשוף מודגשים בגופן אדום מייצגים יוני מוצר ייחודיים הקשורים UVPD.

כפי שתואר בפרוטוקולים 6 ו -7, 32 שומנים שכותרת P מבודדים משני E. שונה זני coli K-12 נותחו על ידי TLC (איור 6). W3110 מכיל שומנים phosphorylated טריס-BIS-ובעיקר (איור 6; נתיב שמאלי), ואילו דפוס TLC מורכב יותר היא נצפתה עם 32 P-שומנים מבודדים מE. זן חיידק WD101 (איור 6; נתיב ימני) 38. WD101 מייצר שומנים שונה במידה רבה עם aminoarabinose (L-Ara4N) וphosphoethanolamine (PETN). מאז הן 1 - ו 4 '- פוספטים זמינים לשינוי, שומנים מWD101 ניתן לתאר ביחידות שונה, המכיל L-Ara4N רק אחד או PETN בבית או פוספט, או כפליים שונה שבו שני פוספטים הם שונה בצורה קומבינטורית. בנוסף לשינוי ב1 - ו 4 '- פוספטים, בנוסף palmitate הוא ציין גם (ראה איור 1) ומגדילים את ערך R f של מיני שומנים במערכת ממס זה (איור 6). אם תרצה, ניתוח צפיפות באמצעות Phosphorimager, יכול לשמש כדי quantifiably כמויות יחסי אומדן מיני שומנים בתוך המדגם זהה.

o: לשמור-together.within-page = "תמיד"> איור 1
איור 1. שומנים נציג מבנים מושלם מא coli K-12 וס Typhimurium serovar enterica. עשיית שינויים במבנה השומנים בדם נשמרים מוצגות (מימין), כפי שמתואר בנציג תוצאות. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 2
איור 2. סכמטי של שומנים הליך. מתאר בידוד מתאר תמוגה הכימית של תא גלולה חיידקים באמצעות שלב אחד התערובת בליי-דאייר, צנטריפוגה של lysate כדי גלולה LPS, מתון הידרוליזה CID לשחרור שומנים מפוליסכריד המצורף, וטיהור סופית של שומנים בדם באמצעות שני שלב החילוץ בליי-דאייר. לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 3
איור 3. ניתוח MALDI-MS של שומנים בדם מבודד מE. coli K-12. ספקטרה שהושגה (W3110) מהממוצע של> 300 יריות. הואשם ביחידים [MH] - שומנים בדם הוא ציין כיון המולקולרי במ '/ z 1,796.2, אשר תואם את מיני deprotonated של המבנה מופיעים בצד ימין.

0623/50623fig4.jpg "/>
איור 4. ניתוח ESI-MS של שומנים בדם מבודד מE. coli K-12 (W3110) ביחידות [MH] וכפליים טעון [M-2H] - 2. מיני שומנים הם נצפו כיונים מולקולריים של m / z 1,796.2 וm / z 898.1, בהתאמה.

איור 5
איור 5. ניתוח MS / MS של שומנים בדם מבודד מE. coli K-12 (W3110) דיסוציאציה (א) או photodissociation אולטרה סגול (ב ') התנגשות מושרה. שימשו לפצל 1,796.2 מ' / z יון המבשר. יוני מוצר UVPD ספציפיים מסומנים באדום. מפת פיצול מסופקת (C), שבו שחור קווים מקווקווים מצביעים על הפיצול קשור עם שני CID וUVPD, ואדום קווים מקווקווים מצביעים SPE UVPDפיצול cific. ערכים המופיעים מתחת למפת הפיצול מתאימות להמונים מדויקים של [MH] -. יוני מוצר לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.

איור 6
איור 6. הפרדה מבוססת TLC של מיני שומנים מבודדים מE. coli K-12 32 שומנים P-שהכותרת היה מבודד מW3110 (נתיב שמאלי) או WD101 (נתיב ימני) ונפרדו במערכת ממס טנק TLC מכילה כלורופורם:. פירידין: 88% חומצה פורמית: מים (50:50:16 : 5 V / V).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בפרוטוקול זה יש לנו מפורט הבידוד של מיני שומנים מהתאים של חיידקים כולה, ותיארו את TLC או שיטות אנליטיות המבוססות MS לאפיין חומר מבודד זה מבחינה כימית. ספקטרומטריית מסת טנדם היא אסטרטגיה רבת עוצמה לאפיון מבני דה נובו של תרכובות ביולוגיות, ולא יסולא בפז לאפיון הכימי של שריון של מולקולות שומנים שנצפו בטבע. CID וUVPD שתי שיטות הפעלה משלימות שיוצרות סוגים שונים של יוני מוצר המספקים את טביעות האצבעות מפתח עבור מולקולות שומנים בדם. פיצול MS / MS באמצעות שני CID וUVPD מאפשר הבהרה של הבדלים דקים של מבני שומנים בדם, מתן פירוט מדויק יותר למשימות מבנה כימי. נתונים מסוג זה נחוצים כדי לבסס קשרי מבנה לתאם / פונקציה מדויקות בביולוגיה של שומנים מינים מולקולריים. יש לנו גם תיארתי את ההליך ל32 מיני שומנים radiolabeling-P ביםתרבויות קניון בקנה מידה בקטריאלי, שבו התבנית הכימית של 32 מינים P-שומנים ניתן דמיינו באמצעות TLC וautoradiography.

ישנן מספר תכונות לפרוטוקול זה שכל משתמש צריך להיות מודע. להכנות שומנים בקנה מידה גדולה (פרוטוקול 1), שיעור מתחיל ממס לסכום של גלולה חיידקים יכול להיות מותאם כדי לשפר את התשואה כוללת. עם זאת שיעור זה ניתן לקבוע רק באופן אמפירי. הסכומים שתוארו בפרוטוקול זה מייצגים נקודת התחלה טובה עבור רוב זני חיידקים. כרכי תרבות להפקת שומנים ובידוד גם יכולים להיות מותאמים בהתאם לזן החיידקים שאתה עובד איתו. למשל, V. cholerae דורש לפחות 200 מיליליטר של תרבות על מנת לקבל ספקטרום המוני באיכות גבוהה, עם זאת, תרבות הנפח לE. coli וניתן לשנותם עד 5 מיליליטר. יותר חומר המוצא (כרכי תרבות גדולים יותר) נדרש לחלק מחיידקים בגלל hydrolysהוא צעד שמשחרר שומנים מכל LPS הוא פחות יעיל. לדוגמא אורגניזמים המכילים dioxygenase Kdo תפקודי או תערוכת קינאז Kdo ירידת תשואות שומנים בדם לאחר הידרוליזה מתונה חומצת 39. לעתים קרובות, מוטציות עם מבנים שינו LPS / שומנים בדם או מיני חיידקים מסוימים הן לעתים קרובות קשות לגלולה במהלך מסיק תא. לזנים אלה, אורכו של צנטריפוגה ניתן להאריך כדי להגדיל את התשואה. כן, יש לציין, לאחר תמוגה תא בשלב יחיד תערובת בליי-דאייר וLPS הוא pelleted (ראה שלב 1.9), ייתכן שיידרשו צעדים לשטוף נוספים כדי להפחית את זיהום פוספוליפידים. כאשר מבודדים את השומנים מE. coli או סלמונלה, נדרש רק אחד לשטוף. עם זאת, אם מבודד את שומנים מאורגניזמים אחרים (למשל V. cholerae או הליקובקטר פילורי), צעדים לשטוף נוספים נדרשים.

לאחר הידרוליזה חומצה קלה בSDS, התשואה של שומנים מינים עם הידרופוביות מופחתת (פו כלומר יותרקבוצות sphate> 2 או שרשרות acyl פחות <5) ניתן לשפר על ידי שימוש במיצוי בליי-דאייר חומצי. לכרכים השתמשו בסעיף 1 הפרוטוקול, להוסיף 225 μl של HCl המרוכז לפתרון SDS המכיל שומנים הידרוליזה ואחריו 30 מיליליטר של כלורופורם ו30 מיליליטר של מתנול לתערובת בליי-דאייר שני שלב של כלורופורם: מתנול: 0.1 M HCl (2:2:1.8, V / V). לכרכי שימוש בסעיף 6 לפרוטוקול להוסיף 15 μl של HCl המרוכז לפתרון SDS המכיל שומנים הידרוליזה ואחריו 2 מיליליטר של כלורופורם ו -2 מיליליטר של מתנול מניב כלורופורם: מתנול: 0.1 M HCl (2:2:1.8, v / V) תערובת. לאחר חילוץ בליי-דאייר חומצי, פירידין ניתן להוסיף לשלבים הנמוכים נקוו לנטרל את החומצה (1 טיפה של פירידין / 2 מיליליטר של נפח דגימה סופי). צעד נוסף זה צריך להתבצע לפני ייבוש המדגם, במנדף הכימי. היזהר שלא להשתמש פירידין העודף, מה שעלול להוביל להסרת של חומצות שומן הצמוד לאסתר. בנוסף, אם samp השומנים בדםle קשה לייבוש תחת חנקן, להוסיף כמה מיליליטר של כלורופורם: מתנול (4:1, V / V) לבקבוק ולהמשיך לייבש את הדגימה עד לסיום.

ההטרוגניות הכימית המורכבת של מיני שומנים שנצפו בכמה אורגניזמים (למשל V. cholerae, Yersinia pseudotuberculosis) יכולה לפעמים לעשות ניתוח מבוסס MS-TLC או קשה. כרומטוגרפיה בעמודה יכולה להיות מועסק במעלה הזרם של שיטות אנליטיות אלה מראש fractionate מיני שומנים מבודדים לתערובות פשוטות יותר. אניוני עם diethylaminoethyl (DEAE)-תאית הוא נפוץ ביותר 40. כשומני קו מנחה כללי שונה בבית או עמדת פוספט, עם קבוצות שאינן חומציים כגון aminoarabinose או phosphoethanolamine, elutes לפני מיני שומנים ללא שינוי 40. השומנים phosphorylated-טריס כמו elutes גם אחרי מיני bisphosphorylated ללא שינוי 36,40. כרומטוגרפיה שלב הפוכה יכולה לשמש לfractionate שומנים מצלצליםים של דרגות שונות של הידרופוביות 41. כרומטוגרפיה עמודה שימושית גם בהסרה של SDS הנותרת לאחר הידרוליזה חומצה קלה ושומנים בדם בליי-דייר שלאחר מכן צעדי חילוץ. רמות גבוהה של SDS שיורית יכולה לתרום כדי לאותת דיכוי בספקטרום מתקבל על ידי פרוטוקולי ESI-MS הרגישים שלנו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי המענקים וAI064184 AI76322 מן המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) ועל ידי גרנט 61,789-MA-MUR ממשרד המחקר של הצבא למחקר MST גם נתמכה על ידי הקרן וולש גרנט F1155 ומענק NIH R01GM103655 לJSB

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Trent, M. S., Stead, C. M., Tran, A. X., Hankins, J. V. Diversity of endotoxin and its impact on pathogenesis. Journal of endotoxin research. 12, 205-223 (2006).
  2. Raetz, C. R., Whitfield, C. Lipopolysaccharide endotoxins. Annu Rev. Biochem. 71, 635-700 (2002).
  3. Raetz, C. R., Reynolds, C. M., Trent, M. S., Bishop, R. E. Lipid A Modification Systems in Gram-Negative Bacteria. Annu. Rev. Biochem. 76, 295-329 (2007).
  4. Kim, H. M., et al. Crystal structure of the TLR4-MD-2 complex with bound endotoxin antagonist Eritoran. Cell. 130, 906-917 (2007).
  5. Rietschel, E. T., et al. Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to activity and function. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 8, 217-225 (1994).
  6. Medzhitov, R., Janeway, C. Innate immunity. The New England journal of medicine. 343, 338-344 (2000).
  7. Dinarello, C. A. Interleukin-1 and interleukin-1 antagonism. Blood. 77, 1627-1652 (1991).
  8. Guo, L., et al. Lipid A acylation and bacterial resistance against vertebrate antimicrobial peptides. Cell. 95, 189-198 (1998).
  9. Yi, E. C., Hackett, M. Rapid isolation method for lipopolysaccharide and lipid A from gram-negative bacteria. The Analyst. 125, 651-656 (2000).
  10. Westphal, O. aJ., K, Bacterial Lipopolysaccharide. Extraction with phenol-water and further application of the procedure. Methods Carbohydr. Chem. 5, 83-91 (1965).
  11. Galanos, C., Luderitz, O., Westphal, O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. European journal of biochemistry / FEBS. 9, 245-249 (1969).
  12. Raetz, C. R., Purcell, S., Meyer, M. V., Qureshi, N., Takayama, K. Isolation and characterization of eight lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octylosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 260, 16080-16088 (1985).
  13. Caroff, M., Deprun, C., Karibian, D., Szabo, L. Analysis of unmodified endotoxin preparations by 252Cf plasma desorption mass spectrometry. Determination of molecular masses of the constituent native lipopolysaccharides. The Journal of biological chemistry. 266, 18543-18549 (1991).
  14. Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian journal of biochemistry and physiology. 37, 911-917 (1959).
  15. Zhou, Z., Ribeiro, A. A., Raetz, C. R. High-resolution NMR spectroscopy of lipid A molecules containing 4-amino-4-deoxy-L-arabinose and phosphoethanolamine substituents. Different attachment sites on lipid A molecules from NH4VO3-treated Escherichia coli versus kdsA mutants of Salmonella typhimurium. The Journal of biological chemistry. 275, 13542-13551 (2000).
  16. Wang, X., et al. Structure and biosynthesis of free lipid A molecules that replace lipopolysaccharide in Francisella tularensis subsp. novicida. Biochemistry. 45, 14427-14440 (2006).
  17. Strain, S. M., et al. Location of polar substituents and fatty acyl chains on lipid A precursors from a 3-deoxy-D-manno-octulosonic acid-deficient mutant of Salmonella typhimurium. Studies by 1H, 13C, and 31P nuclear magnetic resonance. The Journal of biological chemistry. 260, 16089-16098 (1985).
  18. Madsen, J. A., Cullen, T. W., Trent, M. S., Brodbelt, J. S. IR and UV Photodissociation as Analytical Tools for Characterizing Lipid A Structures. Analytical Chemistry (Washington, DC, United States. 83, 5107-5113 (2011).
  19. Banoub, J. H., El Aneed, A., Cohen, A. M., Joly, N. Structural investigation of bacterial lipopolysaccharides by mass spectrometry and tandem mass spectrometry. Mass Spectrom. Rev. 29, 606-650 (2010).
  20. Hankins, J. V., Trent, M. S. Secondary acylation of Vibrio cholerae lipopolysaccharide requires phosphorylation of Kdo. The Journal of biological chemistry. 284, 25804-25812 (2009).
  21. Hankins, J. V., et al. Elucidation of a novel Vibrio cholerae lipid A secondary hydroxy-acyltransferase and its role in innate immune recognition. Molecular Microbiology. 81, 1313-1329 (2011).
  22. Chan, S., Reinhold, V. N. Detailed structural characterization of lipid A: electrospray ionization coupled with tandem mass spectrometry. Anal. Biochem. 218, 63-73 (1994).
  23. Boue, S. M., Cole, R. B. Confirmation of the structure of lipid A from Enterobacter agglomerans by electrospray ionization tandem mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 35, 361-368 (2000).
  24. Kussak, A., Weintraub, A. Quadrupole ion-trap mass spectrometry to locate fatty acids on lipid A from Gram-negative bacteria. Anal. Biochem. 307, 131-137 (2002).
  25. El-Aneed, A., Banoub, J. Elucidation of the molecular structure of lipid A isolated from both a rough mutant and a wild strain of Aeromonas salmonicida lipopolysaccharides using electrospray ionization quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 1683-1695 (2005).
  26. Murphy, R. C., Raetz, C. R. H., Reynolds, C. M., Barkley, R. M. Mass spectrometry advances in lipidomica: collision-induced decomposition of Kdo2-lipid A. Prostaglandins Other Lipid Mediators. 77, 131-140 (2005).
  27. Lee, C. -S., Kim, Y. -G., Joo, H. -S., Kim, B. -G. Structural analysis of lipid A from Escherichia coli O157:H7:K- using thin-layer chromatography and ion-trap mass spectrometry. J. Mass Spectrom. 39, 514-525 (2004).
  28. Wang, Z., Li, J., Altman, E. Structural characterization of the lipid A region of Aeromonas salmonicida subsp. salmonicida lipopolysaccharide. Carbohydr. Res. 341, 2816-2825 (2006).
  29. Mikhail, I., Yildirim, H. H., Lindahl, E. C. H., Schweda, E. K. H. Structural characterization of lipid A from nontypeable and type f Haemophilus influenzae: variability of fatty acid substitution. Anal. Biochem. 340, 303-316 (2005).
  30. Madalinski, G., Fournier, F., Wind, F. -L., Afonso, C., Tabet, J. -C. Gram-negative bacterial lipid A analysis by negative electrospray ion trap mass spectrometry: Stepwise dissociations of deprotonated species under low energy CID conditions. Int. J. Mass Spectrom. 249, 77-92 (2006).
  31. Silipo, A., et al. Structural characterizations of lipids A by MS/MS of doubly charged ions on a hybrid linear ion trap/orbitrap mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 43, 478-484 (2008).
  32. Jones, J. W., Shaffer, S. A., Ernst, R. K., Goodlett, D. R., Turecek, F. Determination of pyrophosphorylated forms of lipid A in gram-negative bacteria using a multivaried mass spectrometric approach. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A. 105, 12742-12747 (2008).
  33. Jones, J. W., Cohen, ie, Turecek, F., Goodlett, D. R., Ernst, R. K. Comprehensive structure characterization of lipid A extracted from Yersinia pestis for determination of its phosphorylation configuration. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21, 785-799 (2010).
  34. Hankins, J. V., Madsen, J. A., Giles, D. K., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Amino acid addition to Vibrio cholerae LPS establishes a link between surface remodeling in gram-positive and gram-negative bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109, 8722-8727 (2012).
  35. Han, S. W., et al. Tyrosine sulfation in a Gram-negative bacterium. Nature. 3, 1153-1110 (2012).
  36. Touze, T., Tran, A. X., Hankins, J. V., Mengin-Lecreulx, D., Trent, M. S. Periplasmic phosphorylation of lipid A is linked to the synthesis of undecaprenyl phosphate. Mol. Microbiol. 67, 264-277 (2008).
  37. Galloway, S. M., Raetz, C. R. A mutant of Escherichia coli defective in the first step of endotoxin biosynthesis. The Journal of biological chemistry. 265-6394 (1990).
  38. Trent, M. S., et al. Accumulation of a polyisoprene-linked amino sugar in polymyxin-resistant Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structural characterization and transfer to lipid A in the periplasm. The Journal of biological chemistry. 276, 43132-43144 (2001).
  39. Chung, H. S., Raetz, C. R. Dioxygenases in Burkholderia ambifaria and Yersinia pestis that hydroxylate the outer Kdo unit of lipopolysaccharide. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 510-515 (2011).
  40. Zhou, Z., Lin, S., Cotter, R. J., Raetz, C. R. Lipid A modifications characteristic of Salmonella typhimurium are induced by NH4VO3 in Escherichia coli K12. Detection of 4-amino-4-deoxy-L-arabinose, phosphoethanolamine and palmitate. The Journal of biological chemistry. 274, 18503-18514 (1999).
  41. Raetz, C. R., et al. Kdo2-Lipid A of Escherichia coli, a defined endotoxin that activates macrophages via TLR-4. Journal of lipid research. 47, 1097-1111 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics