グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

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Summary

グラム陰性菌からのリポ多糖(LPS)のリピドAドメインの単離および特徴は、細胞表面の抗生物質耐性のベースのメ​​カニズム、細菌の生存やフィットネス、そしてどのように化学的に多様な脂質分子種が差ホスト自然免疫応答を調節への洞察を提供します。

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Henderson, J. C., O'Brien, J. P., Brodbelt, J. S., Trent, M. S. Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria. J. Vis. Exp. (79), e50623, doi:10.3791/50623 (2013).

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Abstract

リポ多糖(LPS)は、外膜二重層の外側リーフレット上に堆積されたグラム陰性菌の主要な細胞表面分子である。 LPSは、三つのドメインに細分することができる。遠位O-多糖、コアオリゴ糖、脂質および脂質からなるドメイン分子種および3 - デオキシ-D-マンノ - オクト-2 - ulosonic酸残基(のKdo)。リピドAドメインは、細菌細胞の生存に必須で唯一の成分である。その合成後、リピドAに化学的抗生物質化合物に対する耐性を促進するために、例えばpHまたは温度のような環境ストレスに応答して変更され、宿主自然免疫応答のメディエーターによる認識を回避する。以下のプロトコールは、グラム陰性細菌からのリピドAの小規模および大規模な単離を詳述する。単離された物質は、その後、化学的薄層クロマトグラフィー(TLC)または質量分析(MS)によって特徴付けられる。 fはマトリックス支援レーザー脱離/イオン化時間に加えて、光(MALDI-TOF)MSは、我々はまた、衝突誘起解離(CID)に結合されたエレクトロスプレーイオン化(ESI)および新たに採用紫外光解離(UVPD)の方法を用いて脂質の分子種を分析するため、タンデムMSプロトコルを記載している。我々のMSプロトコルは、一意又は新規な化学修飾を含むリピドA分子の特徴付けに最も重要な、化学構造の明確な決定を可能にする。また、TLCによる分析のために細菌細胞からの脂質Aの放射性同位体標識、およびその後の単離を記載する。 MSベースのプロトコルに対して、TLCは、より経済的で迅速な特徴付け方法を提供するが、明確に知られている化学構造の基準を使用することなく、化学構造脂質を割り当てるために使用することができない。過去20年間の脂質Aの単離および特徴は、抗生物質抵抗のメカニズムをグラム陰性細菌の生理学の理解を改善している多数の刺激的な発見につながっているインダクタンス、人間の自然免疫応答、および抗菌性化合物の開発には多くの新しいターゲットを提供してきました。

Introduction

リポ多糖(LPS)は、ほぼすべてのグラム陰性菌の主要外表面分子であり、3つの分子のドメインで構成されています。遠位O抗原多糖、コアオリゴ糖、および膜結合脂質ドメインの外葉の上に堆積外膜二重層1,2。脂質ドメインはリピドAは、温和な酸加水分解の際に1 LPSのクロロホルム可溶性部分として定義することができる3 -デオキシ-D-マンノ-オクト-2 - ulosonic(のKdo)残基および脂質分子種から構成され2。モデル生物大腸菌(E.coli)1,2で観察され、主要なリピドA種と一致して、標準的な脂質分子は、化学的にアシル化ヘキサ-およびビス -リン酸化されdiglucosamineバックボーンとして定義することができる。グラム陰性菌を通じて保存ナイン構成的に発現される遺伝子は、ドメイン( 1)1,2脂質の産生に関与している。ほとんどの細菌は、脂質3のさらなる化学修飾に参加系統発生の保存度が異なる遺伝子の追加セットを持っています。脱リン酸化、アシル鎖の除去、およびそのようなアミノ糖( 例えば、アミノアラビノース)及び/又はホスホエタノールアミンなどの化学部分の付加は、最も一般的に観察された活性( 図1)である。脂質修飾に関与する酵素の多くは、直接そのような二価の陽イオンのような環境シグナルによって活性化される、またはそれらの発現は二成分応答調節因子系3により調節される。

宿主自然免疫系による脂質A種の認識は、Toll様受容体4/myeloid分化因子2(TLR4/MD2)共受容体4により媒介される。 MD2および脂質のアシル鎖間、ならびにTLR4および脂質Aの1および4 'リン酸基間の疎水性力は、リップの強い会合を促進TLR4/MD2 4,5にID Aに。自然免疫応答の認識と下流刺激アシル化状態や脂質の負電荷の影響TLR4/MD2ベースの脂質を変化させる改変は、NF-κBおよびそのようなTNFαおよびIL1-β6,7などの炎症のメディエーターを活性化剤。リピドAの負の電荷をマスキング修飾はまた、細胞表面3,8のグラム陰性への結合から殺菌カチオン性抗菌性ペプチドを防止する。多くのリピドA修飾は、ヒト宿主の内部または生態的地位のように、特定の環境条件下で細菌の適応度を高めることが仮定される。この理由のために多くの修飾酵素は、抗菌性化合物の合理的開発における魅力的な標的である。リピドA構造の化学的多様性は、生物および/または環境、およびこれらの多様な構造の生物学的意味に対してリピドAの構造的特徴のtにおいて重要な努力をする彼は、グラム陰性菌の研究。

全細菌からのリピドA分子の単離は、最終的な精製手順9-11、続いて細菌細胞表面からのLPSの抽出、リピドAを遊離させる加水分解工程を伴う。最も頻繁に引用されたLPS抽出手順は、第ウェストファールとジャン10によって導入され、熱フェノール水抽出法である。抽出後、全体LPSは、化学的にリピドA( 図1)の遠位グルコサミン糖の6'-ヒドロキシルからのKdoを分離軽度酸加水分解に供される。多数の落とし穴は、高い危険性試薬の使用を含む熱水フェノール手順のために共抽出された核酸およびタンパク質を分解する必要性が存在し、数日間は、プロトコル10を完了するために必要とされる。

最初CaroffとRaetz 12,13によって開発されたように私たちの研究室では、脂質Aの抽出および単離を開発しました。熱フェノール水手順と比較して、ここに提示した方法は、より迅速かつ効率的で、そして5mlから複数リットルの培養容量の広い範囲を収容する。また、ホットフェノール水抽出とは異なり、我々の方法は、リピドA種の最適な回復を提供する、LPSのラフや滑らかなタイプで選択されません。我々のプロトコルでは、全細菌細胞の化学的溶解は、LPSを遠心分離によりペレット化することができる、クロロホルム、メタノールおよび水の混合物を用いて行われる。マイルド酸加水分解、溶媒抽出(ブライ - ダイアー)の組み合わせは、共有結合した多糖からリピドAを遊離するために使用される。ブライとダイアーのメソッドが最初に14組織が ​​、動物や植物の様々な脂質種の抽出に適用されるこの最終分離工程中の脂質Aから加水分解された多糖類を分離するために、ここで変更された、クロロホルム可溶性の脂質は、選択的に下層の有機に分配相。さらに、リピドAを精製するには、逆相又は陰イオン交換カラムクロマトグラフィーは、12を用いることができる。

全細胞由来の脂質A種の単離後、分析方法の数は、NMR、TLC及びMSベースの分析のような単離された物質の化学構造を特徴付けるために使用することができる。 NMRは非破壊構造解明を可能にし、グリコシド結合、アシル鎖位置の明確な割り当て、およびアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミン15〜17のような脂質Aの変更のための結合部位の割り当てに関連した構造的な詳細を提供します。リピドAのNMR分析は、我々のプロトコル内で議論されていないが、別の場所15,16十分に記載されている。迅速な分析のためにTLCの方法が頻繁に使用され基づいているが、微細な化学構造に関する直接的な情報を提供することができない。 MSベースのプロトコルは、脂質A構造18,19を特徴付けるために最も頻繁に使用される方法である。マトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI)-MSは、しばしば、最初に無傷のリピドA種を調査するために使用される。単一荷電イオンは、我々の分析物の抽出手順に従って調製から生成される。より細かい構造解析が必要とされるように、MS / MSベースの方法は、MALDI-MSのより多くの情報を証明する。単独で(ESI)をエレクトロスプレーイオン又は前駆イオンは、さらに構造的に有益な生成物イオンの18,20,21を生成するために、衝突誘起解離(CID)又は紫外光解離(UVPD)によって断片化された荷電脂質を乗算する結合されている。前駆体イオンを、脂質からニュートラルロス製品も頻繁に構造情報の追加レイヤを提供し、ESI-MSの間に生成される。

タンデム質量分析(MS / MS)は、リピドA構造の解明に不可欠で汎用性の高い方法であることが証明されている。 MS / MSの間に、イオンは、前駆イオンの構造を解明するために使用することができる診断フラグメンテーションパターンを生成するために活性化される。最も広くAVAilable MS / MS法は、CIDである。この方法は、解離を導くエネルギーの堆積をもたらす、不活性ガスをターゲットと選択された前駆イオンの衝突を介してフラグメントイオンを生成する。 CIDは細菌種22-33広範囲のリピドA構造の割り当てにおいて重要なツールであることが分かっている。

CIDは最も普遍的に実装され、MS / MS法であるが、生成物イオンの限定された配列を生成します。 193nmのUVPD代替相補MS / MS法である。この方法は、イオンを照射するレーザーを使用し、光子の吸収は、イオン解離及びその後の通電をもたらす。この高いエネルギーMS / MS技術は、CIDよりも生成物イオンのより多様なアレイを生成するため、より有益な断片化パターンを提供する。特に、UVPDはグリコシド、アミン、アシルおよびCC連動債で切断18,21,34に基づいてリピドA種の微妙な変化についての情報を与える。

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Protocol

すべてのソリューションは、超純水およびHPLCグレードのメタノール、クロロホルムで準備する必要があります。例えば、メタノール、クロロホルム、またはピリジンおよび濃縮酸または塩基のような有機溶媒を含有する調製された溶液を調製し、化学ヒュームフードの下で使用されるべきである。全ての溶液をRTで保存することができる。溶剤は、ガラスシリンダーで測定されたPTFE並ぶキャップ付きガラス溶媒ボトルに格納する必要があります。長期保存のためにクロロホルムを含有する溶媒は、ホスゲンの製造、高反応性の酸塩化物を回避するために、着色アンバーガラス瓶に記憶されるべきである。 PTFE遠心管、ロータリーエバポレーターフラスコを使用前にメタノールおよびクロロホルムでリンスすべきである。溶媒および/または放射性廃棄物の処分、必要に応じて連邦、州および/または施設の廃棄物処理の規制に従ってください。

1。大規模な脂質Aの抽出(1.5 Lと50ミリリットル)

  1. クロロ:単相ブライ·ダイアー液を調製するフォームメタノール-1Xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH7.4で、1:2:0.8 v / v)であった。 、メタノール400ミリリットルと1リットルの溶媒ボトル内のPBSを160ミリリットルのクロロホルム200ミリリットルを兼ね備えています。キャップボトルと転倒混和(> 30X)。ベント、密閉保存するために、混合中に定期的にキャップを緩めます。
  2. 予め平衡二相ブライ·ダイアー混合クロロホルムを準備します:メタノール:水(2:2:1.8 v / v)であった。 1 Lの溶媒ボトル内の水のクロロホルム400ミリリットルのメタノール400ミリリットルと180ミリリットルを兼ね備えています。キャップはボトルと反転させて混合、排出するために、混合中に定期的にキャップを緩めて確認すること。 O / Nや店舗密閉さを平衡化してみましょう。
  3. 弱酸加水分解緩衝液調製し(50mM酢酸ナトリウム、pH 4.5、1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))。弱酸加水分解緩衝液500mlのために、酢酸ナトリウム2.05gを秤量した500mlのビーカーに移す。次いで、10%SDSを50ミリリットルを加え、〜350ミリリットルと攪拌の容量まで水を加える。混合し、pHを4.5に調整し、メスシリンダーに移し、500ミリリットルに水を加える。
  4. 準備するクロロホルム:メタノール(4:1、V / V):クロロホルム100ミリリットルを測定し、ボトルを溶媒に移す。メタノール25mlを測定し、クロロホルムで混ぜる。琥珀色のガラス瓶に保管してください。
  5. 単一の細菌コロニーからのメディア(ルリアブロスまたは他)の5ミリリットルを接種する。 O / N、37℃で、または増殖に必要な℃で成長する。抽出手順の図2に示されている。
  6. 次の日は、OD 600を測定し、0.05の開始OD 600に文化の200ミリリットルを接種するために5ミリリットルのO / N培養を使用しています。 0.8〜1.0のOD 600に達するまで細胞を増殖させる。
  7. 10分10,000×gで遠心分離によって細胞を回収。長いスピンは不十分ペレットの株が必要な場合があります。メディア上澄みを捨てる。
  8. 1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)50mlで細胞ペレットを洗浄する。細胞をペレット化し、遠心分離を繰り返します。 -20℃で上清とストア細胞ペレットを捨て、または1.9に進みます。
  9. 40ミリリットル中に細胞を再懸濁し1×PBS二250ミリリットルPTFE遠心管の間の格差(細胞懸濁液/チューブを20mlを得た)。単相ブライ·ダイアーのために、各チューブにクロロホルム25ミリリットル、メタノール50ミリリットルを追加します(クロロホルム:メタノール:水、1:2:0.8 V / V)( 図2)。反転によって混合し、完全な細胞溶解を確実にするために> 20分間RTでインキュベートする。
  10. 20分間2000×gでの混合物を遠心分離する。しかしながら、リン脂質、イソプレニル脂質、および小さな疎水性ペプチドは上清に残る、LPSは、タンパク質および核酸( 図2)と一緒にペレットであろう。上清を捨てる。
  11. 〜100ミリリットル単相ブライ·ダイアーの混合物を用いて、LPSペレットを洗浄。 20分間2000×gで遠心分離する。上清を捨てる。 E.からリピドAを単離する際に大腸菌又はサルモネラは 、一つだけの洗浄が必要とされるが、追加の洗浄工程は、いくつかの生物からの脂質Aを単離する際にリン脂質汚染を減少させるために必要とされ得る。
  12. MIの27ミリリットルを追加します。LD酸加水分解緩衝液(50 mM酢酸ナトリウム、pH 4.5; 1%SDS、ステップ1.3を参照)、LPSペレットにし、ピペッティングにより混合するだけの小さな粒子が残るまでダウン。超音波処理物を均一に50%の出力で20秒間一定のデューティサイクルでプローブチップソニケーターを有する溶液中でLPSペレットを再懸濁する。サンプル2X(20秒/バースト、バースト間〜5秒)の超音波処理を繰り返します。
  13. 30分間水浴中で沸騰サンプル。注意:キャップが締まっているが、完全密封されていないことを確認してください。 コレラ菌(コレラ菌)のようないくつかの生物は、水浴から瓶を取り出し、サンプルが進む前にRTに冷まして、リピドAの全収率を増加させるために、より長いインキュベーション時間(1時間)を必要とする。
  14. 、加水分解後に脂質を抽出クロロホルム、クロロホルム30mlおよびメタノール30mlを追加することで、2フェーズ·ブライ·ダイアー( 図2)混合物中にSDS溶液を変換するには:メタノール:水(2:2:1.8、V / v)混合物。転倒混和し、2で10分間サンプルを遠心分離、000 X G。ガラスピペットを使用してきれいなPTFE製遠心管に下相を抽出します。
  15. ステップ1.14から上相に、予め平衡二相ブライ·ダイアー混合物(ステップ1.2)から下相の30ミリリットルを追加することによって、第二の抽出を行う。 10分間2000×gで遠心分離して、混ぜる。下相を抽出し、ステップ1.14で抽出された下相のプール。
  16. 2フェーズ·ブライ·ダイアーの混合物を生成するために予め平衡2相ブライ·ダイアー上相(ステップ1.2)の114ミリリットルを追加することによって、プールされた下相(60ミリリットル合計)ウォッシュ(クロロホルム:メタノール:水; 2時02分: 1.8、v / v)であった。混ぜる。 10分間2000×gで遠心分離する。
  17. 回転蒸発( 図2)を使用して、清浄なガラスロータリーエバポレーターフラスコや乾燥サンプルに下相を除去します。
  18. フラスコの側面から脂質の懸濁を助けるために、回転式フラスコに、メタノール(4:1、V / V)、およびバス·超音波処理(> 30秒):クロロホルム5mlを追加します。クリーンに脂質を転送するために、ガラス転移ピペットを使用してガラス管(13×100ミリメートル以上)のPTFEでキャップされ、フェノール性スクリューキャップを並んでいた。窒素乾燥機を用いて、窒素気流下で乾燥したサンプル。
  19. クロロホルム1mlに乾燥した脂質を再懸濁し:メタノール(4:1、v / v)であった。小さなボリュームを使用してより定量的な再懸濁用テーパーベース(装置/試薬の表を参照)を持つ小さなガラス製サンプルバイアル(12×32ミリメートル)に転送する。窒素乾燥機を用いて乾燥させます。
  20. 乾燥した試料は、その後のTLC(プロトコル2)又はMS分析(プロトコル3、4、または5)まで-20℃で保存することができる。 (注:材質孤立し、その後のプロトコルで使用される量は、ほとんどの生物には十分だものに基づいて提案されているのと同じ脂質サンプルはプロトコル2-5で使用することができ、取り外し%の素材に着目して詳細説明を参照してください。。。)。

2。薄層クロマトグラフィーを介して脂質A種の可視化

  1. TLC移動相溶媒系(; 50:50:16:5 V / V水:ピリジン:88%ギ酸クロロホルム)を準備します。 COMBIN電子クロロホルム200ml、ピリジン200mlを、88%ギ酸64mlの、および20 mlの水1 L溶媒ボトルである。キャップボトルは、反転を複数回で混合し、ベント。
  2. 20×20センチのプレートを収容するTLCタンクを使用してください。約40センチクロマトグラフィーペーパーに沿ったTLCタンク。
  3. ピリジン:88%ギ酸:水(50:50:16:5、v / v)混合物のTLCタンクにクロロホルム200ミリリットルを加える。タンクは、多くの場合、O / Nが好ましく、より便利に、> 3時間あらかじめ平衡化することができます。
  4. 冷凍庫(ステップ1.20)から、乾燥した脂質のサンプルを取り出して、室温まで昇温してみましょう。
  5. かみそりでシリカゲル60 TLCプレートの上端からシリカを除去します。鈍い鉛筆を使用して、2センチメートル下から、プレートの底に平行な線を描きます。この行は、サンプルをスポットするための原点です。マークは、1cm離してサンプルを発見するために、この基準線に沿って増加します。
  6. 200μlのクロロホルムのステップ2.4​​から乾燥した脂質を溶解する:メタノール(4:1、v / v)で、渦と音波処理(3X、約15秒ごと)、利回り〜100 -500 NG /脂質AμLEから抽出された場合大腸菌
  7. マイクロキャピラリーガラスピペットを用いて、ステップ2.5でマークとしてTLCプレート上にボリューム(20μL)の十分の一を発見。サンプルは空気乾燥TLCプレート上〜15分間できるようにする。 (注:小さなガラスバイアル内のサンプルは、窒素乾燥機で乾燥させ、プロトコル3-5の次の使用のために-20℃で保存することができ取り除か%素材に注意してください。)。
  8. 予め平衡タンクに斑点試料を含むTLCプレートを置きます。溶媒の先端がTLCプレート(〜2.5〜3時間)の最上部に達すると、プレート、空気乾燥(> 60分)を取り外します。冷空気銃は、完全な乾燥を確実にするために使用することができる。
  9. プレートが乾燥している間、焦げ、250℃のホットプレートの電源をオンにします。
  10. 換気化学換気フード内で、シリカTLCプレート上で分離し脂質を炭化するために10%硫酸 - エタノール混合物を調製し(濃硫酸:100%エタノールと、1時09 v / v)であった。硫酸10mlに測定し、100%エタノール90ml中に徐々に加える。介護完全に混合し、ガラスのクロマトグラフィー用試薬の噴霧器に移す。
  11. ドラフト内で、10%硫酸 - エタノール混合物で乾燥したTLCプレートを噴霧するガラスクロマトグラフィー試薬噴霧器を使用。プレートに均等に混合を噴霧。
  12. 黒焦げ脂質サンプルは黒/茶色の斑点(<1分)として表示されるまで、250℃のホットプレート上でTLCプレートを置きます。これはプレート全体が茶色にして、リピドA種の可視化を困難にする原因となりますように、プレートを露出オーバーしないでください。

3。 MALDI-TOF質量分析を介して脂質Aの構造解析

  1. ステップ1.20、(またはステップ2.7)から冷凍庫からの脂質の試料を除去し、室温まで昇温してみましょう。乾燥した脂質を〜でサンプルを再懸濁し、20μlのクロロホルム:メタノール(4:1、v / v)でE.から抽出された場合には〜1-5μgの/μlの脂質溶液を得るために、渦大腸菌 。 (注:ステップ2.7から使用される材料であれば10%の低濃度)。
  2. ATTのマトリックス成分を準備します。飽和した6 - アザ- 2 - チオチミン、50%のアセトニトリル:1.5 mlのマイクロ遠心チューブに500μlの水とアセトニトリル500μLを追加し、50%アセトニトリルが過飽和になるように> 10 mgの6 - アザ-2 - チオチミンを追加します。飽和三塩基性クエン酸アンモニウム水溶液:沈殿させ、500μlの水に> 1 mgの追加は容易に明らかなはずである。使用前にボルテックスし、遠心分離器のソリューションは、唯一飽和上清を使用します。
  3. ATTマトリックス混合物を調製する:50%アセトニトリル中の飽和6 - アザ-2 - チオチミン、飽和三塩基性クエン酸アンモニウム(20:1、v / v)であった。 MALDIプレートに適用する前に、500μlのマイクロチューブ、混合するボルテックスし、遠心分離器で三塩基性クエン酸アンモニウム飽和溶液1μLにATT溶液20μlを添加することにより、マトリックス成分を一緒に混ぜる。
  4. 最も正確な質量/電荷比の決定を提供するために、サンプルが堆積される場所の近くに、その場でMALDIプレートに0.5μlのキャリブラント混合物を添加することによってMALDIプレートを準備します。
  5. 預金0.5μL脂質サンプルが堆積される各スポットでのMALDIプレート上にATT行列の。
  6. プレートに混合し、最適なイオン信号のスキャンサンプルによるスペクトル( 図3)を取得するATT行列のスポットに付着物の試料0.5μL(全サンプルの2.5%)、。注意:最適なMSシグナルの金額は、生物によって異なり、経験的に決定される必要があることができます。より多くの材料を追加するには1を0.5μLを発見した混合物を、より試料の添加の間に乾燥させることを何度も見つけることができます。このサンプルでは、​​(より少量の乾燥に再懸濁)を濃縮または必要に応じて希釈することができる。出発物質(細胞培養の開始体積)(考察参照)も使用することができる。

4。エレクトロスプレーイオン化質量分析およびリピドAの衝突誘起解離

  1. ガラスゾル中の200mLのHPLCグレードのクロロホルムでHPLCグレードのメタノール200μlのストックを混合することにより、メタノール混合溶媒(1:1、v / v)のクロロホルムを調製ボトルをベント。
  2. (ステップ1.20、2.7、またはプロトコル3の後に乾燥させてからEG)脂質Aでバイアルにメタノールの混合溶媒と脂質を5分間またはすべての物質が溶解するまで溶液を超音波処理:200μlのクロロホルムを転送します。
  3. ネガティブモードのエレクトロスプレーイオン化質量分析装置を設定します。
  4. 250μLシリンジとシリンジポンプを用いて、直接、2.0〜3.5μL/分の流量で希釈された脂質のサンプルを注入する。
  5. イオン光学系をチューニングすることで、脂質イオン信号を最適化し、強化する。完全な質量スペクトルがいリピドA種( 図4)から収集することができる。
  6. 単離し、MS / MS法としてCIDを選択することによって、標的脂質Aを活性化する。
  7. 種は、最も高いプロダクトイオンに比べ約10%の相対的存在である、前駆体脂質までCID電圧(または正規化衝突エネルギー、NCE)を増やします。
  8. 十分な信号対ノイズが目について達成されるまで、スペクトルを取得し、平均Eのプロダクトイオン。必要な走査数は、元の前駆体のシグナル強度に依存し、3-300走査( 図5A)の範囲であり得る。

5。紫外線光解離による脂質AのMS / MS

  1. ステップ4.1から4.5までのように、試料と質量分析装置を準備します。
  2. 質量分析計にインターフェースレーザーをオンにします。質量分析計は、193nmのエキシマレーザーを装備し、機器のHCD細胞におけるUV活性化を可能にするように改変した。光解離は、以前35に記載したのと同様の方法で実施された。我々は、高エネルギーのCトラップ解離(HCD)細胞内に光子を伝送するためにCaF 2の光学窓で修飾した真空マニホールドを使用しています。レーザーは、トランジスタ·トランジスタ·ロジック(TTL)パルス/遅延発生器に質量分析計からの信号により、MS / MSの中にトリガされます。
  3. ときにレーザがエキシマレーザをトリガするように測定器ソフトウェアをセットアップするイオンは、HCDのセルを入力してください。これは、ソフトウェアの適度な変更を必要とします。
  4. レーザーは、すべての2ミリ秒(500 Hz)をパルス化されるようにパルス発生器の電源をオンにします。
  5. MS / MS法として、HCDを選択することで、脂質の前駆イオンを分離し、1%のnCEに衝突エネルギーを調整します。これは、HCDのセル内の紫外線解離のための前駆体イオンの単離を可能にする。 HCDセルを用いているが、ソフトウェアはこの間隔の間UVPDを実行するように修正される。
  6. レーザーエネルギーを増加させ、レーザパルスの数を調整することによって単離された脂質のイオンを活性化する。典型的なUVPD実験10 6ミリリットルパルスを用いて行われる。
  7. 十分な信号対雑音がUVPDプロダクトイオンについて達成されるまで、ステップ4.8のように、スペクトルを取得し、平均。必要な走査数は、元の前駆体のシグナル強度に依存し、3-300走査( 図5B)の範囲とすることができる。

6。32 P-標識化リピドAおよびその後の単離の

  1. 単一のコロニーからメディア(ルリア培地または他のメディア)の5ミリリットルを接種する。 O / N、37℃で、または必要な温度で成長する。
  2. 次の日、OD 600を測定し、標準20×150ミリメートルの使い捨てガラス培養管中で成長〜0.05の開始OD 600に文化の7ミリリットルを接種するために、O / N培養を使用しています。無機32 Pの2.5μCiの/ mLを加え0.8〜1.0のOD 600に達するまで細胞を増殖させる。連邦、州、および/または放射性物質の安全かつ適切な取り扱いのための施設のガイドラインに従ってください。
  3. PTFEで16×125ミリメートルガラス遠心管中の細胞を回収し、10分間1500×gで固定角度臨床遠心分離機を用いてキャップを並んでいた。適切な放射性廃棄物容器に上清を除去します。その後の工程で生成されたすべての放射性廃棄物( 例えば 、液体、ガラス、バイオハザード)が連邦、州に従って廃棄、および/ ​​または施設のGUIべきであるdelines。
  4. 1×リン酸緩衝生理食塩水(PBS)5mlで細胞ペレットを洗浄する。 1,500 X gで10分間遠心します。上清を捨てる。
  5. 単相ブライ·ダイアー混合物の5ミリリットルのクロロホルムからなる( 図2)に再懸濁細胞:メタノール:水(1:2:0.8、v / v)であった。ボルテックス混合し、完全な細胞溶解を確実にするために> 20分間RTでインキュベートする。
  6. 20分間1500×gでの臨床遠心機で遠心します。優しくリン脂質とイソプレニル脂質を含んでいる上清を捨てる。
  7. 50 mM酢酸ナトリウム、pH 4.5、1.8 mlのLPSペレットを再懸濁し、1%SDS緩衝液ボルテックスにより。ペレットを均一に分散されるまでバスソニケーターを使用して超音波処理サンプル(〜30秒)。
  8. 水浴を沸騰30分間サンプルをインキュベートする。キャップが締まっているが、密封されていないことを確認してください。
  9. 水浴から取り出して、サンプルは5〜10分間、室温で冷まします。
  10. 2mlのクロロホルムおよび2 mlを添加することにより、二相ブライ - ダイアー混合物に溶液に変換するメタノール、クロロホルムを得た:メタノール:水(2:2:1.8 v / v)混合物。ミックス、そして別々の相に1500×gでの臨床遠心分離機中で10分間遠心分離機に渦。
  11. ガラスピペット(最初の抽出)を使用して、清浄なガラス遠心管に下相を抽出します。
  12. ステップ11からの残りの上相に(ステップ1.2と同様にして調製)予め平衡二相ブライ·ダイアー下相の2ミリリットルを追加することにより、サンプルの2番目の抽出を行う。ボルテックスと遠心10分。下相を除去して最初の抽出から下相と結合。
  13. プールされた下相(〜4ミリリットル総量)に対して、2フェーズ·ブライ·ダイアー溶液(クロロホルム得予め平衡上相(ステップ1.2)の7.6ミリリットルを追加します。メタノール:水、2:2:1.8、Vを/ v)である。 10分間ボルテックスし、遠心分離する。
  14. きれいなガラス管に下相を除去し、窒素乾燥機を用いて乾燥させます。乾燥した試料を、さらに使用するまで-20℃で保存することができる。

7。 Visuali薄層クロマトグラフィーを経由して32 P標識リピドA種のzation

  1. ステップ2.1から2.8で説明したように32 P標識脂質のサンプル、TLCタンク、およびTLCプレートを準備します。
  2. クロロホルム:メタノール= 4:1(V / V)の500μlの32 P標識サンプルを溶解する。渦とバス音波処理は完全に脂質材料を溶解する。シンチレーションカクテルの5ミリリットルを含むシンチレーションバイアルにサンプルを5μLを加える。シンチレーションカウンターでカウントしたサンプルの合計カウント/分を計算します。
  3. 放射性標識脂質種を視覚化すると、10×20センチ20×20センチTLCプレートを使用することができる。プレートの最長寸法が垂直になるように10×20センチメートルプレートのために、試料は(原点でスポッティングすなわちサンプルが2cm 10cmのエッジの上にマークされている)のステップ2.5でマークの原点に沿って発見されるべきである。
  4. マイクロキャピラリーピペットを用いて、プレート上の10,000〜20,000 CPM /サンプルを発見し、スポットは(> 15分)乾燥させます。サンプルは下に乾燥させることによって濃縮することが必要になる場合があります窒素および10,000〜20,000カウント/分/スポット(<10μlの合計に対して、一度に2μLまたは2μL)を達成するために、適切なボリュームに再懸濁した。
  5. 予め平衡タンクに放射性標識された試料を含むTLCプレートを置きます。溶媒の先端がTLCプレート(〜3時間)の最上部に達すると、プレート、空気乾燥(> 60分)を取り外します。注意:ピリジン、微量のホスホイメージングスクリーンに損傷を与えることができるよう、ピリジンの存在下で実行されたTLCプレートは、化学ドラフト内で完全に乾燥させなければならない。冷空気銃は、完全な乾燥を確実にするために使用することができる。
  6. ラップでプレートをラップし、オートラジオカセット、O / Nでホスホイメージャ画面に公開翌朝、画像( 図6)を取得するには、画面をスキャンします。画像デンシトメトリー分析ソフトウェアを用いて、この方法は、脂質A種の正確な相対定量を可能にする。

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Representative Results

Eの標準的な脂質Aおよび4 '位- 大腸菌サルモネラ菌血清型菌は、ヘキサ-アシル化1でのリン酸基とグルコサミンの二糖である。リッチメディア( 例えばルリアブロス)での成長中にリピドAの部分は、 トリス -リン酸化された種は36( 図1)を得た1位のピロリン酸基を含む。 KDO(3 -デオキシ-D- マンノ -オクツロソン酸)、6'-ヒドロキシル基に結合しかつLPSの残りの糖質ドメイン( すなわち 、コアのオリゴ糖とO-抗原ドメイン)にリピドAにリンクするためのブリッジとして機能する。グラム陰性細菌は、脂質のために保存された経路を共有するがE.と同様の合成大腸菌 K-12は、リピドA構造の多様性が多量存在する。この多様性は、環境刺激に応答して活性化される脂質構造を改変する潜在性酵素の作用から生じる。 exampのためS.のル、又はホスホエタノールアミン残基( 図1;マゼンタ)で、リピドAのエンテリカリン酸基は、カチオン性糖L-4-アミノアラビノース(青図1)で修飾することができる。 サルモネラでは、これらの改変は、二成分応答調節因子系によって調節される、低【 Mg 2 +]、穏やかな酸性pH、及びカチオン性抗菌性ペプチドの存在に応答して添加した。 8;さらにサルモネラではパルミチン酸(緑図1)カチオン性抗菌ペプチドに対する耐性を促進ヘプタアシル化リピドAを形成するために添加することができる。他の修飾としては、限定されないが、リン酸基およびアシル鎖、又はジオキシゲナーゼの除去は生物1,3の数において観察3'-結合二次アシル鎖にヒドロキシル基の付加を触媒した。

カロの方法の私達の修飾による細胞全体から無傷リピドAの分離ffのとRaetz、プロトコル1( 図2)に記載されている。この分離方法は、脂質Aの10 6個の分子がE.細菌の細胞ごとに存在することを推定するために使用されている大腸菌 37。以下のプロトコル1および3、E.由来の脂質Aの負イオンMALDI-TOF質量スペクトルすぎなかっ観察種( 図3)としてのm / z 1,796.20で- コリ K-12(W3110)は、単独で脱プロトン化イオン([M-H])を生成します。 MALDI-TOF MSは、スペクトル分解能を向上させるために、負リフレクトロンモードで実施した。 ( 図4) -あるいは、ネガティブモードナノESI(プロトコル4)に付し、同一の脂質サンプルを、[M-2H] 2で表さたm / z 898.1において主に二重に脱プロトン化されたリピドAイオンを生じる。単独で脱プロトン化リピドAイオン[MH] - のm / zでの1,796.20で観察可能であるが、[M-2H] 2低い相対的存在である-イオン( 図4)。多重荷電種はpredomiネイト、ESIを使用。 CID( 図5A)または193 nmのUVPD( 図5B)によるフラグメンテーションは[MH]で行われた-脂質イオンのm / z 1,796.20。これらの技術は、良好な化学的構造、特に修飾の複雑な組み合わせを含む脂質A種から、または以前に特徴づけられていない化学的修飾を割り当てるために使用することができる。断片化プロファイルは切断部位を表す破線で示されており、各構造体が設けられ、以下のm / z値図5)と一致している。 m / z値および切断部位が赤いフォントで強調表示UVPDに関連したユニークなプロダクトイオンを表す。

プロトコル6および7に記載したように、32 P-標識脂質Aは、2つの異なるE.から単離された大腸菌 K-12株は、TLC( 図6)により分析した。 W3110は主に、ビス-およびトリス-リン酸化された脂質A( 図6を含んでいます。左レーン)、より複雑なパターンは、TLC E.から単離された32 P-リピドAで観察されるのに対し大腸菌株 WD101( 図6、右レーン)38。 WD101は重くアミノアラビノース(L-Ara4N)とホスホ(PETN)で修飾した脂質を生成します。 'と4 - - 1両方以来、リン酸塩は、修正のために利用できる、WD101からの脂質Aは、単独でどちらかのリン酸に1つだけのL-Ara4NまたはPETNを含む、変更された、または二重の両方のリン酸塩は、組み合わせのように変更される場合に変更記述することができます。および4 ' - - 1での修飾に加えて、リン酸、パルミチン酸付加もまた観察される( 図1参照)、この溶媒系( 図6)における脂質A種のR f値を増加させる。所望ならば、ホスホイメージャーを用いてデンシトメトリー分析は、同じサンプル内のリピドA種の推定相対量を定量的にするために使用することができる。


図1。 E.からの代表的な脂質ドメイン構造大腸菌 K-12およびSエンテリカ血清型ネズミチフス菌 。代表的な結果で説明したように保存された脂質構造への変更は、(右)が示されている。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図2
図2。脂質の概略単離方法。概要は、単相ブライ-ダイアー混合物を用いて細菌細胞ペレットの化学的溶解を示す、LPSをペレット化し、溶解物を遠心分離し、軽度-α付属の多糖類からリピドAを解放するCID加水分解し、2相ブライ-ダイアー抽出を使用してリピドAの最終精製。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図3
図3。 E.から単離されたリピドAのMALDI-MS分析コリ K-12(W3110)。スペクトル> 300ショットの平均から得た。単一荷電[MH] -リピドAは右側に示された構造の脱プロトン化された種に相当するのm / z 1,796.2、分子イオンとして観察される。

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図4。 E.から単離されたリピドAのESI-MS分析大腸菌 K-12(W3110)片方向[MH]及び二重荷電[M-2H] 2 -リピドA種はそれぞれ、 のm / z 1,796.2及びm / zは 898.1の分子イオンとして観察される。

図5
図5。 E.から単離されたリピドAのMS / MS分析大腸菌 K-12(W3110)。衝突誘起解離(A)または紫外線光分解(B)は 、プリカーサイオンのm / z 1,796.2を断片化するために使用した。 UVPD特定のプロダクトイオンは赤で示されます。断片化マップは、黒線はCIDとUVPDの両方に関連するフラグメンテーションを示し、赤線はUVPDのSPEを示す破線の破線(C)が 、設けられているcificの断片化。断片化マップの下に記載されている値は、[M-H]の正確な質量に相当- 。プロダクトイオン大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図6
図6。 E.から分離リピドA種のTLCに基づく分離大腸菌 K-12 32 P標識リピドAはW3110(左レーン)またはWD101(右レーン)から単離し、クロロホルムを含むTLCタンク溶媒系で分離したピリジン88%のギ酸:水(50:50:16 :5 v / v)であった。

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Discussion

このプロトコルでは、細菌の全細胞由来の脂質A種の単離を詳述し、かつ化学的に、この単離された物質を特徴付けるためにTLCまたはMSベースの分析方法を記載している。タンデム質量分析法は、生物学的化合物の新たな構造解析のための強力な戦略であり、自然の中で観察されたリピドA分子の盛装の化学的特性のために非常に貴重です。 CIDとUVPD脂質A分子のキーフィンガープリントを提供するプロダクトイオンの異なるタイプを作成するには、2つの相補的な活性化方法である。 CIDとUVPDの両方を使用して、MS / MSフラグメンテーションは、化学構造の割り当てのための細かいディテールを提供する、脂質A構造の微妙な違いを解明することができます。このタイプのデータは、脂質分子種の生物学の正確な相関構造/機能の関係を確立することが必要である。また、年代に32 P-放射性標識リピドA種の手順を記載している32 P-リピドA種の化学的パターンはTLCおよびオートラジオグラフィーを用いて可視化することができるモール規模細菌培養。

任意のユーザーが知っておくべき、この議定書の特徴がいくつかあります。大規模な脂質製剤A(プロトコル1)については、細菌ペレットの量に溶媒出発の割合が全体の収率を改善するために最適化することができる。しかし、この割合は、経験的に決定することができる。このプロトコルに記載の金額は、ほとんどの細菌株のための良い出発点を表している。脂質のための培養容量抽出および単離はまた、使用しているの細菌株に応じて調整することができる。例えば、V. E.のためしかし、培養体積、 コレラ、高品質の質量スペクトルを得るために、培養物の少なくとも200ミリリットルが必要大腸菌を 5mlにスケールダウンすることができる。出発物質(より大きな培養容量)は、いくつかの細菌種に必要ですので、hydrolys全体のLPS由来の脂質Aはあまり効率的で放出するステップです。例えば、機能のKdoジオキシゲナーゼやのKdoキナーゼの展示を含む生物は、穏やかな酸加水分解した後に39リピドAの収量が減少した。多くの場合、変更されたLPS /リピドAの構造や特定の細菌種を有する変異体は、多くの場合、細胞回収時にペレット化することは困難である。これらの株については、遠心分離の長さは、収量を増加させるために拡張することができる。また注目すべきで、単相ブライ - ダイアー混合物およびLPSで細胞溶解後(ステップ1.9参照)をペレット化し、追加の洗浄ステップは、リン汚染を低減するために必要とされてもよい。 E.からリピドAを単離する際に大腸菌サルモネラは 、唯一のワンウォッシュが必要です。他の生物( 例えば、コレラ菌ヘリコバクター·ピロリ )からの脂質Aを分離する場合は、追加の洗浄ステップが必要です。

SDS、疎水性の低下( すなわち 、よりフォー持つリピドA種の収量の穏やかな酸加水分解後> 2個以下のアシル鎖sphate基は<5)酸性ブライ - ダイアー抽出を使用することによって改善することができる。プロトコルセクション1で使用されるボリュームの場合、クロロホルム30ミリリットルとクロロホルム2相ブライ·ダイアー混合物のための30mlのメタノールに続いて加水分解された脂質Aを含むSDS溶液に濃塩酸225μLを追加:メタノール:0.1MのHCl (2:2:1.8、v / v)であった。メタノール:プロトコルセクション6で使用されるボリュームをクロロホルム2mlのクロロホルムをもたらすメタノール2mlに続いて加水分解された脂質Aを含むSDS溶液に濃HCl 15μlを加えるための0.1MのHCl(2:2:1.8、V / v)混合物。酸性ブライ - ダイアー抽出した後、ピリジンを酸(最終試料体積のピリジン/ 2mlを1滴)を中和するためにプールした下相に加えることができる。この追加のステップは、化学換気フード内で、試料を乾燥させる前に行われるべきである。エステル結合した脂肪酸の除去につながる可能性が過剰のピリジンを使用しないように注意してください。さらに、脂質SAMP場合LEは、窒素下で乾燥クロロホルム数ミリリットルを追加することは困難である:メタノール(4:1、V / V)をフラスコに、完了にサンプルを乾燥させるために続けています。

いくつかの生物( 例えばコレラ菌、エルシニア仮性 )で観察されたリピドA種の複雑な化学不均質性は、時々 、TLC-またはMSベースの分析が困難になります。カラムクロマトグラフィーは、より単純なこれらの混合物中に単離されたリピドA種を事前に分画するために、これらの分析技術の上流に用いることもできる。ジエチルアミノエチル(DEAE)セルロースでのアニオン交換は、最も一般的に使用されいる40。このようなアミノアラビノースまたはホスホエタノールアミンのような非酸性基と、リン酸塩のいずれかの位置で修飾さ一般的なガイドラインピドAとして、非修飾リピドAの40種の前に溶出する。同様に、トリス-リン酸化された脂質Aはよく変更されていないbisphosphorylated種36,40の後に溶出する。逆相クロマトグラフィーは、脂質の種を分画するために使用することができる疎水41の様々な程度のS。カラムクロマトグラフィーはまた、弱酸加水分解とその後のブライ·ダイアー脂質抽出工程後の残留SDSの除去に有用である。残留SDS高レベルのは、我々の感受性ESI-MSプロトコルによって得られたスペクトルで信号抑制に寄与することができる。

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Disclosures

利害の対立が宣言されていません。

Acknowledgements

この作品はまた、JSBにR01GM103655を付与ウェルチ財団助成F1155およびNIHによってサポートされていました衛生研究所(NIH)の国立研究所からの補助金のAI064184およびAI76322によっておよびMSTの調査に陸軍研究室からの助成金61789-MA-MURによってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chloroform Thermo Fisher Scientific C607 HPLC Grade
Methanol Thermo Fisher Scientific A452 HPLC Grade
Teflon FEP Centrifuge Bottles Thermo Fisher Scientific 05-562-21
Silica Gel 60 TLC Plates EMD Biosciences 5626-6
Grade No. 3MM Chromatography Paper Whatman 3030700
Orbitrap Elite Thermo Fisher Scientific
Mass Spectrometer
ExciStar XS Excimer Lasrer Coherent Inc.
PicoTip Nanospray ESI emitters New Obectives ≥ 30 μm to reduce clogging
Model 505 Pulse/Delay Generator Berkeley Nucleonics Corporation
Hot Plate Thermoylne 2200 Barnstead/Thermolyne HPA2235MQ
16x125 mm GPI 15-415 Threaded Disposable Borosilicate Culture Tubes Corning Pyrex 99449-16X
Reusable Threaded PTFE screw caps GPI 45-415 Corning 9999-152
Personal Molecular Imager System (phosphorimager) BioRad 170-9400
Autoradiography Cassette Thermo Fisher Scientific FBCS810
Phosphorscreen SO230 Kodak
Peptide Mass Standards Kit Sequazyme P2-3143-00
Sonifier S250-A Branson 101063196
1.5 ml 12x32 mm Tapered Base Screw Thread Vial Thermo Fisher Scientific C4000-V1

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