一个协议,用于基因诱导和良性和浸润性肿瘤可视化的头侧配合

Medicine

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Summary

激活的致癌基因RAS一样的V12和细胞极性基因一样潦草 ,导致肿瘤生长的果蝇 ,其中肿瘤细胞也显示侵入行为的突变之间的合作。在这里,一个简单的协议为良性和浸润性肿瘤的诱导和观察提出。

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Srivastava, A. A Protocol for Genetic Induction and Visualization of Benign and Invasive Tumors in Cephalic Complexes of Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (79), e50624, doi:10.3791/50624 (2013).

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Abstract

果蝇照亮了我们的正常发育和疾病的遗传基础的了解,在过去的几十年,今天它仍然极大地促进我们对复杂疾病的1-7了解。肿瘤从良性到转移状态的进程是一个复杂的事件8,并已在模拟果蝇 ,以帮助我们更好地了解这种疾病9的遗传基础。在这里,我提出了一个简单的协议,以基因诱导,观察并分析肿瘤的果蝇幼虫的进展。肿瘤诱导的技术是基于MARCM系统10上,并利用活化的癌基因,的Ras V12和细胞极性基因丢失( 乱写光盘大致死巨型幼虫 ),以产生浸润性肿瘤9之间的合作。我将演示如何将这些肿瘤可在完整的幼虫进行可视化和那么如何将这些可解剖出作进一步分析。这里介绍的简化协议应该有可能使这种技术通过兴趣了解一个基因在肿瘤侵袭中的作用的调查予以确认。

Introduction

肿瘤从良性到转移状态的进展是明智步骤过程,其特征是存在于主体8的保护机制逃避。例如肿瘤细胞在体内必须能够逃避细胞凋亡和免疫系统,突破了专门的细胞外基质(ECM)称为基底膜,并克服了细胞周围的8所施加的社会控制。它是通过一步明智的进展,癌症细胞获得迁移和殖民遥远的地方在一个称为转移过程的能力。我们如何在肿瘤细胞克服了身体产生的障碍的认识仍处于起步阶段,但是,从研究新兴的画面迄今为止所做指向由癌细胞11-13重复使用正常的发育过程及信号通路。

果蝇果蝇得到了大幅我们UND贡献erstanding通过使用开发了在过去几十年中14-17先进的基因技术正常发育和疾病。使用我们已经到达了一个更好地了解各种癌基因和抑癌基因的18-22诱变和表达的工具。然而,肿瘤转移是一些已被主要研究了细胞培养模型23,24以及各种异种移植模型25-27的遗传病变之间的合作的结果。这些模型虽然厉害有其局限性,因为他们不完全模仿在活的有机体中发现的条件。此外,在现有的小鼠转基因模型是繁琐,不利于侵入行为28,29遗传分析。一些研究试图了解肿瘤细胞的侵袭果蝇 30,31。这些技术主要是利用原发肿瘤移植到主机,然后依靠跟踪TRAnsplanted肿瘤侵犯邻近组织32,33。一个强大的技术,称为MARCM 10适应了Pagliarini和徐肿瘤浸润在果蝇 9建模。肿瘤侵犯的这家优雅的遗传模型利用激活的癌基因和细胞极性的丧失之间的合作。这种造型的优势在于,所述浸润性肿瘤是在一个完整的有机体从而绕过需要组织移植产生的事实。带来的致癌合作,活化的癌基因类似的Ras V12是在细胞中表达的在幼虫眼触角光盘克隆。由于MARCM技术的结果,这些克隆还标有绿色荧光蛋白(GFP),方便的可视化和由合子细胞极性突变体像致命的巨型幼虫字迹潦草 ,和光盘大,其结果是在绿色荧光蛋白标记的浸润性肿瘤头侧复杂。在这个报告中,我演示如何诱导,并且无论是在一个完整的幼虫的上下文并在解剖出头侧复杂的可视化这些侵入性肿瘤。肿瘤诱导这里提出利用对果蝇第二染色体的试剂表2中,我提供股票上,可以被用于相同目的的X和 3染色体的列表。我认为,这种简化的协议将使这种技术容易接触到感兴趣的研究人员了解肿瘤进展的分子基础。

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Protocol

1。诱导良性非侵入性肿瘤

  1. 使用表2中列出的股票为良性肿瘤的诱导。
  2. 准备一个起始培养以下 ​​基因型的“测试仪”股票:Y,W,EY-FLP1;浴池- GAL80,FRT40A; Act5C> Y +> Gal4的,UAS-GFP
  3. 准备一个起始培养的“测试”股票下列基因型:W; FRT40A,UAS-V12的Ras / CYO
  4. 收集来自“测试仪”股票10只雌性童女和十男性从“测试”的股票。
  5. 放置他们两个在一个小瓶飞食品跨越从“测试仪”和“测试”股票的男性和女性。
  6. 将交叉于25℃培养箱中培养,并让雄性和雌性交配和产卵24-48小时。
  7. 检查小瓶足够卵沉积并为第一龄幼虫确保培养物不干燥的存在。
    1. 加几滴蒸压蒸馏水文化,以保持湿润(如文化干燥)。
    2. 继续监察文化,并根据需要重复步骤1.7.1。
  8. 根据观察荧光显微镜流浪三龄幼虫第3节所述。

2。感应浸润性肿瘤的

  1. 使用表2中列出的股票为浸润性肿瘤的诱导
  2. 从步骤1.2以上的下列基因型使用起动机文化:Y,W,EY-FLP1;浴池- GAL80,FRT40A; Act5C> Y +> Gal4的,UAS-GFP
  3. 准备一个起始培养的“测试”股票下列基因型:W; LGL 4,FRT40A,UAS-V12的Ras / CYO
  4. 收集来自“测试仪”股票10只雌性童女和十男性从“测试”的股票。
  5. 通过将他们两个在一个小瓶苍蝇F跨从“测试仪”和“测试”股票的男性和女性OOD。
  6. 将交叉于25℃培养箱中培养,并让雄性和雌性交配和产卵24-48小时。
  7. 检查小瓶足够卵沉积并为第一龄幼虫确保培养物不干燥的存在。
    1. 加几滴蒸压蒸馏水文化,以保持湿润(如文化干燥)。
    2. 继续根据需要监控的培养干燥,然后重复步骤2.7.1。
  8. 在荧光显微镜观察三龄幼虫第3节所述。

3。良性和浸润性肿瘤的观察

  1. 使用三龄幼虫为良性肿瘤隔离和可视化。
    1. 湿油漆刷在蒸馏水中,并使用该漆刷从培养瓶的壁刮几三龄幼虫。
    2. 将出现萧条的幻灯片用1X PBS幼虫,然后用湿油漆刷废料e关从幼虫表皮的任何食品原料。
    3. 将幼虫放置在一个培养皿,并在-20℃下冷冻30分钟,离开固定的幼虫。
      1. 另一种方法使用FLYNAP以固定幼虫。
      2. 放置一个FLYNAP棒蘸FLYNAP到小瓶从3.1.3.2和堵塞小瓶让利插入小瓶幼虫后,静置30〜40分钟。
    4. 放置在玻片上固定化的幼虫,加一滴光卤烃油,盖上盖玻片,并根据与可视化绿色荧光蛋白(GFP)的能力,荧光显微镜观察。
    5. 良性肿瘤轴承幼虫将发出绿色荧光的前部区域,其中头位络合物存在。
  2. 从文化上面的步骤#2设置观察侵袭性肿瘤中选择10天的幼虫(诱导后)。第10天幼虫被选中是因为肿瘤侵入轴承幼虫有较长的升ARVAL阶段,通常不能pupariate。
  3. 按照步骤3.1.1至3.1.4,除了代替三龄幼虫用10天的幼虫。
    1. 在第10天肿瘤侵入轴承幼虫将发出绿色荧光的前部区域,其中头位络合物存在。
  4. 如果在荧光显微镜配备有数码相机再取荧光良性和肿瘤侵入轴承幼虫的图片。

4。良性和浸润性肿瘤的头侧复杂和进一步观察解剖

幼虫的半透明表皮使得难以观察浸润肿瘤的程度。从而侵犯的程度更好地解剖头侧复杂了幼虫的可视化。应使用下列步骤来剖析头侧复杂。

  1. 用湿画笔选择三龄幼虫(良性肿瘤)和第10天的幼虫(浸润性肿瘤)FROM中的各培养瓶。
  2. 幼虫放置在含冷的1X PBS解剖菜的好。使用油漆刷刮去从幼虫表皮的任何食物颗粒。
    1. 干净的幼虫转移到含有冷的1X PBS解剖盘的新鲜好。
    2. 检查GFP荧光的使用能够检测荧光立体显微镜的存在。摒弃-GFP轴承幼虫。
  3. 加入冷的1X PBS的1.0毫升到一个新的良好的解剖盘,用一对镊子转移幼虫轴承无论是良性或浸润性肿瘤(解剖协议保持不变,这两种类型的肿瘤)。
  4. 使用一对大约2/3rds的从前端钳握住幼虫下来。
    1. 使用其他钳子和巧妙的分隔幼虫的后三分之一个并丢弃。
    2. 放手的幼虫的前2/3rds的。作为幼虫的内部压力被释放的内容幼虫会渗出体腔。
    3. 用一对镊子除去肠,脂肪体和已渗出的体腔的幼虫的其它内容内。
    4. 使用一对镊子举行幼虫的口钩将其推入幼虫表皮和使用其他钳子完全颠倒幼虫。
    5. 使用镊子轻轻地,小心地取出脂肪体,唾液腺,肠道,翼盘复杂,任何气管导管。现在头侧复杂应该是可见的连接到倒置幼虫的口钩。大脑半球和腹神经索(VNC)仍然会通过神经从VNC发出连接到幼虫的表皮。
    6. 使用镊子轻轻地打破头部神经和幼虫表皮之间的连接。
    7. 由于VNC和幼虫表皮之间的神经连接断开和多余的脂肪体等组织取出,头侧合作mplex将变得清晰可见,并且将附着在表皮幼虫只在口钩。
    8. 头侧复杂的可以留贴在幼虫表皮,如果复杂的需要固定的下游应用,如抗体染色或后可视化。
    9. 如果没有进一步的下游应用会被执行,然后头侧络合物可从幼虫表皮被分离并置于滴基于安装介质进行进一步的观察和分析的甘油。使用VECTASHIELD作为安装介质。

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Representative Results

作为协议的结果,在这里呈现的用户将能够通过过度激活的癌基因在幼虫眼触角成虫盘诱发良性肿瘤。用户也将能够通过过表达活化的癌基因在细胞的克隆以诱导侵入性肿瘤在眼触角光盘也突变体的细胞极性基因。肿瘤可以很容易地可视化,用荧光显微镜在整个幼虫或在已解剖出的幼虫体腔( 图1)的头部复合物“绿色荧光”组织的帮助。良性肿瘤将被局限在眼睛触角盘复杂的GFP阳性细胞克隆,而浸润性肿瘤会导致肿瘤的GFP阳性浸润性肿瘤的VNC和其他相邻器官移植后续大量增生。在>10天高龄幼虫(来自侵袭性肿瘤基因型)GFP阳性,并分离继发性肿瘤FLOA婷在幼虫体腔也可以观察到。此外,虽然幼虫轴承良性肿瘤pupariate上时,那些带有侵入性肿瘤具​​有延长幼虫期,未能pupariate。这些侵入性肿瘤轴承幼虫可以很容易地观察到“巨型幼虫”用充满液体的体腔。

图1
图1。 果蝇良性与侵蚀性肿瘤AB左侧面板:绿色荧光幼虫良性和侵袭性肿瘤,分别为 AB右侧面板从幼虫轴承无论是良性或侵袭性肿瘤分别为A),良性肿瘤定位于眼触角解剖头部复合盘在那里它们被诱导。请注意,绿色荧光蛋白标记的组织还没有迁移到邻近的器官,如腹神经索(VNC)。从每天10幼虫比较这给B,B)头侧复合轴承浸润性肿瘤。请注意肿瘤组织(绿色)的过度生长和侵袭也连续器官,如VNC和嘴钩的肿瘤组织(以红色箭头表示)。相邻器官的浸润性肿瘤组织的浸润是用箭头表示。 点击这里查看大图

图2
图2。基于迁移过的VNC程度浸润性肿瘤的分类方案 。将VNC的原理图与肿瘤迁移的描述与绿颜色填充的程度。与相关联的数移民的严重程度各示意图如上所示。

染色体# 测试菌株基因型 测试菌株基因型 参考
良性肿瘤 浸润性肿瘤
1 W,浴缸,GAL80,FRT19A; EY-FLP5,Act5C> Y +> Gal4的,UAS-GFP W,FRT19A; UAS-V12的Ras DLG M52,FRT19A/FM7C; UAS-V12的Ras Pagliarini和徐,2003
2 Y,W,EY-FLP1;浴池 - GAL80,FRT40A; Act5C> Y +> Gal4的,UAS-GFP 瓦; FRT40A,UAS-V12的Ras / CYO 瓦; LGL 4,FRT40A,UAS-V12的Ras / CYO Pagliarini和许2003
3 Y,W,EY-FLP1; Act5C> Y +> Gal4的,UAS-GFP;FRT82B,浴池,GAL80 瓦;无人机- ras基因V12; FRT82B 瓦;无人机- ras基因V12; FRT82B,scrib 1 / TM6Tb Pagliarini和许2003

表2。需要引起良性和浸润性肿瘤的股票的基因型。所有的股票都在所指示的基准进行了描述。股票应该从田旭的实验室要求。

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Discussion

癌症是一种复杂的疾病有一个更好的了解,今天比过去。然而,仍有许多需要学习和解释之前,我们并不拥有相关机制的全貌。这里提出的简单的协议,能够诱导基因在整个生物体良性和侵入性肿瘤,然后研究与肿瘤的此模型中的进展有关的生物学。大部分在果蝇和其他生物的现有技术或者利用基于细胞的培养系统,以了解肿瘤发生及转移,或一个系统,它采用原发肿瘤组织移植入成年的主机23-27。无论是基于细胞的移植方法有其局限性。例如,移植技术是麻烦的和费时的,并且可能导致非肿瘤组织移植入宿主。这可能会导致生产实验文物。此外,细胞邪教URE的系统是存在于整个机体的真实环境中只有约数。这种限制使得难以模仿非常重要的肿瘤与微环境的相互作用中起着肿瘤进展和转移34起关键作用。这里介绍的技术已经由几个研究小组成功地用于研究果蝇肿瘤进展的遗传和分子基础。例如,利用这种技术,它表明了该JNK途径是侵入性肿瘤都上调,也有必要对肿瘤35,36的进展。在另一项研究中基质金属蛋白酶在肿瘤进展中的作用表现在这种遗传模型12,37。

与这里提出的协议相关的关键步骤首先用于诱导良性和浸润性肿瘤的股票的正确基因型。应小心,以确保这些股票是不是“打破”。个股可定期检查的黄色存在(Y - )苍蝇这将预示A股崩溃。这表明在MARCM测试仪现货的FLP日期卡带已经自发地翻转了,并会因此而组成型表达Gal4的。这可以通过保持重复的股票在小瓶中,在18℃,另外,由于肿瘤引起的预防,对其中的幼虫应检查良性和浸润性肿瘤的日子也很关键。而良性肿瘤轴承幼虫遵循的发展时间表是大致相同的野生型幼虫,幼虫与轴承浸润性肿瘤的故事是不同的。浸润性肿瘤轴承幼虫显示延长幼虫期和一些无法pupariate。事实上pupariation与失败pupariation的这一特性已经被用来作为衡量侵袭性肿瘤抑制由MENUT 38因为扩展的幼虫阶段侵袭性肿瘤轴承幼虫关键是要观察周围8-10天诱导后浸润性肿瘤以获得最佳效果。在天8-10足够肿瘤迁移发生在VNC,以便它是容易观察到立体显微镜下。超过10天,而肿瘤可以观察到,它开始完全吞没VNC使其难以定向头侧复杂的解剖标本。与肿瘤的整个幼虫可视化相关联的另一个关键步骤是固定的幼虫的能力。既FlyNap和降低的温度下,可用于固定如详述协议概述的幼虫。最后,如​​果切开头部复合物需要与一种抗体进行染色,然后在解剖应进行冰上和络合物应30分钟内是固定的。

这里提出的技术可以由研究者可以利用来理解基因怀疑在肿瘤进展中发挥作用的贡献。使用该遗传模型中的基因的上调可以通过抗体染色技术或通过使用RT-PCR方法进行研究原位。人们也可以尝试理解的基因是否是必要的肿瘤的进展,利用该模型中与突变体的基因中的问题或RNAi试剂的组合。例如,RNA干扰试剂的基因对肿瘤的抑制进行测试可能是存在于 3染色体上。在这种情况下,测试仪和测试股票组合对2号染色体可以使用( 表2)只有在RNAi的轴承第三染色体已经越过进入测试股票。一旦这个已经实现,然后测试人员和测试股票的2号染色体可以划线,并抑制侵袭性肿瘤的检测。侵袭性肿瘤表型的抑制会建议在侵入过程中的基因的参与。然而,侵袭性表型的抑制可能不完全渗透,这是因为这个原因,我目前根据对肿瘤迁移的程度比VNC( 图2)浸润性肿瘤的分类方案。利用这种分类方法可以很容易地比较侵袭性肿瘤浸润性肿瘤,其中涉嫌在入侵的基因已被撞倒。几个头侧复合物的分析可以提供更好的洞察侵入行为抑制的程度。

虽然这里介绍的协议可以与一个或两个基因来研究基因的肿瘤进展的影响击倒组合使用两个以上的基因同时击倒在技术上是难以实现的。最后,该技术的变型是利用由Wu 等人 39理解并置激活癌基因表达细胞对细胞是突变体对细胞极性基因的影响。吴技术等。是修饰在基因试剂h时水平H但是头侧复合物肿瘤的可视化实验使用的清扫。因而解剖这里提出头侧复合物的方法可能是科学家试图利用由Wu 等人提出的改进的技术是有用的为好。

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Disclosures

我什么都没有透露。

Acknowledgments

研究在我的实验室的支持,生物学启动资金的WKU部,WKU研究基金会RCAP,我承认#11-8032,并通过从全国学院普通医学科学研究所父母捐款资助,KBRIN-AREA补助生在奖号5P20GM103436-13。我还要感谢田旭中博士实验室的我被介绍给这个技术和雷蒙德Pagliarini博士谁首先建立这种技术在许实验室。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
10X PBS (phosphate buffered saline) pH 7.2 stock solution Invitrogen, Sigma Aldrich
Chilled 1X PBS pH7.2 working solution Invitrogen, Sigma Aldrich Make fresh and refrigerate, can be used up to a week
Flynap Carolina Biologicals Fly anesthesia needed to anesthetize larvae
Fixative 0.1M PIPES, pH 7.2, 4% Paraformaldehyde Needed to fix the dissected cephalic complex
Ice Bucket Several Maintain solutions on ice. Also, dissect cephalic complex in chilled 1X PBS and then place on ice in an Eppendorf tube
1.7ml Eppendorf tube Various
Glass slides, cover glass Fisher Scientific
Vectashield Mounting Media or any other mounting media Vector Laboratories
Halocarbon 200 or 700 Oil Polysciences Inc. or Halocarbon.com Halocarbon 200 is used to mount the larvae for visualization on a fluorescence stereoscope
Sally Hansen "Hard as Nails" nail polish Can be found at any general merchandise store Needed to seal the edges of Coverslip
A Leica MZ16.5 fluorescence stereomicroscope or any other fluorescence stereomicroscope Leica and others Needed to observe the GFP fluorescence in larvae
Dumont #5 forceps Fine Science Tools
Pyrex 9 well spot plate or any other dissection dish Sigma Aldrich
Paint Brush Can be found at any general merchandise store
Table 1. Materials needed to perform the experimental protocol presented in this article.

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References

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