הדפסת תבניות היפוך Thermoresponsive ליצירת בדוגמת הידרוג דו רכיבים-תרבות תאי 3D

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bioprinter שימש ליצירה הידרוג דוגמת המבוסס על תבנית עולה. עובש poloxamer היה backfilled עם הידרוג'ל שני ולאחר מכן eluted, ומשאיר חללים שהיו מלאים בידרוג'ל שלישי. שיטה זו משתמשת elution המהיר וטוב של printability poloxamer לייצר ארכיטקטורות מורכבות מbiopolymers.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting הוא טכנולוגיה מתפתחת שמקורו בתעשיית אב הטיפוס והדגמים. תהליכי ההדפסה השונים ניתן לחלק לbioprinting קשר 1-4 (שחול, לטבול עט ויתוגרפיה הרכה), ללא מגע (העברה קדימה לייזר, מדפסות הזרקת דיו בתצהיר) 5-7 bioprinting וטכניקות מבוססות לייזר כגון שני photopolymerization פוטון 8. זה יכול לשמש ליישומים רבים כגון הנדסת רקמות 9-13, 14-16 microfabrication biosensor וככלי כדי לענות על שאלות בסיסיות ביולוגיות כגון השפעות של שיתוף culturing של תאים מסוגים שונים 17. בניגוד לשיטות photolithographic או רכת יתוגרפיות נפוצות, יש bioprinting חול יתרון שהוא אינו מחייב את מסכה נפרדת או בול. שימוש בתוכנות CAD, העיצוב של המבנה יכול להיות שונה במהירות ומותאם לפי הדרישות של המפעיל. זה עושה bioprinting גמיש יותר מבוסס יתוגרפיהגישות.

כאן אנו מדגימים את הדפוס של עובש ההקרבה ליצור מבנה 3D חומר רב באמצעות מערך של עמודים בתוך הידרוג'ל לדוגמא ירושלים. עמודים אלה יכולים לייצג מבנים חלולים לרשת כלי דם או את הצינורות בתוך צינור מדריך עצב. החומר שנבחר לעובש ההקרבה היה 407 poloxamer, פולימר thermoresponsive עם מאפייני הדפסה מעולים שהוא נוזלי על 4 מעלות צלזיוס ומוצקה מעל טמפרטורת gelation ~ 20 מעלות צלזיוס במשך 24.5% w / v 18 פתרונות. מאפיין זה מאפשר עובש ההקרבה מבוסס poloxamer להיות eluted על פי דרישה ויש לו יתרונות על פני הפירוק האיטי של חומר מוצק במיוחד עבור גיאומטריות צרות. Poloxamer היה מודפס על שקופיות זכוכית מיקרוסקופ כדי ליצור את התבנית העולה. Agarose הייתה pipetted לתוך התבנית ומקוררת עד gelation. לאחר elution של poloxamer במים קרים כקרח, את החללים בעובש agarose היו מלאים באלגינט methacrylate SPiked עם פיברינוגן המסומן FITC. החללים המלאים היו אז צולבים עם UV והמבנה היה צילמו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית.

Introduction

הנדסת רקמות גישות עשו התקדמות רבה בשנים האחרונות ביחס להתחדשות של רקמות ואיברים 19,20 אדם. עם זאת, עד עכשיו, את הפוקוס של הנדסת רקמות כבר לעתים קרובות מוגבל לרקמות שיש להם מבנה פשוט או ממדים קטנים כגון שלפוחית ​​21,22 או עור 23-25. גוף האדם, לעומת זאת, מכיל רקמות רבות תלת ממדיות מורכבות שבו תאים ומטריצה ​​תאית מסודרים באופן מוגדר במרחב. כדי לייצר רקמות אלה, נדרש טכניקה שיכולה למקם את תאים ופיגומי מטריקס בתוך מבנה תלת ממדים בעמדות שצוינו. יש Bioprinting את הפוטנציאל להיות כזה טכניקה שבו החזון של רקמות תלת ממדיות מורכבות ייצור יכול להתממש 10,11,26-28.

Bioprinting מוגדר "שימוש בתהליכי העברת חומר לדפוסים והרכבה ביולוגי relחומרי evant - מולקולות, תאים, רקמות, וbiomaterials מתכלה. - עם ארגון שנקבע לביצוע פונקציות ביולוגיות אחד או יותר "4 היא כוללת מספר טכניקות שונות שעובדים ברזולוציות שונות וקשקשת אורך, החל הרזולוציה תת מיקרון של שתיים פוטון פילמור 29 לרזולוציה של 150 מיקרומטר עד 420 מיקרומטר להדפסת חול 1,12,30. לא חומר יחיד או בשילוב חומר יהיה לספק את הדרישות של כל שיטה 31. לדפוס שחול, הפרמטרים העיקריים הם צמיגות וזמן gelation 32, שבו צמיגות גבוהה וgelation המהיר הם רצויות.

הדפסת 3D היא טכניקה המאפשרת יצירה קלה של תבניות ההקרבה ליצירת גיאומטריות מורכבות 30,33,34. תהליך זה מבוסס על הבנייה של תבנית בעזרת טכניקת דיגום מהירה כגון bioprinter חול. משמש עובש ההקרבה יצרליצירת מבנים מורכבים מחומרים שקשה להדפיס עקב הצמיגות הנמוכה שלהם וזמן gelation איטי. השיטה שהוצגה כאן כרוכה ביצירה של עובש ההקרבה בהיקף של חומר שמתמוסס במהירות בטמפרטורה נמוכה ויכולים להיות נמתח בצורה מדויקת. בלוק קופולימר פולי (אתילן גליקול) 99 פולי (פרופילן גליקול) 67 פולי (אתילן גליקול) 99 (הידוע גם בPluronic F127 או poloxamer 407) ממלא את הדרישות הללו. זה כבר נעשה שימוש בגרסה שונה בדפוס 1 חול, אבל, למיטב ידיעתנו, אף פעם לא הייתה בשימוש להדפסה בגרסתה ללא שינוי עקב חוסר היציבות שלה בסביבות נוזליות. Poloxamer 407 גם מראה התנהגות הפוכה תגובה תרמית 18 כלומר היא משתנה מג'ל לסול בקירור. והכי חשוב, זה יכול להיות מודפס למבנים מעוקלים באופן שרירותי מורכבים עם נאמנות גבוהה מאוד. זה מאפשר יצירה של הידרוג'ל מובנה מחומר בעל צמיגות נמוך, במקרה זה איטי gelling agarose, על ידי pipetting הפתרון לתוך תבנית ההקרבה המודפסת. שילוב של הדפסת עובש ההקרבה עם איכות גבוהה והמהיר שלה מelution הידרוג'ל המובנה casted עושה את זה בשיטה מהירה וגמישה ליצירת תבניות בגיאומטריות שונות, ללא שימוש במסכה או חותמת כפי שהוא נדרש לעתים קרובות בשיטות יתוגרפיות. הידרוג'ל המובנה casted יכול להיות מלא יותר בחומר אחר שאינו מתאים לדפוס שחול עקב הצמיגות הנמוכה שלה. זה במקרה שלנו פתרון methacrylate אלגינט צמיגות נמוך. כאן אנו מציגים את השיטה של ​​תבניות ההקרבה הפוכות thermoresponsive לדפוסי הידרוג'ל באמצעות הדוגמא של מערך אומנה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. הכנת תמיסת Poloxamer 407

אם זמין, לבצע את הכנת פתרון poloxamer בחדר קר (4 מעלות צלזיוס). אם אינו זמין, הנח בקבוק זכוכית בכוס מלאה במים קרים כקרח. בטמפרטורות גבוהות יותר poloxamer יהיה מעל נקודת ג'ל ולא מתמוסס כמו שצריך.

  1. הוסף 60 מ"ל של פתרון PBS הקר קרח לתוך בקבוק זכוכית ומערבבים נמרצות באמצעות stirrer מגנטי.
  2. שוקל 24.5 גרם poloxamer ולהוסיף אותו בכמויות קטנות לPBS הקר. חכה עד poloxamer נמס באופן חלקי לפני שמוסיף עוד.
  3. מערבבים עד שכל פתרון poloxamer נמס.
  4. הוסף PBS הקר עד נפח סופי של 100 מ"ל הוא הגיע. הריכוז הסופי יהיה 24.5% w / נ
  5. תפסיק לבחוש את הפתרון ולתת לו לנוח על 4 מעלות צלזיוס עד לבועות וקצף בתמיסה נעלמה. בועות שכלואות בתוך ג'ל תועברנה לעמrinter מחסנית ותוביל לפגמים בתבניות ההקרבה המודפסות.
  6. מסנן (פילטר 0.22 מיקרומטר) הפתרון ישירות לתוך מחסנית ההדפסה כדי להסיר את כל חלקיקים הלא רצויים שעלולות לסתום את המחט. צעד הסינון צריכה להתבצע בחדר קר (או אם אינו זמין עם טיפים התקררו, מסנן וכו '), כדי למנוע gelling של poloxamer במסנן. שמור את המחסנית הטעונה ב4 מעלות צלזיוס עד 30 דקות לפני הניסוי.

2. הכנה של מדפסת 3D

מדפסת 3D בשימוש בעבודה זו הייתה "החרושת הביולוגית" מregenHU. חלק החול של המערכת מורכבת ממספר חלקים. מחסנית בלחץ בחלקו העליון מחוברת למחבר באמצעות מתאם luer נעילה. המחבר מגשר על רווחים שבין השקע של המחסנית ואת כניסתו של שסתום סולנואיד. בנקודת היציאה של שסתום סולנואיד, ניתן להשתמש במחטים בקטרים ​​שונים. החומר הנמתח על תתאסטרטגיות המתקיים לבמה נעה על ידי ואקום. החלקים העיקריים של המערכת מתוארים באיור 1. מערכות המבוססות על חול אחרות יכולות לשמש לתהליך ההדפסה, ותהליך האופטימיזציה שצריך לעשות עבור כל מערכת.

  1. הנח את שסתום סולנואיד (מ"מ קוטר נחיר 0.3) ואת המחט (מ"מ פנימי קוטר 0.15) במבחנות 1.5 מ"ל הנפרדים מלאות במי ultrapure ולמקם אותם באמבטיה קולית מחוממת לנקות למשך 30 דקות. יש לשטוף את השסתומים ניקו עם אתנול ולייבש אותם עם אקדח חנקן.
  2. התקן את השסתום ומחט במדפסת וכן מחסנית ריקה, נקי.
  3. החל לחץ 3 בר למערכת ולפוצץ את כל נוזלים שיורית מהשסתום המותקן והמחט עם אוויר דחוס. לקטרי מחט קטנים, מומלץ להיות (נפוץ מזרק מסנן, גודל נקבובית מיקרומטר 0.45) מסנן מותקן ביציאה של האוויר הדחוס, כדי למנוע כניסה של חלקיקים קטנים שיכול לסתום את המחט. הפעל את הלחץ ולהתקין את המחסנית טעונה עם poloxamer. את המחסנית יש להוציא מהמקרר כ -30 דקות לפני שעלתה למחסנית כך poloxamer יכול להגיע לטמפרטורת חדר וג'ל.
  4. החל לחץ הבר 3 למערכת ולוותר poloxamer עד שהוא מגיע לקצה המחט והנמתח בגדיל רציף.

3. אופטימיזציה של פרמטרי ההדפסה

כדי ליצור מבני 3D מדויקים, יש לו את תהליך ההדפסה להיות מותאם לחומר והריכוז שנבחר. בהתאם למערכת הדפסת 3D הצמיגות וכל חומר יניבו נפח מסוים מחלק ועובי קו לסט קבוע של פרמטרים.

  1. עם תוכנה מתאימה CAD (מסוגל ליצור קבצי ISO מהציורים), לצייר קו אחד בערך באותו אורך כמו המבנה שבכוונתך להדפיס.
  2. הנח זכוכית שקופית מיקרוסקופ 25 מ"מ x 75 x 1 מ"ממ"מ או כל מצע אחר במדפסת ולאבטח אותו על ידי הפעלת הוואקום.
  3. בתוכנת המדפסת, הגדר את שסתום סולנואיד לתדירות גבוהה של 50 הרץ ולהגדיר לחץ גבוה של 3 בר.
  4. להדפיס שכבה אחת של שורה אחת עם מהירות שלב של 300 מ"מ / דקה.
  5. להפחית את הלחץ עד שיגיע לרוחב הקו הרצוי. ניתן גם לשלוט בעוצמת הקול נמתחת דרך זמן הפתיחה של השסתום.
  6. להפחית את התדירות של השסתום ניתן להדפיס עד אין קו רציף יותר. בחר תדירות מעל ערך זה.

הערה: ברגע שרוחב הקו הרצוי והקווים רציפים מושגות, לקבוע את מהירות שלב האופטימלית ועובי שכבה כלומר ההרמה של המחט אחר שכבה מודפסת אחד.

  1. להדפיס כמה שכבות על גבי זה ולראות אם המחט היא במיקום הנכון מעל השכבה הקודמת לאחר כמה שכבות מודפסות. התאם את עובי השכבה (הרמת מחט ), כך שכל שכבה מודפסת על גבי הבא (איור 3).
  2. להקטין את מהירות שלב השלב מ300 מ"מ / דקה צעד חכמה, כך ששכבות extruded מתחילות ומסתיימים באותן העמדות כמו קודמיו (איור 4). מהירויות בשלב גבוהות מדי יגרמו לבמה כדי להיות מרגשות לפני החומר נמתח נגע השכבה הקודמת.
  3. להדפסת עמוד המבנים בצע את פעולות 3.1.-3.8., אבל במקום ציור קו בודד לצייר נקודה אחת. הפרמטרים להתמקד בעת הדפסת עמודי התווך הם לחץ (מסדיר עובי שכבה וקוטר עמוד תווך של poloxamer), זמן של שסתום הפתיחה (נפח נמתח) וזמן מגוריו של ראש ההדפסה במצב שבו צריך להיות מופקד העמוד .
  4. כאשר הפרמטרים מותאמים, הדפסת מספר שכבות של קו צריכה לגרום לקיר מוצק, או במקרה של נקודות, עמוד. שמור את הפרמטרים לשימוש מאוחר יותר.

> 4. הדפסה וElution של עובש ההפוך

השתמש בפרמטרים שנמצאו במהלך הליך אופטימיזציה מנקודה זו ואילך.

  1. הדפס את המבנה הפנימי (כאן זה מערך אומנה) בשקופית מיקרוסקופ זכוכית ולתת לו להתייבש במשך הלילה. זו) מקטין את הגודל ועובי של המבנים וב) מספק הידבקות טובה יותר בין המבנה והמצע, ולכן ההמראה במהלך למלא את המשבצות ניתן להימנע מכך.
  2. עם תוכנת ה-CAD, לצייר מבנה שמורכבת מקיר חיצוני המקיף את המבנה בכוונתך להביא eluted משם ומילא. הדפס את המבנה עם poloxamer. ההדפסה של הקיר תיקח 6 דקות.

שים לב: יש הקיר שיודפס לפחות 3.5 מ"מ מהמבנה הפנימי בגלל הממדים של המחט. אחרת ההדפסה של הקיר החיצוני תהרוס את המבנה הפנימי

  1. הכן את הפתרון הרצוי למילוי Sacrעובש ificial עם (כאן 1% agarose במי deionized). פתרון agarose צריך טמפרטורה בין 35 ° C ו 45 ° C. מתחת לטמפרטורה זו, agarose תהיה לגבש במהירות רבה מדי; מעל טמפרטורה זו, זה עלול להרוס את העמודים המודפסים בגלל מבנה poloxamer יהיה לרכך.
  2. לאט לאט למלא את התבנית עם הקרבת הפתרון למלא את המשבצות בעזרת פיפטה. זה צריך להיעשות באיטיות כדי למנוע הרס של המבנה בתוך הקיר.
  3. בואו ג'ל פתרון backfilled או crosslink זה תלוי בפולימר בשימוש. במקרה של agarose המיצוק התקיים ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  4. מניחים את התבנית בהקרבת backfilled באמבט קרח למשך 10 דקות לelute מבנה poloxamer.
  5. תמחה את מבנה backfilled עם ממחטת נייר ומניח אותו על שקופית מיקרוסקופ זכוכית חדשה. לחץ על המבנה בזהירות לשקופית מיקרוסקופ הזכוכית, כדי למנוע דליפה של הידרוג'ל השלישי מהחלל אל תוך החלל שביןמבנה backfilled ושקופיות מיקרוסקופ זכוכית.

5. מילוי של חללים

  1. כדי למלא את החללים שהותירו poloxamer eluted, למלא פתרון הפולימר המיועד לתוך מזרק מצויד ב30 G מחט. בדוגמה זו, השתמשנו methacrylate אלגינט 1% בתמיסת 0.15 M NaCl עם התוספת של 0.05% W / V ליתיום פניל-2-,4,6 trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ו -2.5%, 488 אלקסה פיברינוגן מצומדות V / V של . פיברינוגן מצומדות Alexa-488 נוספו למטרות הדמיה.
  2. Photopolymerize הפולימר עם מנורת UV בעוצמה גבוהה (100 ואט, 365 ננומטר, מרחק ממצע היה 3.5 ס"מ) במשך 5 דקות ולבנות תמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית או confocal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

התוצאות המייצגות מראות כי טכניקת העובש ההפוכה (מתואר באיור 2) תיצור ג'ל מובנה שיכול להיות מלא בחומר שני. בתחילתו של כל תהליך הדפסת פרמטרי ההדפסה מותאמים ראשון. התאמות צעד חכמות של הפרמטרים יגרמו למבנים רבים שכבתיים מודפסים המתוארים באיור 3 ואיור 4 כאשר קווים בודדים מודפסים. אם עובי השכבה (הרמת המחט אחר שכבה מודפסת אחד) הוא נמוך מדי, אחד לא רואה שהמחט תהיה לגעת בשכבות הקודמות. אם המחט היא גבוהה מדי, דפוס גל על ​​פני השטח של המבנה המודפס יופיע. ניתן לראות זאת בציורי A3-3D, שבו כל השכבה נבדקה עוביים היו גדולות מדי עבור מהירות השלב נתון. בגלל מהירות שלב גבוהה מקטינה את עובי השכבה, הבדלים קטנים בין הסט ועובי השכבה בפועל מצטברים ודפוס הגל מתחיללהופיע כגובה של העליות לבנות. על ידי הפחתת עובי השכבה, ההבדלים נעשים קטנים יותר ודפוס הגל מופיע במיקום גבוה יותר מאשר קודם לכן (מסומן על ידי הקווים מקווקווים באיור 3 ג ואיור 3D). לעובי שכבה קבוע, אם המהירות היא השלב מהר מדי זה יביא גם בדפוס גל או במבנים שצרים לכיוון החלק העליון ויש לי בליטה בתחילת (הקצה הימני של המבנה המודפס) כפי שמוצג במבנה איורים 4 א-4C. פרמטרים אופטימליים עבור poloxamer היו זמן פתיחה של 0.2 אלפיות שנייה, בתדירות של 31.14 הרץ, עובי שכבה של 0.15 מ"מ, לחץ של 1.5 בר ומהירות של 75 מ"מ / דקה. הדפסה עם פרמטרים אלה הביאה לקירות מוצקים חלקים כמו באיור 4D. עם זאת, מהירות שלב גבוהה יותר של 100 מ"מ / דקה נבחרה לתהליך כדי לצמצם את זמן הייצור של הקירות.

עם פרמטרים אופטימליים עבור piהדפסת llar (זמן פתיחת 0.2 אלפיות שני, בתדר 31.14 הרץ, עובי שכבה 0.08 מ"מ, בר לחץ 1.5, מהירות 200 מ"מ במה / דק ', זמן תושבות 0.3 שניות) יצרנו מערך של עמודים כפי שמוצג באיור 5 א. השפעות ייבוש של מערך האומנה הסתיימו בכיפוף מעמודי התווך לכיוון המרכז. ניתן להפחית את האפקט הזה, אך לא נמנע, על ידי הצבת העמודים נוספים חוץ מזה. קיר אז סביב עמודים מודפסים כפי שמוצג באיור 5.

לאחר elution של עובש poloxamer ההקרבה במים קרים, הידרוג מובנה agarose כמו זו שמוצגת באיור 5 ג נוצרו. לאחר מילוי החללים עם פתרון ניאון אלגינט methacrylate וcrosslinking לאחר מכן, מערך אומנה הידרוג'ל ב-הידרוג'ל חדשני כמו זו שמוצגת באיור 6 יכולה להתבצע. שיקום Z-מחסנית 3D ממחיש באופן ברור את עמודי הניאון שנוצרו. איור 7 > חזק ממחיש את האפשרות של טכניקה זו גם כדי ליצור תבניות באופן שרירותי מעוקלות.

איור 1
איור 1. תיאור של bioprinter.) תמונה של "החרושת הביולוגית" bioprinter. המחט והשסתום אינם גלויות לעין בתמונה הזאת, אבל הם מתוארים בבוקר). עד 8 ראשי הדפסה הם רכובים על צריח של הפיכת המאפשר אחד כדי לשנות במהירות בין חומרים. ההדפסה נעשית על במה מרגשת שניתן להעביר בX-, Y ו-Z-כיוון. לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
איור 2. ערכה של תהליך הייצור של תבניות להקרבה עבור הייצור של הידרוג מובנה.

איור 3
איור 3. עובי השכבה אופטימיזציה. שכבות Poloxamer המודפסות במהירות במה קבועה (250 מ"מ / דקה) עם הירידה בעובי שכבה. כאשר עובי השכבה הוא גבוה מדי, דפוס גל עולה. זו נעלמת בהדרגה עם הירידה בעובי שכבה. הקווים האדומים בצבע האחיד מצביעים על החלק התחתון של המבנה המודפס ואילו הקווים המקווקווים האדומים מציינים את הגובה של חלק החופשי הפגם במבנה המודפס. שכבת עוביים הם 0.18 מ"מ), ב ') 0.16 מ"מ C) מ"מ 0.15 ו-D) 0.13 מ"מ. הבר האדום מציין 2 מ"מ.

"> איור 4
איור 4. שלב מהירות אופטימיזציה. שכבות Poloxamer מודפסות בעובי שכבה של 0.15 מ"מ עם מהירויות שונות של שלב מ"מ / דקה) 250, ב) 200 מ"מ / דקה, ג) 150 מ"מ / דקה ו-D) 75 מ"מ / דקה. על ידי הורדת מהירות הבמה, את נקודת ההתחלה של תהליך ההדפסה היא עבור כל השכבות ויכול להיות מודפס קיר מוצק. הבר האדום מציין 2 מ"מ.

איור 5
איור 5. ייצור של הידרוג דוגמת. מערך אומנה) של poloxamer המיובש עם עמודים מופרדים 1.75 מ"מ אחד מהשני. הכיפוף מעמודי התווך נגרמת על ידי ייבוש אפקטים. ב ') מערך נדבך מוקף חומה עשויה poloxamer לפני pipetting agarose. C) מובנההידרוג'ל agarose לאחר הסרת עובש ההקרבה.

איור 6
איור 6. שחזור 3D Z-מחסנית של עמודים שכותרתו fluorescently מוטבע בפיגום agarose.

איור 7
איור 7. מעגלים מודפסים מpoloxamer. יחיד שכבות גלויות. הבר האדום מציין 2 מ"מ.

קריטריונים לעיצוב פרמטר הדפסה
עובי שכבת פיינר
  • לחץ ↓
  • מהירות שלב ↑
  • זמן פתיחת ↓
  • תדר ↓
עובי קו קטן יותר
  • לחץ ↓
  • מהירות שלב ↑
  • זמן פתיחת ↓
  • תדר ↓
חול רציף
  • לחץ ↑
  • מהירות שלב ↓
  • זמן פתיחת ↑
  • תדר ↑
מהירות בנייה מהר יותר
  • לחץ ↑
  • מהירות שלב ↑
  • זמן פתיחת ↑
  • תדר ↑

טבלת מס '1. ארבעה פרמטרים עיצוב להבלטה של קווי poloxamer וכיצד הם יכולים להיות מושפעים מפרמטרים הדפסה שונים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כאן אנו מציגים, בפעם הראשונה, השימוש בפולימר thermoresponsive לעובש ההקרבה שניתן eluted במהירות במים קרים בשל המעבר ג'ל סול של poloxamer של ~ 20 ° C. המהירות של התהליך כולו הופכת למעניינת poloxamer יצירה המהירה של מבני biopolymer שלא ניתן להדפיס ברזולוציה מספקת. הטכניקה שתוארה כאן יכולה לשמש לדפוסי הידרוג'ל אחד בתוך הידרוג'ל אחר או ליצירת ערוצי microfluidic כפי שכבר דווח בעבר לחומרים אחרים 35. היתרון של poloxamer כעובש ההקרבה הוא שזה יכול להיות מודפס בגיאומטריות שרירותיות לתוך מבני שכבה אחר שכבה מוצקות שיכול להיות מלא וeluted לאחר מכן.

אנו מתארים כאן את התהליך של יצירת עובש ההקרבה עם poloxamer עם למלא את המשבצות הבאות של הידרוג'ל שני כדי ליצור הידרוג מובנה. החומר לידרוג'ל המובנה יכול להיות chOsen עם מגבלות בכל הקשור לצמיגות וטמפרטורה בנקודת המילוי. פתרונות מבשר צמיג נמוכים של פולימרים נפוצים כגון פוליאתילן גליקול 36,37 diacrylate, אלגינט 38,39, 40 וagarose biopolymers methacrylated 41-43 הם רק כמה דוגמאות לחומרי מילוי מתאימים. חומרים צמיג גבוהים אך לא יכולים למלא גיאומטריות צרות או יכולים להרוס את תבנית ההקרבה במקרה של מבנים דקים שבירים כגון העמודים מודפסים כאן. פתרון agarose אחוז נמוך ולכן נבחר ללמלא את המשבצות. יתרון נוסף של שימוש בשילוב עם agarose poloxamer הוא שזה ג'לים על ידי קירור. לכן, כאשר טבלו במים קרים, agarose ג'ל שומר המדינה שלו, מדינה שמשקפת במדויק את דפוס poloxamer הודפס ההפוך.

הצעדים החשובים בהליך זה כרוך באופטימיזציה של פרמטרי ההדפסה, מילוי של העובש וההקרבהמילוי החללים. פרמטרי הדפוס שהיו מותאמים תדירות וזמן פתיחה של השסתום, הלחץ, מהירות במה ועובי השכבה. עובי השכבה מוגדר כמתיחה של המחט לאחר כל שכבה מודפסת. במקרה של העמודים, זמן התושבות, כלומר את חומר הזמן הנמתח על נקודה מבלי להזיז את הבמה, גם להיות מותאם. תהליך אופטימיזציה יכול להיות זמן רב, כי שינויים בפרמטר אחד יכולים להיות השפעה על מספר פרמטרים עיצוב של הקווים המעוקמים. הפרמטרים המרכזיים לקריטריוני עיצוב שונים מתוארים בטבלה 1.

הצעד החשוב השני בתהליך הוא המילוי של עובש ההקרבה. המילוי של עובש ההקרבה הוא צעד עדין. מבנים קטנים וצרים צריכים להיות מלאים בזהירות, לעתים קרובות באופן ידני, וליהוק של פתרונות פשוטים עלול להיות לא תמיד אפשרי.

מילוי קפדני של יםעובש acrificial עם agarose לפיכך בוצע באמצעות פיפטה μl 100 כדי למנוע הרס מעמודי התווך. השלב האחרון, מילוי החללים, נדרש שימוש במזרק מצויד ב30 G מחט. יש להקפיד להימנע מהיווצרות בועה בעת המילוי.

בג'לים שונה במבנה שהוצג כאן יכול להכיל גם תאים. על ידי הצבת סוג תא אחד בידרוג בתוך החללים וסוג תא אחר בתוך הידרוג'ל המובנה, ניתן ליצור הגדרת תרבות משותפת מוגדרת במרחב. ביניהם רשת 3D כמו בפרסום ממילר ואח'. -30, רשתות כלי דם או עצביות הן גם אפשרית. גישה אפשרית לרשתות כאלה תהיה להדפיס קווים בתוך חומה המקיפה ולמלא את החללים עם הידרוג'ל השני, crosslink הידרוג'ל השני ולהמשיך בהדפסה לסובב השכבה הבאה ב -90 מעלות. היתרון של הדפוס poloxamer כעובש ההקרבה הוא שזה לא מחייבעובש אב או מסכה. היא גם אינה דורשת ראש הדפסה מחוממת לextrude החומר והסתימה של המערכת לא נצפה בניסויים שלנו.

מבנים כגון אלה שהוצגו כאן עשויים לשמש בעתיד כ3D ​​מאורגן מרחבית שיתוף תרבויות ללמוד תאי תאי אינטראקציות מבוססות דיפוזיה או לגילוי סמים. עם זאת, גרסה אוטומטית לחלוטין של ההליך שהוצגה כאן צריכה להיות מפותחת כדי להצליח בתחום הקרנת סמים.

לסיכום, יש לנו הצגתי את שיטה המאפשרת הדפסה של גיאומטריות שרירותיות שיכול להיות מלאה עם הידרוג וeluted לאחר מכן. בדרך זו, ניתן ליצור ארכיטקטורות הידרוג'ל ב-הידרוג'ל המובנים בצורה ישירה וחסכונית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

יש המחברים מה להצהיר.

Acknowledgments

אנו מודים לדבורה Studer לעזרה עם bioprinter.

העבודה מומנה על ידי תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013) תחת הסכם המענק N ° NMP4-SL-2009-229,292.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics