Desenli ve Yaratılış 3D Hücre Kültürü için iki bileşenli Hidrojeller için Thermoresponsive Ters Kalıpları Baskı

Immunology and Infection

Your institution must subscribe to JoVE's Immunology and Infection section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

 

Summary

Bir bioprinter bir kurban kalıp dayalı desenli hidrojeller oluşturmak için kullanıldı. Poloksamer kalıp ikinci bir hidrojel ile dolduruldu ve daha sonra üçüncü bir hidrojel ile doldurulmuş boşluklar bırakarak elüt edilmiştir. Bu yöntem Biyopolimerlerin karmaşık mimarileri oluşturmak için hızlı sağım ve poloksamerin iyi baskı kullanır.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations | Reprints and Permissions

Müller, M., Becher, J., Schnabelrauch, M., Zenobi-Wong, M. Printing Thermoresponsive Reverse Molds for the Creation of Patterned Two-component Hydrogels for 3D Cell Culture. J. Vis. Exp. (77), e50632, doi:10.3791/50632 (2013).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Bioprinting hızlı prototipleme sektöründe kökeni olan bir gelişmekte olan bir teknolojidir. Farklı baskı süreçleri temas bioprinting 1-4 (ekstrüzyon, daldırma kalem ve yumuşak litografi), temassız bioprinting 5-7 (lazer ileri transferi, mürekkep püskürtmeli birikimi) ve bu iki foton fotopolimerizasyon 8 olarak lazer tabanlı teknikler ayrılabilir. Bu tür farklı hücre tipleri 17 ko-kültür etkileri gibi temel biyolojik sorulara cevap vermek için bu gibi doku mühendisliği 9-13, biyosensör mikroüretim 14-16 gibi bir araç olarak bir çok uygulama için kullanılabilir. Ortak fotolitografik veya yumuşak-taş baskı yöntemlerinin aksine, ekstrüzyon bioprinting ayrı bir maske ya da damga gerektirmeyen bir avantaja sahiptir. CAD yazılımı kullanarak, yapının tasarımı hızla operatörün gereklerine göre değiştirilebilir ve ayarlanabilir. Bu litografi tabanlı daha esnek bioprinting yaparyaklaşımlar.

Burada örnek olarak bir hidrojel içinde ayağı bir dizi kullanarak bir çok malzeme 3D yapısı oluşturmak için bir kurban kalıp baskı göstermektedir. Bu yapı taşları bir sinir kılavuz kanalı içinde bir damar ağı veya tüpler için içi boş yapılarının temsil edebilir. Geçici kalıp için seçilen malzeme poloksamer 407, 4 sıvıdır mükemmel baskı özelliklerine sahip bir polimer thermoresponsive ° C idi ve jelleştirme sıcaklığının üzerinde bir katı madde ~ 20 ° C'de% 24,5 ağırlık / hacim çözümler 18. Bu özellik, poloksamer dayalı geçici kalıp talep üzerine akıtılan olmasını sağlar ve özellikle dar geometrileri için, bir katı maddenin yavaş çözünme üzerinde avantajlara sahiptir. Poloxamer kurban kalıp oluşturmak için mikroskop cam slaytlar basılmıştır. Agaroz kalıp içine pipetlenir ve jelleştirme kadar soğutuldu. Buz gibi soğuk suda poloksamer elüsyon sonra, agaroz kalıp boşlukları aljinat metakrilat sp ile doldurulmuşturFITC etiketli fibrinojen ile iked. Dolu boşluklar daha sonra UV ile çapraz bağlantılı olduğu ve yapı bir epi-floresan mikroskop ile görüntülendi.

Introduction

Doku mühendisliği yaklaşımları insan doku ve organları 19,20 rejenerasyonu ile ilgili olarak son yıllarda çok ilerleme kaydettik. Bununla birlikte, şimdiye kadar, doku mühendisliği odak çoğu zaman basit bir yapı ya da mesane 21,22 ya da deri 23-25 ​​kadar küçük boyutlara sahip doku ile sınırlı kalmıştır. Insan vücudu, ancak, hücreler ve hücre dışı matris bir uzamsal tanımlanmış bir şekilde düzenlenmiş çok sayıda karmaşık üç boyutlu bir doku içerir. Bu dokuların üretimi için, bir teknik belirtilen pozisyonlarda üç boyutlu bir yapı içinde hücre ve hücre dışı matriks iskele yerleştirebilirsiniz gereklidir. Bioprinting üretim karmaşık üç boyutlu dokuların vizyonu 10,11,26-28 gerçekleştirilebilir böyle bir tekniği olma potansiyeline sahiptir.

Bioprinting desenlendirme için malzeme transferi süreçlerinin kullanımı "olarak tanımlanan ve biyolojik rel montaj olduğunuteknisyenleri tarafından, geçerli malzemeler - moleküller, hücre, doku ve biyolojik biyomalzemeler -. bir veya daha fazla biyolojik fonksiyonları "4 gerçekleştirmek için bir reçete kuruluşla Birkaç farklı teknikler kapsar iki alt mikron çözünürlüklü kadar farklı çözünürlüklerde ve uzunluk ölçüleri, az çalışan ekstrüzyon baskı 1,12,30 için 420 mikron 150 mikron bir çözünürlük foton polimerizasyon 29. Tek bir malzeme veya malzeme kombinasyonu her yöntemin 31 gereksinimlerini tatmin edecek. ekstrüzyon baskı için, anahtar parametreleri viskozite ve jelleşme zaman vardır Yüksek viskozite ve hızlı jelleşme arzu 32,.

3D baskı karmaşık geometrileri 30,33,34 oluşturmak için kurban kalıp kolay oluşturulmasını sağlayan bir tekniktir. Bu işlem, bir ekstrüzyon bioprinter gibi bir hızlı prototip tekniği kullanılarak bir kalıbın yapımında dayanmaktadır. Oluşturulan kurban kalıp kullanılırOnların düşük viskoziteli ve yavaş jelleşme süresi nedeniyle yazdırmak için zor malzemelerden kompleks yapılar oluşturmak için. Burada sunulan yöntem, düşük bir sıcaklıkta hızlı bir şekilde çözünür ve doğru bir şekilde ekstrüde edilebilir bir malzemeden oluşan bir geçici kalıp oluşturulmasını içerir. Blok kopolimer, poli (etilen glikol) 99-poli (propilen glikol), 67-poli (etilen glikol) 99 (aynı zamanda Pluronic ® F 127 veya poloksamer 407 olarak da bilinir), bu gereksinimleri yerine getirmektedir. Zaten bildiğimiz kadarıyla, sıvı ortamlarda kendi istikrarsızlık nedeniyle değiştirilmemiş sürümünde yazdırmak için hiç kullanılmamış, ekstrüzyon baskı 1 değiştirilmiş bir versiyonu kullanılmıştır ama olmuştur. Poloksamer 407, aynı zamanda, ters termal duyarlı davranış, 18, ​​yani soğutma üzerine bir sol bir jelden bu değişiklikleri gösterir. En önemlisi, çok yüksek sadakat karmaşık keyfi kavisli yapılarına yazdırılabilir. Bu sayede, bir yapısal bir hidrojel oluşturmaDüşük viskoziteli bir madde, bu durumda yavaş jelleşen agaroz, basılı geçici kalıp içine çözeltisi pipetleme. Yüksek sadakat ve döküm yapılandırılmış hidrojel gelen onun hızlı elüsyon bir maske ya da sık sık taşbaskı yöntemleri gerekli olduğu gibi bir damga kullanmadan farklı geometri ile kalıp oluşturmak için hızlı ve esnek bir yöntem yapar ile kurban kalıp baskı kombinasyonu. Dökülmüş yapısal hidrojel daha da düşük viskozite nedeniyle ekstrüzyon baskı için uygun değildir başka bir malzeme ile doldurulabilir. Bu bizim durumumuzda bir düşük viskoziteli aljinat metakrilat çözümdür. Burada bir ayağı dizinin örneğinde hidrojel desenlendirme için thermoresponsive ters kurban kalıp yöntem mevcut.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Poloxamer 407 karışımların hazırlanması

Mevcut ise, soğuk bir odada (4 ° C) 'de poloksamer çözeltinin hazırlanması gerçekleştirin. Mevcut değilse, buz gibi soğuk su ile dolu bir beher cam bir şişe yerleştirin. Daha yüksek sıcaklıklarda poloksamer, jelleşme noktasının üzerinde olacak ve düzgün bir şekilde çözülür olmayacaktır.

  1. Bir cam şişe içine buz gibi soğuk PBS çözeltisinden 60 ml ilave edilir ve manyetik bir karıştırıcı kullanılarak kuvvetli bir şekilde karıştırılır.
  2. Poloksamer 24.5 gram ağırlığında ve soğuk PBS için küçük miktarlarda ekleyin. Poloksamer kısmen daha eklemeden önce çözünmüş kadar bekleyin.
  3. Tüm Poloksamer çözünmüş kadar çözüm karıştırın.
  4. 100 ml 'lik bir son hacim elde edilene kadar soğuk PBS ile ekleyin. Nihai konsantrasyon% 24.5 w / v olacak
  5. Çözüm karıştırma durdurun ve ° C çözümünde kabarcıklar ve köpük kadar yok oldu 4 de bekletin. Jel içinde sıkışıp kalırlar Bubbles p aktarılırrinter kartuş ve basılı kurban kalıplara kusurları yol açacaktır.
  6. Filtre (0.22 mikron filtre) İğne yapışmasına neden olabilir istenmeyen parçacıkları çıkarmak için doğrudan baskı kartuşunun içine çözüm. Filtreleme adımı filtrede poloksamer jelleşme önlemek (ya da değilse, soğutulmuş uçlarına, filtre vs ile temin edilebilir) soğuk bir odaya yapılmalıdır. ° C kadar 30 dakika deney önce 4 de yüklü kartuşu dışarıda tutun.

2. 3D Printer hazırlanması

Bu çalışmada kullanılan 3D yazıcı regenHU gelen "biyo" oldu. Sistemin çekme kısmı birkaç bölümden oluşmaktadır. En iyi bir basınç altında, kartuşun Luer-kilit adaptörü üzerinden bir konektöre bağlanmıştır. Bağlayıcı, kartuşun çıkış ve bir solenoid valf girişi arasındaki boşluk köprü oluşturur. Solenoid valfinin çıkışında, farklı çaplarda iğneler de kullanılabilir. Malzeme bir alt üzerine haddelenmektedirvakum bir hareket aşamasına düzenlenen olduğunu tedir. Sistemin büyük parçaları Şekil 1 'de tasvir edilmiştir. Diğer ekstrüzyon tabanlı sistemler baskı işlemi için kullanılan ve optimizasyon süreci her sistem için yapılması gereken edilebilir.

  1. Ultra saf su ile doldurulmuş ayrı bir 1.5 ml'lik test tüpü içine selenoid valf (meme çapı 0,3 mm) ve iğne (iç çap 0.15 mm) yerleştirin ve 30 dakika için temizlemek için ısıtılmış bir ultrasonik banyosuna koyun. Etanol ile temizlenmiş vanalar durulayın ve bir azot silahla kurulayın.
  2. Vana ve iğne yazıcı hem de boş, temiz kartuşu takın.
  3. Sisteme 3 bar basınç uygulayın ve basınçlı hava ile yüklü vana ve iğne herhangi bir kalıntı sıvı dışarı darbe. Küçük bir iğne çapları için, iğne tıkayabilecek küçük partiküllerin girişini önlemek için basınçlı hava çıkış filtresi monte edilmiş bir (ortak bir şırınga filtresi, 0.45 mikron gözenek boyutu) olması tavsiye edilir. Poloksamer yüklü kartuş basınç kapatın ve yükleyin. Poloksamer, oda sıcaklığında ve jel ulaşmak, böylece kartuş, kartuş montaj önce soğutma yaklaşık olarak 30 dakika üzerinden alınmalıdır.
  4. Sisteme 3 bar basınç uygulayın ve iğne ucu ulaşır ve sürekli bir iplikçik haddelenmiş kadar Poloksamer dağıtmak.

3. Baskı Parametreleri optimizasyonu

Doğru 3D yapılar oluşturmak için, yazdırma işlemi seçilen malzeme ve konsantrasyon için optimize edilmiş olması gerekir. Viskozite ve 3D baskı sistemine bağlı olarak her bir malzeme parametreleri sabit bir dizi için özel bir dağıtım hacmi ve çizgi kalınlığı verecektir.

  1. Uygun bir CAD yazılımı (çizimler ISO dosyaları oluşturmak mümkün) ile, yazdırmak düşündüğünüz yapı olarak aynı uzunlukta hakkında tek bir çizgi çizin.
  2. Bir mikroskop cam slayt 25 mm x 75 mm x 1 yerleştirinmm veya yazıcı başka bir yüzey ve vakum açarak sabitleyin.
  3. Yazıcı yazılımında, 50 Hz yüksek frekans için selenoid valf ayarlayın ve 3 bar yüksek basınç ayarlayın.
  4. 300 mm / dak bir sahne hızı ile tek bir satır bir kat yazdırın.
  5. İstenen çizgi genişliği ulaşana kadar baskıyı azaltmak. Ayrıca vananın açma süresi ile çekilmiş olan ses kontrol edebilirsiniz.
  6. Hiçbir sürekli hat artık basılabilir kadar valf sıklığını azaltmak. Bu değerin üzerinde bir frekans seçin.

Not: İstediğiniz çizgi genişliği ve sürekli çizgiler elde edildikten sonra, bir basılı katman sonra en uygun sahne hızı ve iğne kaldırma yani tabaka kalınlığı belirler.

  1. Her üst üste birkaç kat yazdırın ve iğne çeşitli basılı katmanları sonra önceki katman üzerinde doğru pozisyonda olup olmadığını görmek. Tabaka kalınlığı (iğne asansör ayarlayın) Her bir katman bir sonraki (Şekil 3) üzerine basılı olduğu.
  2. 300 mm / haddelenmiş katmanları öncekilerin (Şekil 4) ile aynı pozisyonlarda başlangıç ​​ve bitiş böylece dk adım adım gelen sahne sahne hızını azaltmak. Çok yüksek sahne hızları ekstrüde malzeme Önceki katmana dokundu önce sahne hareket neden olur.
  3. Yazdırmak için ayağı yapılar. Adımları 3.1.-3.8 takip, ancak bunun yerine tek bir çizgi çizerek tek bir noktadan çizin. Sütunlar yazdırırken odaklanmak parametreler ayağı yatırılması gereken konumda baskı kafasının basıncı (tabaka kalınlığı ve poloksamerin ayağı çapı düzenleyen), vananın açılması zaman (haddelenmiş hacim) ve ikamet zaman vardır .
  4. Parametreleri optimize zaman, bir çizgi birkaç kat baskı sağlam bir duvar, ya da noktaları, bir ayağı durumunda sonuçlanmalıdır. Daha sonra kullanmak için parametreleri kaydedin.

Bu noktadan itibaren optimizasyon işlemi sırasında bulunan parametreleri kullanın.

  1. Bir cam mikroskop lamı üzerine iç yapısı (burada bir ayağı dizidir) yazdırın ve gece kurumaya bırakın. Bu a) yapı büyüklüğü ve kalınlığını azaltır ve b) önlenebilir havalanma dolgu sırasında, bu nedenle yapı ve substrat arasında daha iyi bir yapışma sağlar.
  2. CAD yazılımı ile, uzak yıkandı ve doldurduktan niyetinde yapıyı çevreleyen bir dış duvar oluşan bir yapı çizin. Poloksamer ile yapı yazdırın. Duvarın baskı 6 dakika sürer.

Dikkat: duvar iğne nedeniyle boyutlarının iç yapısının en az 3,5 mm uzaklıkta basılacak sahiptir. Aksi takdirde, dış duvarın baskı iç yapısının bozulmasına neden olur

  1. Eğer Sacr doldurulacak istediğiniz çözümü hazırlayınificial ile kalıp (deiyonize su içinde, burada bir% 1 agaroz). Agaroz solüsyon, 35 ° C ile 45 ° C arasındaki bir sıcaklıkta olmalıdır Bu sıcaklık altında, agaroz çok hızlı pekiştireceğiz, poloksamer yapısını yumuşatır çünkü bu sıcaklığı üzerinde, bu basılı ayağı yok olabilir.
  2. Yavaş yavaş bir pipet kullanarak dolgu çözüm kurban kalıp doldurun. Bu, duvar iç yapısının yok olmasını önlemek için yavaş yavaş yapılmalıdır.
  3. Backfilled çözüm jel izin veya kullanılan polimer bağlı olarak çapraz bağ. Agaroz durumunda katılaşma 10 dakika boyunca 4 ° C'de gerçekleştirildi.
  4. Poloksamer yapısı elüt için 10 dakika için bir buz banyosu içinde, doldurulmuş geçici kalıbın koyun.
  5. Bir kağıt doku ile yeniden toprakla yapısı leke ve yeni bir cam mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Arasındaki boşluğa boşluğu gelen üçüncü hidrojel sızmasını önlemek için cam mikroskop lamı üzerine dikkatlice yapısı basınbackfilled yapısı ve cam mikroskop lamı.

5. Boşluklar doldurulması

  1. Yıkanan poloksamer kalan boşlukları doldurmak için, bir 30 G iğne ile donatılmış bir şırınga içine amaçlanan polimer çözeltisi doldurun. Bu örnekte,% 0,05 'lik ilavesi ile 0.15 M NaCl çözeltisi içinde bir% 1 aljinat metakrilat kullanılan ağ / hac lityum fenil-2 ,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) ve% 2.5 v / v Alexa-488 konjuge fibrinojen . Alexa-488 konjuge fibrinojen görselleştirme amacıyla eklenmiştir.
  2. 5 dakika ve görüntü için yüksek yoğunluklu UV lamba (100 Watt, 365 nm, yüzey mesafesinde 3,5 cm idi) ile polimer Photopolymerize bir epi-floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak inşa.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Örnek sonuçlar ters kalıp tekniği (Şekil 2'de gösterildiği gibi) olan bir ikinci malzeme ile doldurulabilir yapılandırılmış bir jel oluşturacaktır olduğunu göstermektedir. Her baskı sürecinin başında baskı parametreleri ilk optimize edilmiştir. Parametreler adım adım ayarlamalar Şekil 3 ve tek bir hat basılır Şekil 4 'de gösterilen baskılı katmanlı yapıları ile sonuçlanacaktır. Tabaka kalınlığı (bir basılı katman sonra iğne kaldırma) çok düşükse, bir iğne önceki katmanları dokunacak olduğunu göreceksiniz. İğne çok yüksek ise, baskılı yapı yüzeyi üzerinde bir dalga görünür. Bu durum, Şekil test edilen tüm tabaka kalınlıkları bir aşamasında hızı için çok büyük olduğu Şekil 3A-3D, görülebilir. Yüksek bir sahne hızlı tabakası kalınlığı azaltır, çünkü, set ve gerçek tabaka kalınlığı arasındaki küçük farklar birikir ve dalga başlaryapı artar yüksekliği olarak görünmesini. Tabaka kalınlığı düşürerek, farklılıklar daha küçük hale gelir ve dalga önce daha yüksek bir konumda (Şekil 3C ve Şekil 3B'de noktalı çizgiler ile gösterilen) görünür. Aşama hızı çok yüksek ise de gösterildiği gibi, sabit bir kalınlık için, bu, üst kısmına doğru dar ve yapının (Basılı yapının sağ kenar) başında bir çıkıntı olması ya da bir dalga ya da yapıları ile sonuçlanacaktır Şekiller 4A-4C. Poloksamer için optimize edilmiş parametreler 0,2 milisaniye arasında bir açma zamanı, 31.14 Hz'lik bir frekansta, 0.15 mm, 1.5 barlık bir basınç ve 75 mm / dak 'lık bir hızda bir tabaka kalınlığı vardı. Bu parametreler ile baskı Şekil 4D 'de olduğu gibi düzgün bir katı duvarları ile sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, 100 mm / dak, daha yüksek bir hız ile duvarların üretim süresini azaltmak için işlemi için seçildi.

Pi için optimize edilmiş parametreler ileŞekil 5A gösterildiği gibi llar baskı (zaman 0.2 msn, frekans 31.14 Hz, tabaka kalınlığı 0.08 mm, basınç 1.5 bar, sahne hızı 200 mm / dak, ikamet süresi 0,3 sn açılış) biz direklerinden bir dizi yarattı. Ayağı dizinin Kurutma etkileri merkezine doğru ayaklarından bükme sonuçlandı. Bu etki birbirinden daha ayrı sütunlar yerleştirerek, azaltılmış, ancak önlenmezse olabilir. Şekil 5B 'de gösterildiği gibi bir duvar sonra ayağı çevresinde basılır.

Soğuk suda kurban poloksamer kalıp elüsyon sonra, Şekil 5C'de gösterildiği gibi yapısal agaroz hidrojel oluşturulmuştur. Floresan aljinat metakrilat çözeltisi ve daha sonra çapraz bağlama, örneğin, yeni bir hidrojel-in hidrojel ayağı dizisi ile boşlukları doldurma sonra, Şekil 6'da gösterilen tek yapılabilir. 3D z-yığını yeniden açık bir şekilde oluşturulan floresan ayağı göstermektedir. Şekil 7 strong> da keyfi kavisli kalıplar oluşturmak için bu tekniğin olasılığını göstermektedir.

Şekil 1
Şekil 1. Bioprinter tasviri. Bioprinter "biyo" A) bir resmi. Iğne ve valf) bu görüntüde görünmez, fakat B de gösterilmiştir. En fazla 8 baskı kafaları için bir hızla malzemeleri arasında geçiş sağlayan bir dönüm kule üzerine monte edilir. Baskı hareket ettirilebilir hareketli sahneye yapılır x-, y-ve z-yönü. büyük rakam görmek için buraya tıklayın .

s.jpg "src =" / files/ftp_upload/50632/50632fig2.jpg "/>
Şekil 2. Yapılandırılmış hidrojellerin üretim için kurban kalıp üretim sürecinin düzeni.

Şekil 3,
Şekil 3,. Tabaka kalınlığı azalan tabaka kalınlığı optimizasyonu. Sabit bir aşamada hızda basılı Poloxamer katmanları (250 mm / dak). Katman kalınlığı çok yüksek olduğu zaman, bir dalga ortaya çıkmaktadır. Bu yavaş yavaş tabaka kalınlığı azalan kaybolur. Kırmızı noktalı çizgiler, basılı yapının hatasız kısmının yüksekliğini işaret ederken kırmızı bir katı çizgiler baskılı yapı alt göstermektedir. Katman) A) 0.18 mm, B, C) ​​0.15 mm ve D) 0.13 mm 0.16 mm kalınlıkta. Kırmızı bar 2 mm gösterir.

"> Şekil 4,
Şekil 4. Sahne hız optimizasyon. Sahnenin farklı hızlarda A) 250 mm / dak, B) 200 mm / dak, C) 150 mm / dak ve D ile 0.15 mm tabaka kalınlığı ile basılmış Poloxamer katmanları) 75 mm / dak. Aşamalı hız düşürücü olarak, yazdırma işleminin başlangıç ​​noktası tüm katmanları için aynıdır ve sağlam bir duvar yazdırılabilir. Kırmızı bar 2 mm gösterir.

Şekil 5,
Şekil 5,. Ayağı birbirinden 1.75 mm ayrılmış olan kuru poloksamerin desenli hidrojel üretimi. A) Pillar dizi. Dayanaklarından bükme etkisi kurutma neden olur. Agaroz. C pipetleme önce Poloksamer yapılmış bir duvarla çevrili B) Pillar dizi) Yapılandırılmışgeçici kalıp çıkarıldıktan sonra agaroz hidrojel.

Şekil 6,
6 Şekil. Floresan etiketli direklerinden 3D z-yığını yeniden bir agaroz iskele gömülü.

Şekil 7
Şekil 7. Içe daireler Poloksamer yazdırılabilir. Tek katmanları görülebilir. Kırmızı bar 2 mm gösterir.

Tasarım Kriterleri Baskı parametre
İnce tabaka kalınlığı
  • Basınç ↓
  • Sahne hızı ↑
  • Zaman Açılış ↓
  • Frekans ↓
Daha küçük çizgi kalınlığı
  • Basınç ↓
  • Sahne hızı ↑
  • Zaman Açılış ↓
  • Frekans ↓
Sürekli ekstrüzyon
  • Basınç ↑
  • Sahne hızı ↓
  • Zaman ↑ Açılış
  • Frekans ↑
Daha hızlı yapım hızı
  • Basınç ↑
  • Sahne hızı ↑
  • Zaman ↑ Açılış
  • Frekans ↑

Tablo 1. Poloksamer hatlarının ekstrüzyon için ve nasıl farklı baskı parametreler etkilenebilir dört tasarım parametreleri.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Burada, ilk kez, mevcut, hızlı bir şekilde bağlı olarak ~ 20 ° C arasında poloksamer edilen jel-sol geçiş için soğuk suyla yıkandı, olabilir, bir geçici kalıp için bir thermoresponsive polimerin kullanılması Sürecin hızı yeterli çözünürlüğe sahip basılamaz biopolimer yapıların hızlı oluşturma için Poloksamer ilginç hale getirir. Burada anlatılan teknik, bir hidrojel içinde ya da daha önce bir başka malzeme 35 için rapor edildiği gibi mikroakışkan kanallarının oluşturulması için desenli bir hidrojel için kullanılabilir. Bir kurban kalıp olarak poloksamer avantajı dolu ve daha sonra yıkandı olabilir sağlam bir tabaka-by-katman yapıları rasgele geometri basılmış olmasıdır.

Biz burada yapılandırılmış hidrojeller oluşturmak için ikinci bir hidrojel sonraki dolgu ile Poloksamer ile bir kurban kalıp oluşturma işlemini açıklar. Yapısal hidrojel için malzeme kanal olabilirdoldurma noktasında viskozite ve sıcaklık açısından kısıtlamalarla Osen. Polietilen glikol diacrylate 36,37, aljinat 38,39, agaroz 40 ve Metakrilatlanmış biyopolimerler gibi sık kullanılan polimerlerin düşük viskoziteli habercisi çözümleri 41-43 uygun dolgu malzemeleri için sadece birkaç örnektir. Yüksek viskoz malzemeyi ancak dar geometri doldurmayabilir ya da burada yazılı olan ayağı gibi ince kırılgan yapıların durumunda kurban kalıp yok edebilir. Düşük yüzde agaroz çözüm bu nedenle dolgu için seçildi. Poloksamer ile kombinasyon halinde agaroz kullanmanın bir diğer avantajı, soğutma ile jeller olmasıdır. Bu nedenle, soğuk su ile temas olduğunda, agaroz onun jel devlet, doğru ters baskılı poloksamerin desen yansıtan bir devlet korur.

Bu prosedürde önemli adımlar baskı parametrelerinin optimizasyonu, kurban kalıp doldurma ve dahilboşlukların doldurulması. Optimize edildi baskı parametreleri valf, basınç, hız ile ve tabaka kalınlığı sıklığı ve açma süresi idi. Tabaka kalınlığı her basılı tabaka sonra iğne pnömatik olarak tanımlanır. Sütunlar halinde, ikamet süresi, ayarlanabilir de, zaman malzeme sahne hareket olmadan bir nokta üzerine haddelenmektedir vardı yani. Bir parametre değişiklikleri haddelenmiş hatlarının çeşitli tasarım parametreleri üzerinde etkileri olabilir çünkü optimizasyon süreci zaman alıcı olabilir. Farklı tasarım kriterleri için önemli parametreler Tablo 1 'de tarif edilmektedir.

Sürecinde ikinci önemli adım, kurban kalıp doldurma olduğunu. Geçici kalıbın doldurulması hassas bir adımdır. Küçük ve dar yapılar genellikle el, dikkatli bir şekilde doldurulacak ve çözümleri basit döküm her zaman mümkün olmayabilir gerekir.

S dikkatli dolguagaroz ile acrificial kalıp nedenle ayağı yok olmasını önlemek için, 100 ul pipet kullanılarak gerçekleştirildi. Son adım, boşlukların doldurulması, bir 30 G iğne ile donatılmış bir şırınga kullanılması gerekmektedir. Bakım Dolum sırasında kabarcık oluşumunu önlemek için alınmalıdır.

Burada yer alan bir yapı içinde farklı jeller de hücreleri içerebilir. Yapısal hidrojel içindeki boşluklar ve başka hücre tipi içinde hidrojeller bir hücre tipi yerleştirerek, uzaysal tanımlanmış ortak-kültür kurulum oluşturulabilir. Miller ve ark yayında olduğu gibi birbirine 3B ağ. 30, vasküler veya sinir ağları da mümkündür. Bu tür ağlara olası bir yaklaşım çevreleyen duvarın içinde çizgiler yazdırmak ve ikinci hidrojel, çapraz ikinci hidrojel ile boşlukları doldurun ve 90 ° bir sonraki katmanı döndürülmüş baskı ile devam etmek olacaktır. Bir geçici kalıp baskı poloksamer avantajı ne gerektirmesidirbir ana kalıp veya bir maske. Aynı zamanda ısıtılmış bir baskı kafası, sistemin malzeme ve tıkanma deneylerde gözlenmemiştir ekstrüde etmek gerekli değildir.

Bu Burada sunulan olanlar gibi yapıları difüzyon tabanlı hücre-hücre etkileşimleri veya ilaç keşfi için çalışma ortak kültürler mekansal organize 3D gibi gelecekte de kullanılabilir. Ancak, burada sunulan prosedürün tam otomatik versiyonu ilaç tarama alanında başarılı olmak için geliştirilmesi gerekmektedir.

Özetlemek gerekirse, biz izin hidrojeller ile dolu ve daha sonra yıkandı edilebilir keyfi geometrileri baskı. Bir yöntem sunduk Bu şekilde, yapılandırılmış hidrojel-in-hidrojel mimariler basit ve maliyet-etkin bir şekilde oluşturulabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar beyan bir şey yok.

Acknowledgments

Biz bioprinter ile yardım için Deborah Studer teşekkür ederim.

Iş hibe anlaşması n kapsamında Avrupa Birliği Yedinci Çerçeve Programı (FP7/2007-2013) ° NMP4-SL-2009-229292 tarafından finanse edildi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
REAGENTS
Poloxamer (Pluronic F127) Sigma P2443
PBS Invitrogen 10010-015
CAD software regenHU BioCAD
Alginate methacrylate Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Fibrinogen From Human Plasma, Alexa Fluor 488 Conjugate Invitrogen F13191
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Innovent e.V Technologieentwicklung Jena Synthesized by Innovent for the FP7 Project Nr NMP4-SL-2009-229292
Agarose Lonza 50004
EQUIPMENT
Bioprinter regenHU Biofactory
Valve regenHU 300 μm Nozzel Diameter
Needle regenHU 150 μm Inner Diameter
Zeiss Axioobserver with ApoTome Zeiss
UV Light Source UVP Blak-Ray B-100AP High Intensity UV Lamp 100 W

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fedorovich, N. E., et al. Evaluation of photocrosslinked Lutrol hydrogel for tissue printing applications. Biomacromolecules. 10, 1689-1696 (2009).
  2. Lee, K. B., Park, S. J., Mirkin, C. A. Protein nanoarrays generated by Dip-Pen Nanolithography. Abstr Pap Am Chem S. 223, C94 (2002).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annual review of biomedical engineering. 3, 335-373 (2001).
  4. Mironov, V., Reis, N., Derby, B. Review: bioprinting: a beginning. Tissue engineering. 12, 631-634 (2006).
  5. Odde, D. J., Renn, M. J. Laser-guided direct writing of living cells. Biotechnology and bioengineering. 67, 312-318 (2000).
  6. Derby, B. Bioprinting: inkjet printing proteins and hybrid cell-containing materials and structures. J Mater Chem. 18, 5717-5721 (1039).
  7. Therriault, D., White, S. R., Lewis, J. A. Chaotic mixing in three-dimensional microvascular networks fabricated by direct-write assembly. Nature. 2, 265-271 (2003).
  8. Engelhardt, S., et al. Fabrication of 2D protein microstructures and 3D polymer-protein hybrid microstructures by two-photon polymerization. Biofabrication. 3, 025003 (2011).
  9. Mironov, V. Printing technology to produce living tissue. Expert opinion on biological therapy. 3, 701-704 (2003).
  10. Mironov, V., Kasyanov, V., Drake, C., Markwald, R. R. Organ printing: promises and challenges. Regenerative medicine. 3, 93-103 (2008).
  11. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Current opinion in biotechnology. 22, 667-673 (2011).
  12. Fedorovich, N. E., De Wijn, J. R., Verbout, A. J., Alblas, J., Dhert, W. J. Three-dimensional fiber deposition of cell-laden, viable, patterned constructs for bone tissue printing. Tissue engineering. Part A. 14, 127-133 (2008).
  13. Dhariwala, B., Hunt, E., Boland, T. Rapid prototyping of tissue-engineering constructs, using photopolymerizable hydrogels and stereolithography. Tissue engineering. 10, 1316-1322 (2004).
  14. Cook, C., Wang, T., Derby, B. Inkjet Printing of Enzymes for Glucose Biosensors. Mater Res Soc Symp P. 1191, 103-109 (2009).
  15. Cui, X., Gao, G., Qiu, Y. Accelerated myotube formation using bioprinting technology for biosensor applications. Biotechnol Lett. 1-7 (2012).
  16. Fabrication of a Glucose Biosensor by Piezoelectric Inkjet Printing. Wang, T. M., Cook, C., Derby, B. 2009 3rd International Conference on Sensor Technologies and Applications (Sensorcomm 2009), 82-85 (2009).
  17. Shim, J. H., Lee, J. S., Kim, J. Y., Cho, D. W. Bioprinting of a mechanically enhanced three-dimensional dual cell-laden construct for osteochondral tissue engineering using a multi-head tissue/organ building system. J. Micromech. Microeng. 22, (2012).
  18. Malmsten, M., Lindman, B. Self-Assembly in Aqueous Block Copolymer Solutions. Macromolecules. 25, 5440-5445 (1021).
  19. Cebotari, S., et al. Clinical application of tissue engineered human heart valves using autologous progenitor cells. Circulation. 114, I132-I137 (2006).
  20. Matsumura, G., Hibino, N., Ikada, Y., Kurosawa, H., Shin'oka, T. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomaterials. 24, 2303-2308 (2003).
  21. Kropp, B. P., Zwischenberger, J. B. Tissue-engineered autologous bladders: new possibilities for cystoplasty. Nature clinical practice. Urology. 3, 588-589 (2006).
  22. Oberpenning, F., Meng, J., Yoo, J. J., Atala, A. De novo reconstitution of a functional mammalian urinary bladder by tissue engineering. Nature. 17, 149-155 (1999).
  23. Wood, F. Tissue engineering of skin. Clinics in plastic surgery. 39, 21-32 (2012).
  24. Groeber, F., Holeiter, M., Hampel, M., Hinderer, S., Schenke-Layland, K. Skin tissue engineering--in vivo and in vitro applications. Clinics in plastic surgery. 39, 33-58 (2012).
  25. Bannasch, H., Momeni, A., Knam, F., Stark, G. B., Fohn, M. Tissue engineering of skin substitutes. Panminerva medica. 47, 53-60 (2005).
  26. Jakab, K., Neagu, A., Mironov, V., Forgacs, G. Organ printing: fiction or science. Biorheology. 41, 371-375 (2004).
  27. Boland, T., Mironov, V., Gutowska, A., Roth, E. A., Markwald, R. R. Cell and organ printing 2: fusion of cell aggregates in three-dimensional gels. The anatomical record. Part A, Discoveries in molecular, cellular, and evolutionary biology. 272, 497-502 (2003).
  28. Mironov, V., et al. Organ printing: tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30, 2164-2174 (2009).
  29. Raimondi, M. T., et al. Two-photon laser polymerization: from fundamentals to biomedical application in tissue engineering and regenerative medicine. Journal of applied biomaterials. 10, 56-66 (2012).
  30. Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature. 11, 768-774 (2012).
  31. Billiet, T., Vandenhaute, M., Schelfhout, J., Van Vlierberghe, S., Dubruel, P. A review of trends and limitations in hydrogel-rapid prototyping for tissue engineering. Biomaterials. 33, 6020-6041 (2012).
  32. Murphy, S. V., Skardal, A., Atala, A. Evaluation of hydrogels for bio-printing applications. Journal of biomedical materials research. Part A. 101, 272-284 (2013).
  33. He, J., Li, D., Liu, Y., Gong, H., Lu, B. Indirect fabrication of microstructured chitosan-gelatin scaffolds using rapid prototyping. Virtual and Physical Prototyping. 3, 159-166 (2008).
  34. Sachlos, E., Reis, N., Ainsley, C., Derby, B., Czernuszka, J. T. Novel collagen scaffolds with predefined internal morphology made by solid freeform fabrication. Biomaterials. 24, 1487-1497 (2003).
  35. Lee, W., et al. On-demand three-dimensional freeform fabrication of multi-layered hydrogel scaffold with fluidic channels. Biotechnology and bioengineering. 105, 1178-1186 (2010).
  36. Turturro, M., Christenson, M., Larson, J., Papavasiliou, G. Matrix metalloproteinase (MMP) sensitive PEG diacrylate (PEGDA) hydrogels with spatial variations in matrix properties direct vascular cell invasion. J. Tissue. 6, 302-302 (2012).
  37. Butterworth, A., Garcia, M. D. L., Beebe, D. Photopolymerized poly(ethylene) glycol diacrylate (PEGDA) microfluidic devices. Roy. Soc. Ch. 4-6 (2005).
  38. Shachar, M., Tsur-Gang, O., Dvir, T., Leor, J., Cohen, S. The effect of immobilized RGD peptide in alginate scaffolds on cardiac tissue engineering. Acta biomaterialia. 7, 152-162 (2011).
  39. Jeon, O., Bouhadir, K. H., Mansour, J. M., Alsberg, E. Photocrosslinked alginate hydrogels with tunable biodegradation rates and mechanical properties. Biomaterials. 30, 2724-2734 (2009).
  40. Mauck, R. L., et al. Functional tissue engineering of articular cartilage through dynamic loading of chondrocyte-seeded agarose gels. J. Biomech. Eng-T Asme. 122, 252-260 (2000).
  41. D'Arrigo, G., et al. Hyaluronic acid methacrylate derivatives and calcium alginate interpenetrated hydrogel networks for biomedical applications: physico-chemical characterization and protein release. Colloid Polym. Sci. 290, 1575-1582 (2012).
  42. Pescosolido, L., et al. Hyaluronic Acid and Dextran-Based Semi-IPN Hydrogels as Biomaterials for Bioprinting. Biomacromolecules. 12, 1831-1838 (2011).
  43. Guo, Y., et al. Hydrogels of collagen/chondroitin sulfate/hyaluronan interpenetrating polymer network for cartilage tissue engineering. J. Mater. Sci-Mater. M. 23, 2267-2279 (2012).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics