Coltura Microglia dal Sistema Nervoso Centrale neonatale e adulti

1Program in Neuroscience, Stony Brook University, 2Department of Pharmacological Sciences, Stony Brook University, 3Program in Molecular and Cellular Pharmacology, Stony Brook University
* These authors contributed equally
Immunology and Infection

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Summary

Noi descriviamo i metodi per l'efficiente e rapido isolamento / cultura della microglia praticabile dalla corteccia cerebrale neonatale e midollo spinale adulto. La dissezione e la placcatura di microglia corticale può essere realizzato entro 90 minuti, con la conseguente raccolta microglia in atto ~ 10 giorni dopo la dissezione iniziale.

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Bronstein, R., Torres, L., Nissen, J. C., Tsirka, S. E. Culturing Microglia from the Neonatal and Adult Central Nervous System. J. Vis. Exp. (78), e50647, doi:10.3791/50647 (2013).

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Abstract

Microglia sono i residenti i macrofagi del sistema nervoso centrale (SNC) e, come tali, hanno ruoli criticamente importanti in processi fisiologici e patologici quali CNS maturazione in sviluppo, sclerosi multipla, e lesioni del midollo spinale. Microglia può essere attivato e reclutato per azione da lesioni o la stimolazione neuronale, come il danno assonale visto in MS o di un trauma cerebrale ischemico derivanti da ictus. Questi membri immunocompetenti del SNC sono anche pensato di avere un ruolo nella plasticità sinaptica in condizioni non patologiche. Impieghiamo protocolli per coltura microglia dai tessuti neonatali e adulti che mirano a massimizzare il numero di cellule vitali minimizzando variabili confondenti, quali la presenza di altri tipi di cellule del SNC e coltura detriti cellulari. Utilizziamo grandi e facilmente individuabile componenti del sistema nervoso centrale (ad esempio corteccia, segmenti del midollo spinale), che rende l'intero processo fattibile e riproducibile. L'uso di cellula adultas è una valida alternativa all'uso di microglia cerebrale neonatale, come molte patologie indagate interessano principalmente l'postnatale midollo spinale. Questi sistemi di coltura sono anche utile per testare direttamente l'effetto di composti che possono sia inibire o promuovere attivazione della microglia. Dal attivazione della microglia può plasmare gli esiti delle malattie del sistema nervoso centrale adulto, vi è la necessità per i sistemi in vitro in cui microglia neonatale e adulta può essere coltivato e studiato.

Introduction

Microglia sono le cellule immunitarie residenti del SNC, maggiormente somiglianti macrofagi periferici per struttura e funzione 1. E 'stato recentemente dimostrato che le cellule microgliali postnatali derivano da progenitori mieloidi primitivi e sono generati prima dell'ottavo giorno di embriogenesi, rovesciando il concetto precedente che postnatali progenitori emopoietici sono la fonte della microglia nel cervello adulto 2. Essi giocano un ruolo chiave in diverse malattie neurologiche e possono rispondere rapidamente alle infezioni o lesioni attraverso il rilascio di citochine pro-infiammatorie e anti-infiammatori 3. Così microglia comprendono una unità autonoma nel SNC che possono essere manipolati per influenzare la progressione della malattia. Lo sviluppo di metodi robusti e riproducibili per isolare e coltivare le cellule microgliali neonatali o adulto è importante per gli studi futuri.

Microglia sono noti per essere giocatori critici in un certo numero di patologie cerebrali. Più di recente, roles stanno emergendo per le cellule nel normale sviluppo del cervello e la funzione come microglia fagocitare eccesso di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell'ippocampo 1, 4. Microglia può anche modulare le diverse condizioni neurologiche che colpiscono il midollo spinale, come MS, dolore neuropatico, e le lesioni del midollo spinale 5-7. Microglia midollo spinale reagiscono in modo diverso rispetto al cervello microglia in risposta ai segnali di attivazione 8, 9, probabilmente a causa delle differenze nell'ambiente locale. Quindi è importante stabilire un adeguato sistema in vitro per studiare la cultura e microglia midollo spinale. Microglia neonatali producono significativamente maggiore della citochina pro-infiammatoria ossido di azoto rispetto a cellule adulte dopo stimolazione in vitro con IFN-γ o TNF-a 10,11 un'ulteriore evidenziando la necessità di utilizzare cellule adulte per studiare microglia nel contesto di alcune malattie.

Il protocollo impieghiamo in laboratorio per culture microglia neonatale è una variazione di metodi recenti che utilizzano agitazione di colture gliali miste nel tentativo di rimuovere la microglia dalla superficie del pallone di coltura cellulare 12. Noi descriviamo anche un metodo per cultura microglia dal midollo spinale adulto topo basata su un protocollo prima descritto da Yip, et al 13. Questo metodo fornisce un modo più rapido per le cellule adulte della cultura rispetto ad altri protocolli disponibili 14. La preparazione risultante è del 70% microglia; la percentuale rimanente è costituita da astrociti. Sebbene la purezza della nostra cultura è più basso rispetto ad altri metodi pubblicati 13, questo sistema di coltura è utile per esplorare la microglia in coltura risposta a vari stimoli attivanti e anche per lo studio di malattie che colpiscono principalmente il midollo spinale e in cui una forte risposta infiammatoria è una caratteristica principale.

Tutti i protocolli descritti sono stati approvati dalla Stony Brook University IACUC.

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Protocol

1. Dissection (giorno 0)

  1. Indurre l'anestesia per p0-2 cuccioli di topo con ipotermia. Pulire le teste dei cuccioli con un Kimwipe imbevuto di etanolo al 70% per disinfettare il tessuto.
  2. Togliere le teste con un paio di forbici, con 4 cuccioli per 10 cm piastra di coltura. Mettere le teste in una capsula di Petri contenente tampone di ghiaccio-freddo Hank.
  3. Ancorare le testine utilizzando pinze curve attraverso le orbite e rimuovere con attenzione la pelle che ricopre il cranio con microforceps dritte.
  4. Togliere le ossa craniche con microforceps rette, prestando attenzione a non forare o danneggiare la corteccia. Il modo più efficace è quello di iniziare la rimozione partire vicino il cervelletto, che si trova alla base della testa, come sarà scartata questa regione.
  5. Togliere il cervello con una spatolina, e posizionare le (4) cervelli in una capsula di Petri contenente tampone fresco di ghiaccio freddo Hank.
  6. Tutti i passi da questo punto in poi utilizzano microforceps e vengono eseguite sotto una diffuction microscopio. Partendo dal lato ventrale del cervello, ancorare il tessuto tenendo il cervelletto e fare due piccole incisioni ai lati del mesencefalo. Fare attenzione a non tagliare tutto il percorso attraverso il tessuto, come le cortecce coprono il mesencefalo in questa regione.
  7. Stuzzicare delicatamente il mesencefalo e cervelletto in un pezzo da due cortecce. Le due cortecce dovrebbero formare una forma concava.
  8. Separare le due cortecce e orientare una sola corteccia con il lato mediale per ulteriore dissezione. L'ippocampo può essere difficile da osservare, ma si trova di fronte del bulbo olfattivo che appare come un piccolo nodulo sull'estremità appuntita della corteccia.
  9. Rimuovere l'ippocampo, che ha una forma di mezzaluna. Capovolgere la corteccia sopra per vedere il lato dorsale.
  10. Utilizzando il bulbo olfattivo come punto di partenza, rimuovere tutte le meningi e il bulbo olfattivo stesso dalla corteccia.
  11. Le cortecce sezionati devono essere collocati in provette coniche da 15 ml con 14 ml di Colsoluzione fisiologica tamponata di d Hank su ghiaccio.

2. Colture Cellulari (giorno 0)

  1. Pre-coat 10 centimetri di tessuto piastre di coltura con 5 pg / ml di poli-D-lisina (PDL) diluito in acqua autoclavato per 3 ore a 37 ° C.
  2. Aspirare Pdl, e piatti lavare una volta con acqua sterilizzata. Monodisco a secco sotto l'UV nella cappa coltura tissutale per 20 min. Questa operazione deve essere eseguita appena prima del processo di dissezione.
  3. Tampone di Hank aspirato dalle provette contenenti le cortecce da 4 cervelli ciascuno, applicare 4 ml di soluzione 1x tripsina / EDTA, triturare tessuto con p1000 punta, e posto i tubi nel 37 ° C incubatore per 15 min.
  4. Aggiungere 4 ml di mezzi completi microgliali per tubo per fermare la digestione enzimatica, mescolare e centrifugare contenuto a 1.5K rpm per 5 min.
  5. Aspirare il surnatante e ripetere lavata con 4 ml di mezzi completi. Risospendere le cellule in 10 ml di mezzi microgliali completi (DMEM con 10% FBS, 1% sodio piruvato, 0.08% gentamicina) e filtrare attraverso un 40 micron colino cellula maglia.
  6. Piastra ad una densità di 8 cortecce per 10 ml in una piastra di coltura 10 cm tissutale e posto in una coltura tissutale incubatore a 37 ° C e 5% di CO 2 (Cfr. adulto protocollo Microglia).

(Giorno 3)

  1. Modifica dei media in tutti i piatti di coltura di cellule microgliali con mezzi completi.

(Giorno 10)

  1. Aggiungere 400 microlitri di 60 mm lidocaina in HBSS (per staccare microglia) in media di 10 cm di piastre di coltura di tessuto e incubare a temperatura ambiente (RT) per 10-15 min.
  2. Raccogliere i media / sospensione di cellule dalla piastra, e lavare la piastra una volta con tampone di Hank. Raccogliere il tampone di lavaggio per recuperare rimanendo microglia.
  3. Aggiungere 5 mM EDTA (pH 8,0) alla sospensione cellulare ad una concentrazione finale di 50 mM o ad una diluizione 1/100.
  4. Spin down sospensione cellulare a 1.000 xg (1.500 rpm) per 5 min e risospendere in 1 ml di DMEM con 1% FBS.
  5. Contare il numero di cellule vitali (come per Adulto Microglia 3.1/3.2) e celle divise in piastre di coltura di tessuti a densità sperimentale desiderato. Circa 1x10 6 cellule microgliali vengono raccolte da una piastra di 10 cm contenente le cortecce da 4 cervelli. Per immunofluorescenza, si raccomanda una densità di 2.5x10 4 cellule per 18 millimetri coprioggetto.
  6. Lasciare almeno 24 ore per le cellule microgliali per tornare pienamente alla loro ramificata, stato di riposo prima dell'uso.

Protocollo Testo: (Adult microglia)

1. Collezione tessuti

  1. Cappotto tessuto piastre di coltura con poli-D-lisina (PDL) per 3 ore a 37 ° C o per una notte a 4 ° C. Lavare le piastre una volta con acqua autoclavata immediatamente prima dell'uso.
  2. Euthanize topo da CO 2 asfissia e di accertare che l'eutanasia è completa. Pulire la zona del midollo spinale con il 70% di etanolo.
  3. Usando un paio di forbici tagliare la pelle sulla parte superiore del midollo spinale; quindi procedere a tagliare il midollo spinale dalla regione T1 a T12. Tagliareil muscolo rimanenti fuori dei lati del midollo spinale.
  4. Tagliare lentamente il vertebre utilizzando microscissors come si tiene delicatamente il midollo spinale con la punta delle dita. Siate attenti a non forare il midollo spinale come il tessuto è molto morbido. Lentamente estrarre il midollo spinale usando microforceps.
  5. Immergere il midollo spinale in una capsula di Petri contenente HBSS ghiacciate. Utilizzando un microscopio ottico rimuovere tutti meningi visibili utilizzando microforceps
  6. Tagliate il midollo spinale in segmenti trasversali sufficientemente piccole per generare diversi frammenti. Lo spessore dei frammenti non deve essere superiore a 2 mm, per facilitare la digestione efficiente. Trasferire i pezzi del midollo spinale di un tubo da 15 ml contenente 1 ml HBSS ghiacciate. Tenere il tubo in ghiaccio fino alla fase di digestione.

2. Digestione del Tissue

  1. Aspirare HBSS da 15 ml tubo conico contenente tessuto del midollo spinale. Fare attenzione a non aspirare qualsiasi pezzo di tessuto.
  2. Aggiungere 1 ml di tripsina (2.5 g / L irradiati suina tripsina e in HBSS 0,2 g / L EDTA) e incubare a 37 ° C per 30 min.
  3. Per fermare la digestione rimuovere la tripsina e aggiungere 3 ml di mezzo microglia primaria che contiene siero di arrestare la digestione enzimatica.
  4. Pipettare su e giù per rimuovere il tessuto. Filtrare la sospensione cellulare utilizzando un colino cella 40 micron.

3. Conta delle cellule e placcatura

  1. Mescolare uguale volume di sospensione cellulare e la soluzione DAPI.
  2. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.
  3. Piastra ad una densità compresa tra 5-7x10 5 cellule / ml nel PDL rivestite 35 x 10 piatti mm. Placcatura a una densità minore di prevenire la crescita cellulare anche quando le cellule sono state coltivate in piastre da 12 aventi un'area più piccola rispetto a 35 x 10 piatti mm.

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Representative Results

Un esempio di cellule microgliali riposo che attivate è mostrato in Figura 1. La microglia sono state visualizzate 24 ore dopo la placcatura (Figura 1a) e presentano ramificate (a riposo) morfologia. Esposizione al reagente adescamento, batteriche lipopolisaccaridi (LPS) provoca cambiamenti nella morfologia della microglia esempio le cellule diventano attivato (Figura 1b).

Un esempio di contare le cellule per la placcatura è mostrato in Figura 2. A causa della presenza di detriti cellulari, DAPI Fluoromount (invece di Trypan Blue) è stato aggiunto ad un volume uguale di sospensione cellulare e posto in un emocitometro per conteggio delle cellule come descritto in 4, 13. Cellule positive DAPI sono stati visualizzati con un microscopio a fluorescenza. L'uso del campo luminoso impostazione facilitato un conteggio accurato delle cellule presenti (Figura 2). Circa 7x10 5 cellule sono stati ottenuti per il mouse del midollo spinale.

contenuto "> Le cellule sono state seminate in PDL rivestite 35 x 10 mm piatti coltura di tessuti. Abbiamo trovato che il rivestimento con il Pdl è stato un passo fondamentale, in quanto le cellule non aderiscono / crescono meno che i piatti erano rivestite. Microglia completamente allegare alla piastra di coltura Dopo circa due giorni in coltura (figura 3). Il midollo spinale di topi MacGreen, che esprimono GFP sotto il controllo della microglia / macrofagi promotore CSF-1R, è stato utilizzato per questo esperimento.

Figura 1
Figura 1. Immagine rappresentativa della microglia neonatale dopo due giorni di cultura. Microglia sono state coltivate da p0 C57/BL6 cuccioli di topo, e placcato su vetrini rivestiti con una densità di 2,5 x 10 5 cellule / ml. A, c. Microglia non trattati che sono tornati a una riposo, stato ramificata, b, d . Microglia trattate con 100 ng / ml di LPS per 4 ore e mostrare un attivo, forma ameboide; Iba1 (verde, un marcatore specifico per i macrofagi / microglia proteina di superficie) è stato utilizzato per visualizzare le cellule, mentre le immagini dei campi luminosi sono stati usati per mostrare popolazioni cellulari complessivi. DAPI Fluoromount è stato usato per visualizzare nuclei e indicare la purezza della cultura.

Figura 2
Figura 2. Conteggio delle cellule. DAPI Fluoromount era mescolata con un volume uguale di sospensione cellulare e collocato in un emocitometro. Abbiamo combinato il campo chiaro e l'impostazione di fluorescenza per visualizzare le cellule positive DAPI e la griglia emocitometro per una conta cellulare accurato.

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Figura 3. Immagini rappresentative della adulto microglia midollo spinale dopo due giorni di cultura. una. Il midollo spinale di un topo MacGreen stato utilizzato per la procedura di coltura. Le cellule sono state piastrate in un 35 x 10 mm piatto di coltura tissutale PDL rivestite ad una densità di 7x10 5 cellule / ml. B. Campo immagine luminosa della microglia midollo spinale dopo due giorni di coltura. Microglia (frecce blu) e gli astrociti sono mostrati (frecce rosse). Clicca qui per ingrandire la figura .

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Discussion

Microglia modulare CNS normale funzionamento così come le risposte infiammatorie a diverse patologie. Funzionale rimodellamento sinaptico da microglia è stata implicata nel mantenimento dell'omeostasi normale del cervello 15. Durante la cascata neurogena partecipano alla liquidazione di cellule progenitrici neurali del giro dentato dell'ippocampo 4, 16. Pertanto, è necessario sviluppare un sistema di coltura in cui studiare microglia neonatale e adulto, che coprirà la vasta fascia di sviluppo e l'età adulta, durante il quale microglia hanno molteplici funzioni discrete. Abbiamo delineato un metodo rapido ed efficiente per la cultura microglia da adulto midollo spinale e del cervello neonatale. Siamo stati in grado di ottenere preparazioni di cellule nell'adulto che erano il 70% microglia con la restante percentuale composta da astrociti, e la purezza delle preparazioni microgliali neonatali si avvicina al 100%.

Dato il ruolo that hanno astrociti nella regolazione dello stato di attivazione della microglia 17-19, è importante per ottimizzare le condizioni di coltura per migliorare la purezza della cultura. Sebbene combinando la sospensione cellulare con un uguale volume di DAPI Fluoromount permette una conta cellulare esatto, non è possibile distinguere microglia da altri tipi cellulari utilizzando questo metodo. Per migliorare la purezza della preparazione microglia adulto, Dynabeads GFP-rivestiti possono essere incubate con la sospensione di cellule derivate da topi MacGreen, le cui cellule mieloidi già esprimono GFP 20. Un altro suggerimento sarebbe quello di targa della sospensione cellulare mista in piatti di coltura che non sono stati precedentemente rivestito con Pdl per evitare attaccamento astrocitica 13. Tuttavia, abbiamo scoperto che non le cellule crescono sulla piastra a meno che non siano stati precedentemente rivestita, che nelle nostre mani è applicabile a entrambe le cellule neonatali e adulti.

Molti protocolli che descrivono metodi per isolzione e la placcatura di microglia primaria sia da tessuto cerebrale di ratto o topo utilizzano agitazione di colture gliali miste di staccare la microglia e ottenere così una popolazione purificata per esperimenti a valle 12. Il nostro protocollo differisce più sensibilmente nel escluso il passo tremante, e concentrandosi invece sulla purificazione di una microglia sola popolazione attraverso condizioni di coltura titolati appunto. Nella nostra esperienza, scuotendo colture gliali miste al fine di rimuovere la microglia è efficace, ma ha uno svantaggio significativo - il fatto che la microglia scosso prendere molti giorni per tornare a una morfologia a riposo completo 12. Questo può essere problematico, dato che cellule microgliali attivate hanno un notevolmente diverso profilo delle citochine 21. Il nostro protocollo, tenendo leggermente più lungo per ottenere puro microglia, mantiene le cellule in uno stato di riposo per tutto. Come per la preparazione degli adulti discusso nel prossimo paragrafo, l'unico inconveniente del nostro metodo è possibilità di piccola contaminazione di altri tipi di cellule, cioè astrociti.

La nostra tecnica di coltura adulto microglia varia considerevolmente da metodi preesistenti. Molti protocolli richiedono l'uso di centrifugazione in gradiente di densità (Percoll), così come l'uso di citometria a flusso per ottenere una popolazione pura microglia 22. Nel nostro metodo di creazione di una cultura della microglia stabile dal midollo spinale adulto non utilizzare sia la tecnica, che rende per un tempo molto meno di protocollo e complicato per il ricercatore di seguire. Mentre la stragrande maggioranza delle preparazioni microgliali adulte provengono dal tessuto cerebrale, il midollo spinale è costituito dalle stesse tipi cellulari - e quindi nostro protocollo presenta un equo confronto ai metodi precedentemente descritti 22. Un compromesso nel nostro protocollo è una preparazione microglia leggermente meno puro, composto da 70% di microglia, con la restante frazione di cellule che sono per lo più di astrociti origin. Questa discrepanza può potenzialmente essere superato utilizzando una fase aggiuntiva di isolamento di più microglia puro usando molto specifici marcatori di tipo di cellule del lignaggio microglia come Iba-1 e F4/80 coniugato con sfere magnetiche.

Maggior parte degli studi che valutano il ruolo della microglia in malattie neurologiche che colpiscono sono stati condotti al midollo spinale utilizzando cellule dal cervello neonatale, e mentre questo è un approccio solido per rispondere alle domande circa il ruolo di microglia nel normale sviluppo, nonché patologie che interessano il cervello in particolare, abbiamo sentito che un metodo più specifico doveva essere istituita per studiare la funzione della microglia nel midollo spinale adulto. Nostro metodo neonatale è un modo molto efficiente di rispondere a molte domande riguardanti il ​​normale funzionamento del cervello e in certe condizioni patologiche, e il metodo adulto è una buona alternativa all'uso di cellule neonatali per tali studi considerazione della variabilità risposta immunologicas tra microglia neonatale e cellule adulte e tra microglia dal cervello e il midollo spinale 6-9. Microglia ottenuto da entrambi i metodi sono indicate anche per gli studi in vitro di co-coltura (abbiamo principalmente loro cultura con i neuroni e oligodendrociti nel nostro laboratorio) che l'indirizzo l'effetto della microglia in altri tipi di cellule, così come la risposta della microglia neonatale e adulto di attivazione stimoli.

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Disclosures

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgments

Vorremmo ringraziare i membri del Tsirka laboratorio per i loro consigli e utili commenti. Questo lavoro è stato sostenuto da R01NS42168 a SET, 12PRE12060489 a RB, un NSF-3MT IGERT e un Turner Tesi borsa di studio a LT, e NSF-3MT IGERT a JCN.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
EDTA, 5mM Invitrogen 15567-028
Lidocaine, 60mM Sigma L-5647
Trypan Blue Sigma T8154
Trypsin/EDTA Cellgro 25-052-CI
DMEM, 1X Cellgro 10-017
Sodium Pyruvate Cellgro 25-000-Cl
Gentamycin Sulfate Biowittaker 17-518Z
35 x 10mm tissue culture dish Falcon 353001
Poly-D-Lysine, 100 μg/ml Dilute 1:20
HBSS, 1X Cellgro 20-023-CV

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