Automatic Translation

This translation into Hebrew was automatically generated through Google Translate.
English Version | Other Languages

 JoVE Immunology and Infection

Culturing ושמירה

1, 1, 1

1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

Article
    Downloads Comments Metrics Publish with JoVE

    You must be subscribed to JoVE to access this content.

    Enter your email to receive a free trial:

    Welcome!

    Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!


    By clicking "Submit", you agree to our policies.

    Admit it, you like to watch.

     

    Summary

    difficile Clostridium הוא חיידק פתוגניים שהוא anaerobe מחמיר וגורם לשלשול לאנטיביוטיקה קשור (AAD). כאן, שיטות לבידוד, culturing ושמירה על ג תאים של צמח difficile ונבגים מתוארים. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר דורשת תחזוקה שוטפת על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי טיפוח difficile.

    Date Published: 9/14/2013, Issue 79; doi: 10.3791/50787

    Cite this Article

    Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

    Abstract

    difficile Clostridium הוא אנאירובי, חיידק גראם חיובי, sporogenic שאחראי בעיקר לשלשולי אנטיביוטיקה משויכים (AAD), והוא הפתוגן nosocomial משמעותי. ג difficile קשה לשמצה לבודד ולטפח והוא מאוד רגיש אפילו רמות נמוכות של חמצן בסביבה. כאן, שיטות לבידוד ג difficile מדגימות צואה ולאחר מכן culturing ג difficile להכנה של מניות גליצרול עבור אחסון לטווח ארוך מוצגים. טכניקות להכנה וספירת מניות נבג במעבדה עבור מגוון רחב של יישומים במורד הזרם כוללים מחקרי מיקרוסקופיה ובעלי החיים גם מתוארות. טכניקות אלו מחייבות תא אנאירובי, אשר שומר על סביבת אנאירובי עקבית על מנת להבטיח תנאים נאותים לג האופטימלי צמיחת difficile. אנו מספקים פרוטוקולים להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר בלי caבאמצעות זיהום חמצן משמעותי יחד עם הצעות לתחזוקה שוטפת הנדרשת כדי לקיים את סביבת אנאירובי המתאימה לג יעיל ועקבי טיפוח difficile.

    Introduction

    difficile Clostridium הוא, חיידק יוצר נבג גראם חיובי שהוא anaerobe לחייב והפתוגן במערכת העיכול שעלול להיות קטלני לבני אדם ובעלי חיים. תאר בשנת 1935 תחילה כאורגניזם commensal נמצא בדגימות צואה מיילודים 1, ג difficile מאוחר יותר הוכיח להיות הסוכן סיבתי של קוליטיס pseudomembranous הקשורים לטיפול אנטיביוטי 2. ג זיהומי difficile (CDI) הם קדמו בדרך כלל על ידי טיפול אנטיביוטי שתוצאת שיבוש הפלורה הנורמלית במעי הגס, יצירת נישה לג difficile לשגשג 2. ג difficile מועבר כנבג רדום דרך מסלול הצואה, אוראלי ולאחר מכן נובט בתוך מערכת העיכול, בייצור תאים של צמח מסוגל לייצר כמה רעלים וגורמים למחלת קוליטיס 3 חמורות. CDI הוא לעתים קרובות עקשן לטיפולים קונבנציונליים והן באלהfections לעתים קרובות חוזרים על עצמם 4. כתוצאה מכך, CDI אחראי לעד 4.8 מליארד דולרים בעלויות טיפול רפואי בארצות הברית 5-7.

    ג difficile רגיש מאוד אפילו לרמות נמוכות של חמצן בסביבה. לג difficile להתמיד בסביבה ולהיות מועבר ביעילות ממארח ​​למארח, היווצרות נבג מטבולית פעיל היא 8 קריטיים. בגלל תחזוקת המעבדה ומניפולציה של ג difficile דורש סביבה מבוקרת, אנאירובי, טכניקות אלה מחייבות שימוש בתא אנאירובי. שימוש בתאים אנאירוביים הביאה התאוששות ובידוד של אנאירוביים לחייב 9-11 מוגבר, ואפשר מספר הטכניקות מולקולריות שיש לבצע באווירה אנאירובית.

    בנוסף לג difficile, שימוש אנאירובי קאמרי והתחזוקה המתוארת כאן חליםלאנאירוביים לחייב אחרים, כגון מינים אחרים קלוסטרידיאל (למשל perfringens ג), מינים אחרים במערכת העיכול (מינים למשל Bacteroides 12) ופתוגנים חניכיים (למשל מיני Peptostreptococcus 13).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Protocol

    שים לב: ג difficile הוא פתוגן אדם ובעלי החיים שיכולים לגרום למחלות במערכת העיכול. ניסויים מעורבים ג difficile חייבת להתבצע עם אמצעי זהירות מתאים בטיחות ביולוגית (BSL-2).

    1. אנאירובי קאמרי שימוש ותחזוקה

    ג difficile הוא anaerobe קפדן והוא מאוד רגיש אפילו ריכוזים נמוכים של חמצן באטמוספרה. לכן, יש צורך בסביבה מבוקרת, אנאירובי למניפולציה המוצלחת שלה. השימוש בתא אנאירובי (איור 1 א) מספק סביבה היציבה ביותר ואת התנאים אידיאליים לגידול יעיל של ג difficile וחיידקים אנאירוביים אחרים 14. כאן, אווירה המכילה תערובת גז (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) יכולה להישמר ביציבות.

    כדי להציג את כל פריטים לתוך התא בלי זיהום חמצן משמעותי,מנעל אוויר חייב להיות בשימוש (איור 1). פונקציות מכשיר זה כמחלף גז ופועל באופן אוטומטי, באופן ידני למחצה או ידני. יש מנעל האוויר שתי דלתות: אחת המספק גישה לצד החיצוני של מנעל האוויר והגישה לספק אחרת כדי הפנים של חדר אנאירובי. בהתאם לדגם, מנעל האוויר עשוי להיות דלת נוספת, אשר יכולה להציע גישה לתא אנאירובי סמוך, ובכך לחסוך את העלות של מנעל אוויר נפרד. אלא אם כן ההעברה באופן פעיל פריטים באו מתוך החדר, שתי הדלתות צריכה להישאר סגורות בכל העת, כדי למנוע זיהום חמצן. מנעל האוויר בעל מתג הפעלה / כיבוי בחזית ולוח המכיל ארבעה כפתורים. קווי הגז וצינור משאבת ואקום מחוברים בחלקו האחורי של מנעל האוויר, בסמוך לפנל שבו המתגים להפעלה ידנית מלאה של היחידה נמצאים. מומלץ ששני מחזורי טיהור, שימוש בגז חנקן (N 2), נמצאים בשימוש לפני המילוי למחלף בתערובת גז (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) כדי להפחית את כמות החמצן שהוכנסה לתא. כמו כן, חשוב לא לעזוב גם דלת פתוחה לזמן רב יותר מהזמן הסכום הנדרש כדי להיכנס ולצאת מהמחלף ופריטים לתכנן ניסויים כדי להפחית את התדירות של נע פנימה והחוצה מתא פריטים. נהלי ההפעלה השונות לתאים אנאירוביים ויניל המפורטות להלן. לפני ביצוע פרוטוקולים אלה, להבטיח כי אלה תואמים את הוראות היצרן המצורפות לקאמרי.

    1. מצב אוטומטי
      זהו מצב הניתן לתכנות והתאמה האישי ומבוצע כולו על ידי מנעל האוויר. כדי לתכנת את מנעל האוויר, עיין בהוראות היצרן. תכנית מומלצת לכניסה טיפוסית לחדר כוללת שני מחזורי טיהור באמצעות גז חנקן אחרי מילוי מנעל האוויר בתערובת גזים שמתאימה לאווירה נשמרה בתוך צ'אם מקרובבער. במהלך כל מחזור ואקום, נהלי המפעל הרגילים מציעים משיכת ואקום ל20 inHg וטיהור ל1 inHg.
      1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
      2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
      3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות ואריזות סגורות יש לפתוח לפני תחילת המחזור; הימנעות מלעשות זאת עלולה לעוות וplasticware נזק ומכולות. כדי לשמור על סטריליות, פתח את החבילות מספיק כדי לאפשר חילוף גזים יעיל בלבד.
      4. לחץ על הכפתור 'התחל'.
      5. חכה עד מנעל האוויר שרכב על אופניו במסגרת התכנית והתצוגה קוראת "אנאירובית".
      6. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
      7. להעביר פריטים אל תוך החדר.
      8. סגור את הדלת פנימית.
    2. מצב חצי ידני
      מצב זה עשוי להיות בשימוש בעת העברת פריטים באו מחוץ לחדר והוא הכרחי כאשר גycling הגז בתוך התא הנדרש.
      1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
      2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
      3. הנח פריטים למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
      4. לחץ על תפריט.
      5. לחץ על Start. מנעל האוויר יציג את תפקידו של כל לחצן ולא יגיב עד שזה יסתיים:
        • חץ למעלה: מפעיל את משאבת הוואקום.
        • חץ למטה: יוזם את זרימת החנקן (טיהור) גז.
        • התחל: יוזם את זרימת תערובת גז.
        • תפריט: לחזור לתצוגת ברירת המחדל.
      6. לחץ על "Up", הסרת גז ממנעל האוויר, עד שהתצוגה קוראת 20 inHg.
      7. הקש "Down", ממלא את מנעל האוויר עם חנקן, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg. אל overshoot, כמו זו ייצור לחץ חיובי בתוך מנעל האוויר, אשר עשוי להשפיע על שלמותה.
      8. חזור על שלבים 6 ו -7 לביצוע מחזור טיהור נוסף.
      9. לחץ על "Up" עד שהתצוגה קורא 20 inHg.
      10. לחץ על "התחל", ממלא את המחלף עם תערובת גז, עד שהתצוגה קוראת פחות מ 1 inHg.
      11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
      12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
      13. סגור את הדלת פנימית.
    3. מצב ידני
      במצב זה ניתן להשתמש בכל פעם שהמצבים האוטומטיים או חצי ידני לא עובדים או שאין כוח למנעל האוויר. מצב זה אינו פועל כאשר מנעל האוויר הוא על, ולכן קשה לקבוע את הלחץ בתוך מנעל האוויר. בגלל הוואקום למשוך ופעמים טיהור גז תלויה בשיעורי ואקום וזרימת גז, בהתאמה, את השימוש במד לחץ במחלף נדרש לפקח על הלחץ ולהפחית את הסיכון לפציעה ונזק למנעל האוויר אישיים.
      1. ודא שדלת מנעל האוויר הפנימית סגורה במלואו.
      2. פתח את דלת מנעל האוויר החיצונית.
      3. הנח פריטים, כולל מד הלחץ, למנעל אוויר וסגור את דלת מנעל האוויר החיצונית. אם החדרת נוזלים, להתיר את כובעים באמצע הדרך כדי להבטיח חילוף גזים יעיל. חבילות אטום, כגון לולאות יחסינו וצלחות 96 היטב, יש לפתוח לפני תחילת המחזור.
      4. אתר שלושה המתגים בצד האחורי של מנעל האוויר שכותרתו "מתגי שליטה ידניים". אלה שכותרתו בנפרד כ:
        • ואקום
        • חנקן
        • מיקס גז
      5. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
      6. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
      7. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
      8. להעיף את המתג למתג חנקן עד מד הלחץ קורא כ 1 inHg.
      9. להעיף את מתג ואקום לעבור עד שמד הלחץ קורא כ 20 inHg.
      10. להעיף את המתג למתג גז מערבבים עד שמד הלחץ קורא כ 1 inHg.
      11. פתח את דלת מנעל אוויר פנימית.
      12. להעביר פריטים אל תוך החדר.
      13. סגור את הדלת פנימית.

    2. Culturing, ספירת והאחסון ג difficile מדגימות הצואה

    הליך זה נועד לשחזר ג difficile מדגימות צואה המכיל נבגים ולאחר מכן לשמור על מושבות מבודדות תאים או נבגים של צמח באחסון לטווח ארוך כמו מניות גליצרול. לחלופין, הליך זה יכול לשמש כדי למנות את מספר ג הווה difficile בדגימות צואה (למשל ממחקרים בבעלי חיים). באופן סלקטיבי ואופן דיפרנציאלי כדי להעשיר לג difficile, אגר taurocholate-cefoxitin-cycloserine פרוקטוז (TCCFA) משמש כדי לעכב את הצמיחה של חי צואה נורמלי 15-16. Cycloserine הוא bacteriostatic לחיידקים גראם שליליים, ואילו cefoxitin באופן רחב יותר מעכב את הצמיחה של חיידקים הן גראם שליליים וחיוביים, למעט ג difficile ורוב להיכנס זני cocci. אינדיקטור pH, אדום ניטראלי, יכול להיכלל בטווח הבינוני, כמו התסיסה של פרוקטוז תגרום לירידה ברמת חומציות ושינוי בצבע הבא מאדומים / כתום לצהוב. כדי לשחזר ביעילות נבגים של C. difficile כמו חיידקים וגטטיבי, taurocholate נתרן מלח המרה משמש כדי לגרום לנביטה 17-18. בגלל ג difficile יוצר נבגים, אלכוהול או טיפול בחום של דגימות ניתן להשתמש כדי להפחית או לחסל תאי צמח, מגביל את הצמיחה של חי מזהם, שעשוי להגביר את היעילות של ג התאוששות difficile 19. כפי שהוזכר לעיל, הוא קריטי מראש לצמצם את כל הצלחות לפחות 1-2 שעות בתא אנאירובי לפני שימוש כדי להבטיח את הסרתן של חמצן שיורית. ייבוש אווירng הצלחות לפני השימוש בתא יכולות להפחית את העיבוי. מדיום נוזלי עשוי לחלוף 24 שעות כדי להפחית בהתאם לכמות ויחס שטח אל האוויר של המכל בשימוש.

    לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

    • דגימת צואה
    • מטליות סטרילי
    • לולאות inoculating סטרילי
    • 1x PBS (ראה חומרים)
    • צלחות TCCFA (ראה חומרים)
    • צלחות BHIS (מוח לב עירוי בינוני עם תמצית שמרים) ומרק (ראה חומרים)
    • גליצרול 50% (מעוקר)
    • 10% L-ציסטאין (מעוקר)
    • בקבוקוני אחסון קריוגני

    * לחלופין, ניתן להפיץ מושבות מבודדות על גבי צלחות אגר BHIS, ולאחר מכן לגרד וresuspended במדיום נוזלי BHIS עם גליצרול 15% עבור אחסון לטווח ארוך ב -80 ° C. ** חשוב לציין כי גראם מכתים אינה אסטרטגיה יעילה לזהות ג difficile ישירות מדגימות צואת 23 ג difficile חייב להיות ראשון מבודד מהצמחייה אחרת הנמצאת בצואה.

    1. Resuspend דגימת הצואה ב1x PBS (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולהבטיח שדגימת הצואה היא resuspended באופן מלא ב 1x PBS על ידי vortexing. אם ספירת ג difficile מהצואה, לשקול את דגימת הצואה לפני התוספת של 1x PBS.
    2. לעשות דילולים סידוריים של דגימת צואה המושעית זה ב1x PBS לבידוד או ספירה מתאים של יחידות מושבה להרכיב (CFU) לגרם של צואה.
    3. באמצעות טכניקת aseptic, להחיל על כל דילול סדרתי לצלחות TCCFA 100 μl.
    4. באמצעות סדרה של לולאות inoculating סטרילי, פס התרבות הגישה בקשה למושבות מבודדות או באופן שווה להפיץ את התרבות מוחלת על פני השטח של צלחת TCCFA לספירה של מושבות.
    5. דגירה את הצלחת אנאירובי ל48 שעות על 37 ° C. ניתן לאתר ולזהות ג מושבות difficile בתוך 24 שעות המבוססות עלהמראה השטוח, לא סדיר, קרקע כוס המושבות 15, אם כי זיהוי וספירה מדויקים יותר מושגת אחרי 48 שעות.
    6. באמצעות לולאות inoculating סטרילי, תת כל מושבות הנחזות להיות ג difficile על צלחות מופחתות מראש BHIS אגר, בתוספת L-ציסטאין 0.03% 20. פיק מושבה בודדת, ופס לצלחת ברביעים, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה לכל רבע, כדי לקבל מושבות מבודדות. לחלופין, לספור את ג מושבות difficile של כל דילול (עשוי להתבצע בתנאים אירוביים), ולחשב את מספר יחידות המושבה להרכיב לגרם של דגימת צואה.
    7. אשר ג זיהוי difficile באמצעות גראם מכתים. לאחר גראם מכתים, ג difficile יופיע כמוטות סגולות וכמה תאים עשויים להכיל endospores מסוף. תגובת שרשרת של פולימראז זיהוי (PCR) של גנים המקודדים רעלן B עשוי לספק אישור נוסף שלזני toxigenic של ג difficile 21 תוך הקלדת multilocus רצף (MLST) היא מוצלחת לזיהוי והקלדה מדויקת של זנים ידועים וnontoxigenic של ג difficile 22.
    8. כדי לשמור על מלאי של ג difficile ב -80 ° C, לאסוף פרט, מושבה מבודדת מהצלחת אגר BHIS באמצעות inoculating לולאת סטרילי וresuspend המושבה ב10 מיליליטר של BHIS המופחת מראש מדיום נוזלי בתוספת 0.03% L-ציסטאין. *
    9. דגירה הלילה אנאירובי על 37 מעלות צלזיוס, או עד שהתרבות הופכת להיות עכורה.
    10. הוספת 333 μl של גליצרול 50% ו666 μl של ג תרבות difficile לצינור קירור מיליליטר 1.8 ליצור 15% מניית גליצרול של הזן המבודד.
    11. חוזקה מכסה את צינור הקירור, לערבב היטב ולהסיר את המניות באופן מיידי מהאולם ומקום אנאירובי במקפיא -80 ° C עבור אחסון לטווח ארוך.

    3. Culturing ג difficile

    הליך זה מספק להתאוששות של ג difficile ממניות גליצרול מאוחסנות ב -80 ° C. בגלל להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים עשויים להרוג תאים של צמח, חשוב לשמור על מניות גליצרול קפוא בכל העת. אנו לא ממליצים על השימוש בקרח יבש להעברת זנים ובמתוך החדר כמו האידוי של קרח יבש יכול לשנות את הסביבה בתוך התא. במקום זאת, אנו ממליצים על שימוש במדפי קירור קפוא כדי לשמור על מניות גליצרול קפוא במהלך הובלה. למטרות סלקטיבית והפרש שונים, שלוש תקשורת משמשות בדרך כלל לculturing ג difficile. TCCFA, כפי שפורט לעיל, הוא סלקטיבי לג difficile ומכיל taurocholate נתרן, germinant. עירוי לב המוח בתוספת תמצית שמרים (BHIS) הוא מדיום נפוץ, מועשר, הלא סלקטיבי המאפשר לצמיחה של מגוון רחב של אורגניזמים (איור 2 א) 24. לעתים קרובות, L-cysteinדואר מתווסף לBHIS כסוכן צמצום 20. לבסוף, התוספת של דם לבינוני (איור 2) מאפשרת לנביגה יעילים יותר מאשר על TCCFA ומספקת לצורך זיהוי של הקרינה ירקרקה או ירקרקה הייחודית הוצגה על ידי ג difficile תחת אולטרה סגול ארוך גל (UV) אור 15 (איור 2 ג). כאשר culturing ג difficile ממניות נבג, זה קריטי לזכור שtaurocholate נתרן יש להוסיף למדיום כדי להבטיח נביטה.

    לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

    • מניית גליצרול קפואה (בקירור מדף)
    • לולאות inoculating סטרילי
    • צלחות TCCFA או BHIS (ראה חומרים)
    • BHIS מרק (ראה חומרים)
    • גליצרול 50% (מעוקר)
    • בקבוקוני אחסון קריוגני
    1. הנח את מניית גליצרול הקפואה של ג difficile במדף קירור שכבר מאוחסן ב -80 יחסי ציבור C °IOR להשתמש כדי למנוע הפשרה.
    2. להביא את מניית גליצרול הקפואה בקרח יבש לתוך תא אנאירובי.
    3. באמצעות טכניקת aseptic וinoculating לולאת סטרילי, הנח כמות קטנה של המניות לצלחת ומאיר ברבע אחד של הצלחת.
    4. סובב את צלחת ° 90 ו, באמצעות לולאת inoculating סטרילי חדשה, תמשיך בעירום פני רבע השני.
    5. חזור לרביעים שלישיים והרביעי כדי להבטיח את הבידוד של מושבות בודדות.
    6. מייד להסיר את מניית גליצרול הקפואה מתא אנאירובי ולחזור ל° -80 ג
    7. דגירה את צלחת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C. יש לשים לב מושבות מבודדות בודדות לאחר צמיחה בן לילה.

    4. נבגי טיהור מג difficile

    כפי שנדרש נביגה להישרדות בסביבות עשירה בחמצן ולהעברה יעילה של מחלת 8, ההכנה של מניות נבג היא often נחוץ ליישומים במורד הזרם, אינו מוגבלים למחקרי מיקרוסקופיה ובעלי חיים. חשוב לציין כי ספירת נבגים דורשת חזרות כדי להבטיח שחזור של ספירה. Pipetting מעלה ומטה מספר פעמים בין דילולים גם מפחיתה את האובדן מאז נבגים לדבוק פלסטיק היטב.

    נביגה של ג difficile הוא לא מהיר כמו או הומוגנית כמו מיני sporogenic אחרים. כדי לייעל את ייצור נבג והתאוששות, או בינוני נביגה (SMC) 17,25 או 70:30 בינוני 26 מומלץ. מדיה אחרת הנפוצה הן BHIS, המחייב 4-5 ימים של צמיחה לפני נביגה יעיל נתפסת 27, וClospore, מדיום נוזלי שמייצר כותרות גבוהות של נבגים (אוקטובר 7 - אוקטובר 8 נבגים למיליליטר) לאחר 72 שעות של צמיחה. פרוטוקולים אחרים להשתמש במים קרים כקרח ולא 1X PBS 20, עם זאת, השימוש בתמיסה איזוטונית יכול להפחית את הנבגים מלהידבק זה לזה משטחים אחרים ופלסטיק. לחלופין,כמה חוקרים לטהר נוספים הנבגים שלהם באמצעות שיפוע סוכרוז כדי להסיר באופן מלא תאים ופסולת 29 וגטטיבי.

    לפני שיתחילו, יש להציב את הפריטים הבאים לתוך תא אנאירובי:

    • לולאות inoculating סטרילי
    • BHIS, SMC ו / או 70:30 צלחות (ראו חומרים)
    • BHIS מרק (ראה חומרים)
    • עיקור-מסנן 1x PBS, (ראה חומרים)
    1. תרבות זנים ממניות גליצרול קפוא לצלחות BHIS מופחתות מראש ודגירת אנאירובי הלילה בשעה 37 ° C.
    2. Restreak על כמה SMC המופחת מראש או 70:30 צלחות דגירה אנאירובי ב37 מעלות צלזיוס במשך 24-48 שעות. יצירת נבגים ניתן בעקבות באמצעות מיקרוסקופ לעומת שלב. נבגים יופיעו גטטיבי בהיר ואילו שלב ותאי אם יופיעו כהה שלב. * כחלופה, יכולים להיות מטוהרים נבגים מ70:30 מדיום נוזלי לאחר 24-48 שעות, אשר מניב 10 5 -10 6 נבגים למיליליטר, תלוי בstraiמשמש n.
    3. שימוש inoculating לולאת סטרילי, לגרד צלחות וresuspend התאים 10 מיליליטר סטרילי 1X PBS.
    4. בטל צלחות ולהסיר השעיה נבג מתא אנאירובי. גלולה התאים ב 3,000 XG במשך 15 דקות. לשטוף את התאים פעמיים ב 1x PBS, resuspending באופן מלא את התא גלולה בכל פעם.
    5. דגירה הלילה ב 4 ° C כדי לסייע בתמוגה של גטטיבי ותאים האם.
    6. לדגור על 70 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להרוג את כל תאים של צמח שיורית.
    7. כדי לקבוע יחידות מושבה להרכיב (CFU) למיליליטר, סדרנו לדלל כל הכנת נבג ב 1x PBS וצלחת על BHIS + 0.1% taurocholate נתרן. דגירה צלחות למינימום של 24 שעות לפני ספירת מושבות.
    8. ניתן לאחסן את הנבגים ב 1x PBS בטמפרטורת חדר או או 4 ° C לאחסון ארוך טווח. אם מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס, זה עשוי להיות שימושי כדי לחמם הכנת הנבג ב-C ° 55 במשך 15 דקות כדי לשחזר את הנביטה יעילה.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Representative Results

    דוגמא של ג difficile גדל על BHIS ותקשורת כבשים אנאירובי קולומביה אגר דם שניתן לראות באיור 2. ג difficile יוצר מושבות סדירות שהם שטוחים ובעלי מראה קרקע זכוכית אשר באו לידי ביטוי בשני אמצעי התקשורת. הנה, לבודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, הוא גדל על BHIS אגר, מדיום מועשר, הלא סלקטיבי, ל24 שעות על 37 ° C (איור 2 א). מושבות על אגר דם קולומביה אנאירובי כבשים נראות דומות לאלה שגדלו על BHIS תחת אור הלבן (איור 2), עם זאת, השימוש במדיום זה גם מספק לגילוי של הקרינה ירקרקה או ירקרקה הוצגה על ידי ג difficile תחת אולטרה סגול ארוך גל (UV) אור 15 (איור 2 ג). ג מושבות difficile על אגר TCCFA נראות דומות לגידול על אגר BHIS. בגלל הנוכחות של שני סוגי אנטיביוטיקה במדיום TCCFA, timתקופת דואר של 48 צמיחת hr היא הכרחית לפני ספירת מושבות.

    איור 1
    איור 1. קאמרי מתחנחן מעבדות סוג C ויניל ומרכיביו. () קאמרי ויניל מתחנחן מעבדות סוג C אשר מספקת סביבת עבודה עבור אדם אחד בזמן אחד (42 פנימה x 32 פנימה). הוא מכיל תיבת זרז אוהד (בפינה שמאלית אחורי) אשר מפיצה ומחמם את האוויר, ומחזיק Stak-Pak המכיל זרז פלדיום הנדרש כדי להפחית את זיהום כלשהו חמצן. (ב) מנעל האוויר משמש כמחלף ומספק מנגנון להעברת חומרים בתוך ומחוץ לחדר תוך מניעת זיהום חמצן משמעותי בסביבה אנאירובית. יש מנעל האוויר שתי דלתות: אחת המספק גישה לצד החיצוני של מנעל האוויר והגישה אחרת למתן הפנים של ה דואר קאמרי אנאירובי. מנעל האוויר הוא לתכנות ומאפשר למחזורים מותאמים אישית לכניסה לחדר. זה מפורמט במצבים אוטומטיים, חצי ידניים וידניים. (C) מצורף, כפפות לטקס גמישות מסופקים המאפשרים טווח תנועה מלא ולהגיע בתוך התא. הכפפות מובטחות לשרוול מיוחד שצורף לשרוולים ויניל עם דבק ויניל, המאפשרות החלפה של כפפות מבלי לשבש את האווירה אנאירובי של קאמרי. כפפות Neoprene זמינות אף הם. (ד) דגם 10 הגז Analyzer כל זמן עוקב אחר שניהם חמצן ורמות מימן מתן readout מיידי של האווירה בתוך החדר. יחידה זו מאפשרת התראות מיידיות במקרה של דליפה, תערובת גז שגויה משמשת או בעיות נוספות מתעוררות באמצעות אזעקות נשמעו וLED אור מהבהב.

    "/> Ig2.jpg
    איור 2. הופעתו של ג מושבות difficile באמצעי תקשורת שונות. המראה האופייני השטוח, לא סדיר, קרקע הזכוכית ניכר עם בודד קליני אריתרומיצין רגיש של ג difficile, 630E 30, גדל על אגר BHIS ל24 שעות () ואגרת קולומביה אנאירובי כבשים דם ל48 שעות תחת אור הלבן (ב ') ואור אולטרה סגול ארוך גל (C).

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Discussion

    השיטות שתוארו כאן לאפשר התאוששות פשוטה ומהירה של ג difficile ממגוון רחב של דגימות צואה, כולל בני אדם, עכברים ואוגרים, כמו גם האחסון לטווח הארוך של ג difficile כמו מניות גליצרול או נבג. ג difficile יכול להיות אורגניזם קשה לעיבוד, אך הקפדה על סביבת אנאירובי והיישום של טכניקות אספטיים יכולים לספק לצמיחה איתנה והפחתה בזיהום.

    תאים אנאירוביים: שיקולים ותחזוקה

    ישנם שני סוגים של תאים אנאירוביים: תאים נוקשה או תאים ויניל. תאים נוקשה בדרך כלל עשויים מאלומיניום או פולימר נוקשה (למשל פרספקס או חומרים אקריליים), המאפשרים שימוש בכימיקלים מאכל. ניתן להמיר תאים נוקשה לסגנון בלי כפפות ונוטים פחות דקירות, עם זאת, הדלפות הן קשה לזהות ולמצוא ותאים נוקשה דורשים כמה שיטהלפצות על עקירת גז במהלך שימוש. יחידות הפולימר לעתים קרובות מצוידות במנעל אוויר-טיהור בלבד, אשר עלול לעלות יותר לתפעול. לצורך התחזוקה של תנאים מחמירים באטמוספרה, עלות, גמישות, דרישות שטח מעבדה ותחזוקה קלה, תאים אנאירוביים ויניל מומלצים (מוצרים מתחנחנים מעבדה, איור 1 א). תא אנאירובי זו מורכב מתא הכפפות ויניל כי הוא נתמך על ידי מבנה אלומיניום צינורי והוא מחובר למנעל אוויר המתפקד כמחלף להעברת חומרים בתוך ומחוץ לתא (איור 1), תוך שימוש בכפפות לטקס או ניאופרן מצורף לשרוולים ויניל (תרשים 1C). חשוב לעקוב בדיוק הוראות יצרן ללהגדיר נכון של חדר אנאירובי. זה יכול להיות אחד עם טמפרטורה מבוקרת (או יותר, תלוי בגודל של החדר) יחידות תיבת דוד המספקות זרימת אוויר דרך זרז פלדיום. Ca פלדיוםtalyst משמש כדי להפחית את זיהום החמצן הציג דרך המחלף על ידי הפיכת מימן וחמצן למים. באופן אידיאלי, שתי רמות החמצן והמימן נמצאות תחת פיקוח באמצעות נתח גז (1D איור), בו מוצגות ריכוז חמצן בחלקים למיליון (ppm) וריכוז מימן באחוזים.

    תקשורת נוזלית ומוצקה צריכה להיות מראש מופחתת בתא אנאירובי לפני השימוש. צלחות פטרי (בקוטר 100 מ"מ), ניתן להפחית רק שעות לפני השימוש ביום 31, עם זאת, צריכה להיות מופחתת תקשורת נוזלית לילה. חשוב מכך, צריכה להיות מקוררת תקשורת לפני ההעברה לתא כדי למנוע מהבהב נוזלים במהלך פינוי מנעל אוויר. מוצרים צריכים מפלסטיק, כגון צלחות 96 היטב, צריכים להיות מראש מופחתים לילה לפני השימוש, כמו הפלסטיק הוא נקבובי ויכולים לאחסן מולקולות חמצן 32. בהתאם ליישום, חלק הפלסטיק חייב להיות מראש מופחת לתקופה של עד 48 שעות לפני השימוש 33. פסולת Biohazard צריכה bדואר מסולק כראוי. שקית Biohazard קטנה עשויה להיות כל הזמן בתוך התא, אבל צריך להיות מוחלפת בתדירות גבוהה.

    ריכוז מימן של לפחות 3% חייב להישמר בתוך החדר, כמו זו תבטיח גם צמיחה טובה של ג הסרת חמצן difficile והיעילה. אם ריכוז המימן יורד מתחת ל -3%, או אם החדר לא היה בשימוש במשך כמה ימים, מחזור תא צריך להיות מוצא להורג כדי להחזיר את ריכוז המימן לרמות רצויות. כאן, כשליש מהגז בתא הוא שאב החוצה (תיבת יניל תהיה להוציא את האוויר באופן משמעותי) והוחלף בתערובת גז טרי. להבטיח כי מנעל האוויר הוא אנאירובי לפני תחילת. שאיבת גז יותר מדי לתוך התא יש להימנע, שכן זה לא רק מציב את הלחץ מיותר על התיק ויניל, אלא גם ימנע מהמשתמש להגיע לחלק האחורי של החדר. תמיד לבצע הליך זה באזור מאוורר היטב. לנקוט באמצעי זהירות נוספת, אם צ'הmber נשמר בחדר קטן, לא מאוורר. לפתוח את כל דלתות לחדר כתוכן הגז בתוך החדר יכול להחניק את המשתמש.

    אחזקה נוספות כוללת התחדשות של זרז פלדיום על מנת להבטיח הסרה חמצן יעילה בתוך התא. כמו חמצן והמימן מופחתים על ידי הזרז, מים יכולים להצטבר על פני השטח של כדוריות האלומיניום מכוסה פלדיום, הפחתת יעילותם לאורך זמן. כדי להתגבר על זה, צריכים להיות מחדש זרזי פלאדיום לפחות פעם בשבוע על ידי אפייה לפחות 230 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. בנוסף, כתוצאה משתי הפחתת החמצן ואידוי מים מצלחות ותקשורת, הצטברות מים היא בעיה משותפת בתוך תאים אנאירוביים. כדי להבטיח מניפולציה נוחה ולהגדיל את זמן מחצית החיים של הציוד בתוך החדר, ניתן להשתמש בחבילות יבוש, אבל צריך להיות יבשות בתדירות גבוהה בעקבות אותו ההליך המשמש לזרזי פלדיום. לחלופין, דהאדים עשויים לשמש אשר מפיץ אוויר דרך גוש מתכת שתרכיזי מים והוא נאסף במכל. המכשיר מונע הצפת מיכלי המים, אולם מסירי לחות חייב להיות במעקב ומכולות יש לרוקן כאשר קרובה לתעסוקה מלאה. כדי לנקות את החדר ויניל, השימוש במטלית רכה וכל מנקה זמינה מסחרי המומלצת לפוליוויניל כלוריד (PVC) מומלץ (מנקה פלסטיק קסם למשל, חלק לא. 1,600,480, מתחנחן מעבדות). כדי להימנע מסריטות או נזק לתא ויניל, אין להשתמש במגבות נייר, קים-מגבונים או מוצרים המכילים קטונים או תרכובות אחרות שתפגענה בPVC.

    לבסוף, ג difficile מייצר גז מימן גופרי (H 2 S), וזה מאוד תגובתי ומאכל. מימן גופרתי יכול להזיק למכשור, זרז פלדיום וכל מתכות שנחשפו. אם אפשר, לא להשאיר שום מכשור, כגון homogenizers והספקטרופוטומטרים, בchambאה לתקופות ארוכות, כדי למנוע קורוזיה נגרמת על ידי מימן גופרתי. בגלל הייצור של מימן גופרתי, פריטים כגון מנתח זרז פלדיום וגז יהיה צורך להחליף מעת לעת כחלק מתא תחזוקה השוטפת. חלופות להפחתת רמות מימן גופרתי בתוך התא, כגון שימוש בפחם פעיל, אצטט עופרת, כלוריד כסף או סולפט כסף לקלוט או כימי להסיר את המימן גופרתי, תוארו 34 ועשויות להיות מנוצלים כדי להאט את קורוזיה של ציוד.

    אמצעי זהירות נוסף

    לעולם אל תפתח דלת אחת למנעל האוויר מבלי להבטיח שהדלת אחרת סגורה ונעול כדי למנוע זיהום חמצן. בנוסף, יש להימנע משימוש בפריטים חדים בתוך התא כדי להפחית את הסיכון של ניקוב ויניל.

    חשוב לציין כי מימן הוא גז דליק בנוכחות החמצן. היזהר בעת החדרת פריטי in כדי קאמרי כי רמות גבוהות של זיהום חמצן לא יתרחשו (יותר מ 999 עמודים לדקה). חשוב להשתמש בתערובת גז אנאירובי רק מעורבב מראש דליקה ולעקוב מקרוב אחרת מנתח הגז בתוך החדר, במיוחד בעת השימוש במכל דלק חדש. אם שני ריכוזי המימן וחמצן מעל 4% להתרחש, להבטיח כי נהלי החירום המתאימים, שאמורה להיות מתואר בנהלים של המעבדה הפעלה הסטנדרטי (SOP), אחריו.

    ג פתרון בעיות צמיחת difficile

    אם צמיחה ירודה של ג תרבויות difficile הוא ציין במדיום עשיר, זה לרוב עקב זיהום חמצן בתוך התא. התוספת של סוכן הפחתה (L-ציסטאין למשל או thioglycolate) למדיום עשויה לשפר את הצמיחה, עם זאת, הבעיה של זיהום חמצן בתוך החדר היית צריכה להיות מטופל. ניטור רמות חמצן והמימן בתוך התא באמצעות נתח גז יכול במהירותlert למשתמש בעיות לפני שעיכוב בהתקדמות וירידה בפריון מתרחש. אם זיהום החמצן מתרחש, זיהוי המקור עם גלאי דליפת גז (זמינים ממעבדות מתחנחנים) במהירות מומלץ. כדי להגדיל את הסיכוי למצוא את המיקום של נזילה, סמרטוט הספוג באלכוהול עשוי להיות ממוקם בתוך התא מאז גלאי דליפת גז יכולים לזהות רמות גבוהות של פחמימנים, כמו גם רמות מוגברות של מימן. ברגע שמקור הדליפה נמצא, זה ניתן לתיקון באמצעות דבק או סיליקון הבא הוראות היצרן.

    מספר אורגניזמים לגדול בקלות בסביבות אנאירובי, בם מינים אחרים נפוצים קלוסטרידיאל (למשל Clostridium perfringens) וanaerobe פקולטטיבי, Escherichia coli. טכניקת aseptic ואסטרטגיות אחרות יכולים להפחית את הסיכון לזיהום. ארגון מתאים בתוך התא, כגון הצבת פריטים בהישג יד כדי להפחית את פוטנציאל fאו נשפך וההסרה מיידית של פסולת ביולוגית מסוכנת שנצברה, יכולים להפחית את סיכוני זיהום. בנוסף, מגבות נייר טבולות בתמיסת אקונומיקה מהולה יכולות להיות מובאות מעת לעת אל תוך החדר כדי לנגב את משטחים ואת הכפפות לטקס או ניאופרן. זה קריטי לא להשאיר פתרונות אקונומיקה או אלכוהול בתוך החדר לפרקי זמן ארוכים כמו אלה יכולים לחדור את האטמוספרה ותקשורת מוצקה ונוזלית, והרג את ג difficile, כמו גם פגיעה ביניל 34. בנוסף, החלפה סדירה של הכפפות לטקס או ניאופרן יכולה גם להפחית את הסיכון לזיהום. כאמור, אם לא בטוח אם האורגניזם הוא ג difficile או מזהם, בדיקה לנוכחות של גן tdcB באמצעות PCR יכול לקבוע במהירות אם האורגניזם הוא ג difficile 21. לבסוף, אם טיפוח אורגניזמים מרובים באותו התא אנאירובי, חשוב לציין כי ג difficile יכול לייצר תוצרי לוואי מטבולים . גרם. מימן גופרתי) המעכבים את הצמיחה של אורגניזמים אנאירוביים אחרים ולהיפך.

    Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

    Disclosures

    אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

    Acknowledgements

    ברצוננו להודות למתחנחן מעבדות באדיבות מתן תמונות של חדר אנאירובי. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענק DK087763 (SMM) ותכנית לימודים STEP / HHMI פיתוח מלגה (Ane).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Proteose Peptone no. 2 BD 212120
    Na2HPO4 Fisher S373
    KH2PO4 Fisher BP362
    NaCl Fisher S27
    MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
    á´…-Fructose Fisher L96
    Sodium taurocholate Sigma T4009
    á´…-cycloserine Sigma C6880
    Cefoxitin Fluka C4786
    Brain heart infusion medium BD 237300
    Proteose Peptone BD 211684
    (NH4)2SO4 Sigma A5132
    Tris base Fisher BP152
    Agar BD 214010
    L-cysteine Sigma C7755
    BactoPeptone BD 211684
    Columbian sheep blood agar Fisher L21928
    NaCl Fisher S27
    KCl Fisher P217
    Glycerol Fisher BP2291
    Sterile inoculating loops Fisher 22363596
    Sterile swabs Fisher 1495990
    Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
    Materials
    TCCFA agar

    Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
    Na2HPO4 5 g
    KH2PO4 1 g
    NaCl 2 g
    MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
    Fructose 6 g
    Agar 20 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    After autoclaving, add:
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
    25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
    1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

    BHIS Medium

    Brain heart infusion 37 g
    Yeast extract 5 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):

    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

    SMC Sporulation Medium

    BactoPeptone 90 g
    Protease peptone 5 g
    (NH4)2SO4 1 g
    Tris base 1.5 g
    Agar 15 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):
    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

    70:30 Medium

    BactoPeptone 63 g
    Protease peptone 3.5 g
    Brain heart infusion 11.1 g
    Yeast extract 1.5 g
    (NH4)2SO4 0.7 g
    Tris base 1.06 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

    Blood agar

    The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

    1X Phosphate buffered saline (PBS)

    NaCl 8.01 g
    KCl 0.2 g
    Na2HPO4 1.44 g
    KH2PO4 0.27 g

    Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

    References

    1. Hall, I. C., O'Toole, E. Intestinal flora in new-borin infants - With a description of a new pathogenic anaerobe, Bacillus difficilis. Am. J. Dis. Child. 49, 390-402 (1935).
    2. Tedesco, F. J., Barton, R. W., Alpers, D. H. Clindamycin-Associated Colitis - Prospective Study. Ann. Intern. Med. 81, 429-433 (1974).
    3. Gerding, D. N. Clostridium difficile 30 years on: what has, or has not, changed and why. Int. J. Antimicrob. Agents. 33, 2-8 (2009).
    4. Gerding, D. N., Muto, C. A., Owens, R. C. Treatment of Clostridium difficile infection. Clin. Infect. Dis. 46, Suppl 1. 32-42 (2008).
    5. Dubberke, E. R., Olsen, M. A. Burden of Clostridium difficile on the healthcare system. Clin. Infect. Dis. 55, 88-92 (2012).
    6. Bouza, E. Consequences of Clostridium difficile infection: understanding the healthcare burden. Clin. Microbiol. Infect. 18, 5-12 (2012).
    7. Peery, A. F., et al. Burden of gastrointestinal disease in the United States: 2012 update. Gastroenterology. 143, 1171-1173 (2012).
    8. Deakin, L. J., et al. The Clostridium difficile spo0A gene is a persistence and transmission factor. Infect. Immun. 80, 2704-2711 (2012).
    9. Drasar, B. S. Cultivation of anaerobic intestinal bacteria. J. Pathol. Bacteriol. 94, 417-427 (1967).
    10. Leach, P. A., Bullen, J. J., Grant, I. D. Anaerobic CO 2 cabinet for the cultivation of strict anerobes. Appl. Microbiol. 22, 824-827 (1971).
    11. Killgore, G. E., Starr, S. E., Del Bene,, Whaley, V. E., N, D., Dowell, V. R. Comparison of three anaerobic systems for the isolation of anaerobic bacteria from clinical specimens. Am. J. Clin. Pathol. 59, 552-559 (1973).
    12. Bacic, M. K., Smith, C. J. Laboratory maintenance and cultivation of bacteroides species. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 13, Unit 13C 11 (2008).
    13. Doan, N., Contreras, A., Flynn, J., Morrison, J., Slots, J. Proficiencies of three anaerobic culture systems for recovering periodontal pathogenic bacteria. J. Clin. Microbiol. 37, 171-174 (1999).
    14. Socransky, S., Macdonald, J. B., Sawyer, S. The cultivation of Treponema microdentium as surface colonies. Arch. Oral. Biol. 1, 171-172 (1959).
    15. George, W. L., Sutter, V. L., Citron, D., Finegold, S. M. Selective and differential medium for isolation of Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 9, 214-219 (1979).
    16. Wilson, K. H., Silva, J., Fekety, F. R. Suppression of Clostridium difficile by normal hamster cecal flora and prevention of antibiotic-associated cecitis. Infect. Immun. 34, 626-628 (1981).
    17. Wilson, K. H., Kennedy, M. J., Fekety, F. R. Use of sodium taurocholate to enhance spore recovery on a medium selective for Clostridium difficile. J. Clin. Microbiol. 15, 443-446 (1982).
    18. Bliss, D. Z., Johnson, S., Clabots, C. R., Savik, K., Gerding, D. N. Comparison of cycloserine-cefoxitin-fructose agar (CCFA) and taurocholate-CCFA for recovery of Clostridium difficile during surveillance of hospitalized patients. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 29, 1-4 (1997).
    19. Marler, L. M., et al. Comparison of five cultural procedures for isolation of Clostridium difficile from stools. J. Clin. Microbiol. 30, 514-516 (1992).
    20. Sorg, J. A., Dineen, S. S. Laboratory maintenance of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 1 (2009).
    21. Bouillaut, L., McBride, S. M., Sorg, J. A. Genetic manipulation of Clostridium difficile. Curr. Protoc. Microbiol. Chapter 9, Unit 9A 2 (2011).
    22. Lemee, L., Pons, J. L. Multilocus sequence typing for Clostridium difficile. Methods. Mol. Biol. 646, 77-90 (2010).
    23. Shanholtzer, C. J., Peterson, L. R., Olson, M. N., Gerding, D. N. Prospective study of gram-stained stool smears in diagnosis of Clostridium difficile colitis. J. Clin. Microbiol. 17, 906-908 (1983).
    24. Smith, C. J., Markowitz, S. M., Macrina, F. L. Transferable tetracycline resistance in Clostridium difficile. Antimicrob. Agents Chemother. 19, 997-1003 (1981).
    25. Permpoonpattana, P., et al. Surface layers of Clostridium difficile endospores. J. Bacteriol. 193, 6461-6470 (2011).
    26. Putnam, E. E., Nock, A. M., Lawley, T. D., Shen, A. SpoIVA and SipL are Clostridium difficile spore morphogenetic proteins. J. Bacteriol. (2013).
    27. Burns, D. A., Minton, N. P. Sporulation studies in Clostridium difficile. J. Microbiol. Methods. 87, 133-138 (2011).
    28. Perez, J., Springthorpe, V. S., Sattar, S. A. Clospore: a liquid medium for producing high titers of semi-purified spores of Clostridium difficile. J. AOAC Int. 94, 618-626 (2011).
    29. Sorg, J. A., Sonenshein, A. L. Inhibiting the initiation of Clostridium difficile spore germination using analogs of chenodeoxycholic acid, a bile acid. J. Bacteriol. 192, 4983-4990 (2010).
    30. O'Connor, J. R., et al. Construction and analysis of chromosomal Clostridium difficile mutants. Mol. Microbiol. 61, 1335-1351 (2006).
    31. Buggy, B. P., Wilson, K. H., Fekety, R. Comparison of methods for recovery of Clostridium difficile from an environmental surface. J. Clin. Microbiol. 18, 348-352 (1983).
    32. Koch, C. J., Kruuv, J. The release of oxygen from polystyrene Petri dishes. Br. J. Radiol. 45, 787-788 (1972).
    33. Ethapa, T., et al. Multiple factors modulate biofilm formation by the anaerobic pathogen Clostridium difficile. J. Bacteriol. (2012).
    34. Speers, A. M., Cologgi, D. L., Reguera, G. Anaerobic cell culture. Curr. Protoc. Microbiol. Appendix 4, Appendix 4F (2009).
    35. Lyras, D., et al. Toxin B is essential for virulence of Clostridium difficile. Nature. 458, 1176-1179 (2009).

    Comments

    0 Comments

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Metrics

    Waiting
    simple hit counter