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 JoVE Immunology and Infection

El cultivo y mantenimiento

1, 1, 1

1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

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    Summary

    Clostridium difficile es una bacteria patógena que es un anaerobio estricto y causa diarrea asociada a antibióticos (DAA). Aquí, métodos para aislar, cultivar y mantener C. se describen las células vegetativas y esporas difficile. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que requiere un mantenimiento regular para garantizar las condiciones adecuadas para una óptima C. cultivo difficile.

    Date Published: 9/14/2013, Issue 79; doi: 10.3791/50787

    Cite this Article

    Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

    Abstract

    Clostridium difficile es un anaerobio, bacteria Gram-positiva, esporogénica que es el principal responsable de la diarrea asociada a antibióticos (DAA) y es un patógeno nosocomial significativo. C. difficile es notoriamente difícil de aislar y cultivar y es extremadamente sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Aquí, métodos para aislar C. difficile a partir de muestras fecales y, posteriormente, el cultivo de C. difficile para la preparación de los stocks de glicerol para el almacenamiento a largo plazo se presentan. También se describen técnicas para la preparación y la enumeración de las existencias de esporas en el laboratorio para una variedad de aplicaciones posteriores, incluyendo estudios de microscopía y animales. Estas técnicas requieren una cámara anaeróbica, que mantiene un ambiente anaeróbico coherente para garantizar condiciones adecuadas para óptima C. crecimiento difficile. Proporcionamos protocolos para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara sin Cautilizando una contaminación significativa de oxígeno, junto con sugerencias para el mantenimiento regular necesario para mantener el medio ambiente anaeróbico apropiado para una eficiente y consistente C. cultivo difficile.

    Introduction

    Clostridium difficile es una bacteria formadora de esporas Gram-positivo que es un anaerobio obligado y un patógeno gastrointestinal potencialmente fatal de los seres humanos y animales. Inicialmente descrito en 1935 como un organismo comensal encuentra en las muestras de heces de los recién nacidos 1, C. difficile más tarde se demostró que era el agente causante de la colitis pseudomembranosa asociada con el tratamiento antibiótico 2. C. infecciones difficile (CDI) son típicamente precedidas de un tratamiento con antibióticos que resulta en la alteración de la flora normal del colon, creando un nicho para C. difficile prospere 2. C. difficile se transmite como una espora latente a través de la vía fecal-oral y posteriormente germina dentro del tracto gastrointestinal, produciendo células vegetativas capaz de generar varias toxinas y causando la enfermedad grave y la colitis 3. CDI suelen ser refractarios a los tratamientos convencionales y estos eninfecciones son frecuentemente recurrente 4. Como resultado, los CDI son responsables de hasta $ 4.8 mil millones en costos de atención de la salud en los Estados Unidos 5-7.

    C. difficile es muy sensible a incluso niveles bajos de oxígeno en el medio ambiente. Para C. difficile de persistir en el medio ambiente y se transmite de manera eficiente de un huésped a otro, la formación de una espora metabólicamente inactiva es crítica 8. Debido a que el mantenimiento de laboratorio y la manipulación de C. difficile requiere un ambiente anaeróbico controlado, estas técnicas requieren el uso de una cámara anaeróbica. El uso de cámaras anaeróbicas se ha traducido en un aumento de la recuperación y el aislamiento de anaerobios obligados 9-11, y ha permitido una serie de técnicas moleculares que se deben realizar en un ambiente anaeróbico.

    Además de C. difficile, el uso cámara anaeróbica y mantenimiento descritos aquí son aplicablesa otros anaerobios obligados, como otras especies clostridiales (por ejemplo, C. perfringens), otras especies gastrointestinales (por ejemplo, especies de Bacteroides 12) y patógenos periodontales (por ejemplo, especies de Peptostreptococcus 13).

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    Protocol

    Nota: C. difficile es un patógeno humano y animal que puede causar enfermedad gastrointestinal. Los experimentos con C. difficile debe realizarse con las precauciones de bioseguridad apropiadas (BSL-2).

    1. Cámara anaeróbica de uso y mantenimiento

    C. difficile es un anaerobio estricto y es extremadamente sensibles incluso a concentraciones bajas de oxígeno en la atmósfera. Por lo tanto, se necesita un ambiente anaeróbico controlada para su manipulación con éxito. El uso de una cámara anaeróbica (Figura 1A) proporciona el entorno más estable y las condiciones ideales para el cultivo efectivo de C. difficile y otras bacterias anaerobias 14. Aquí, una atmósfera que contiene una mezcla de gases (5% de CO 2, 10% de H 2, 85% de N 2) se puede mantener de forma estable.

    Para introducir ningún artículo dentro de la cámara sin contaminación significativa de oxígeno,una esclusa de aire debe ser utilizado (Figura 1B). Este dispositivo funciona como un intercambio de gases y funciona de forma automática, semi-manualmente o de forma manual. La esclusa de aire tiene dos puertas: una que proporciona acceso a la parte exterior de la esclusa de aire y la otra que proporciona acceso al interior de la cámara anaeróbica. Dependiendo del modelo, la esclusa de aire puede tener una puerta adicional, que puede ofrecer acceso a una cámara anaeróbica contigua, ahorrando así el costo de una esclusa de aire separada. A no ser que se mueve activamente elementos dentro o fuera de la cámara, las dos puertas deben permanecer cerradas en todo momento para evitar la contaminación de oxígeno. La esclusa de aire posee un interruptor de encendido / apagado en la parte frontal y un panel que contiene cuatro botones. Las líneas de gas y manguera de la bomba de vacío se conectan en la parte posterior de la cámara de aire, cerca del panel donde se encuentran los interruptores de operación manual completa de la unidad. Se recomienda que dos ciclos de purga, utilizando gas nitrógeno (N 2), se utilizan antes de llenar el intercambio con la mezcla de gases (CO2 al 5%, 10% de H 2, 85% de N 2) para reducir la cantidad de oxígeno introducido en la cámara. También es importante no dejar ya sea puerta abierta durante más tiempo que el tiempo de la cantidad requerida para mover los elementos en y fuera de el intercambio y para planificar cuidadosamente experimentos para reducir la frecuencia de los elementos en movimiento dentro y fuera de la cámara. Los diferentes procedimientos de funcionamiento de cámaras anaeróbicas vinilo se describen a continuación. Antes de seguir estos protocolos, asegúrese de que sean compatibles con las instrucciones del fabricante suministradas con la cámara.

    1. Modo Automático
      Este es un modo programable y personalizable y se lleva a cabo en su totalidad por la esclusa de aire. Para programar la esclusa de aire, refiérase a las instrucciones del fabricante. Un programa recomendado para la entrada típica en la cámara incluye dos ciclos de purga con gas nitrógeno, seguido de recarga de la esclusa de aire con una mezcla de gases que se ajusta a la atmósfera mantenida dentro de la cámaraber. Durante cada ciclo de vacío, los procedimientos estándar de fábrica sugieren un vacío de 20 pulgadas Hg y purgar a 1 inHg.
      1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
      2. Abra la compuerta exterior.
      3. Coloque los artículos en la esclusa de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Envases y recipientes sellados se deben abrir antes de comenzar el ciclo; abstenerse de hacerlo puede deformar y plástico daños y contenedores. Para mantener la esterilidad, abra los paquetes suficientes sólo para permitir el intercambio de gases eficiente.
      4. Pulse el botón Inicio.
      5. Espere hasta que la cámara de aire se ha completado un ciclo a través del programa y en la pantalla se lee "anaeróbico".
      6. Abrir compuerta interior.
      7. Mover elementos dentro de la cámara.
      8. Cierre la puerta interior.
    2. Modo Semimanual
      Este modo se puede utilizar cuando se mueve artículos en o fuera de la cámara y es cuando sea necesario CSe requiere ycling el gas dentro de la cámara.
      1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
      2. Abra la compuerta exterior.
      3. Coloque los artículos en la esclusa de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Paquetes sellados, tales como asas de inoculación y placas de 96 pocillos, se deben abrir antes de comenzar el ciclo.
      4. Pulse Menú.
      5. Pulse Inicio. La esclusa de aire mostrará la función de cada botón y no responderá hasta que se termine esto:
        • Flecha arriba: activa la bomba de vacío.
        • Flecha abajo: inicia el nitrógeno (purga) de flujo de gas.
        • Iniciar: inicia el flujo de la mezcla de gas.
        • Menú: volver a la pantalla predeterminada.
      6. Pulse el botón "Up", la eliminación de gas de la cámara de aire, hasta que la pantalla muestre 20 pulgadas Hg.
      7. Pulse el botón "Down", el llenado de la esclusa con nitrógeno, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg. No overshoot, ya que esto va a crear una presión positiva dentro de la bolsa de aire, lo que puede afectar su integridad.
      8. Repita los pasos 6 y 7 para realizar un ciclo de purga adicional.
      9. Pulse el botón "Up" hasta que la pantalla muestre 20 pulgadas Hg.
      10. Pulse el botón "Inicio", llenando el intercambio con la mezcla de gas, hasta que la pantalla muestre menos de 1 inHg.
      11. Abrir compuerta interior.
      12. Mover elementos dentro de la cámara.
      13. Cierre la puerta interior.
    3. Modo Manual
      Este modo se puede utilizar siempre que los modos automático o semi-manuales no funcionan o no hay alimentación a la esclusa de aire. Este modo no funciona cuando la cámara de aire está encendido, por lo tanto, es difícil determinar la presión dentro de la cámara de aire. Debido a que el vacío tire y tiempos de purga de gas depende de las tasas de vacío y de flujo de gas, respectivamente, se requiere el uso de un medidor de presión dentro del intercambio para controlar la presión y reducir el riesgo de lesiones personales y daños a la esclusa de aire.
      1. Asegúrese de que la compuerta interior está totalmente cerrada.
      2. Abra la compuerta exterior.
      3. Coloque los artículos, incluyendo el medidor de presión, en la cámara de aire y cerrar la compuerta exterior. Si la introducción de líquidos, desenroscar las tapas hasta la mitad para asegurar el intercambio de gases eficiente. Paquetes sellados, tales como asas de inoculación y placas de 96 pocillos, se deben abrir antes de comenzar el ciclo.
      4. Localice los tres interruptores en la parte trasera de la cámara de descompresión etiquetada "Interruptores de control manual." Estos están etiquetados individualmente como:
        • Para Vacuum
        • Nitrógeno
        • Mezcla de gas
      5. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
      6. Activa el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
      7. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
      8. Activa el interruptor de palanca de nitrógeno hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
      9. Activa el interruptor al vacío de palanca hasta que el manómetro lee aproximadamente 20 pulgadas Hg.
      10. Activa el interruptor de palanca Gas Mezcla hasta que el manómetro indique aproximadamente 1 inHg.
      11. Abrir compuerta interior.
      12. Mover elementos dentro de la cámara.
      13. Cierre la puerta interior.

    2. El cultivo, la enumeración y Almacenamiento C. difficile en muestras de heces

    Este procedimiento está diseñado para recuperar C. difficile en muestras fecales que contiene esporas y mantendrá después, las colonias aisladas como las células vegetativas o esporas en el almacenamiento a largo plazo como stocks de glicerol. Alternativamente, este procedimiento se puede utilizar para enumerar el número de C. presente difficile en muestras de heces (por ejemplo, de estudios en animales). Para enriquecer selectivamente y diferencialmente para C. difficile, taurocolato de agar-cefoxitina-cicloserina-fructosa (TCCFA) se utiliza para inhibir el crecimiento de la flora fecal normales 15-16. Cicloserina es bacteriostática para las bacterias Gram-negativas, mientras que cefoxitina inhibe de manera más amplia el crecimiento de bacterias tanto Gram-negativos y positivos, con la excepción de C. difficile y más entran cepas cocos. Un indicador de pH, rojo neutro, se puede incluir en el medio, como la fermentación de fructosa dará lugar a una disminución en el pH y un cambio de color posterior de rojo / naranja a amarillo. Para recuperar de manera eficiente las esporas de C. difficile como bacterias vegetativas, el taurocolato de sodio sal biliar se utiliza para inducir la germinación 17-18. Debido C. difficile forma esporas, el alcohol o el tratamiento térmico de las muestras se puede utilizar para reducir o eliminar las células vegetativas, limitando el crecimiento de la flora contaminante, lo que puede aumentar la eficiencia de C. recuperación difficile 19. Como se mencionó anteriormente, es crítico para pre-reducir todas las placas durante al menos 1-2 horas en la cámara anaeróbica antes de su uso para asegurar la eliminación de oxígeno residual. Dryi Aireng las placas antes de su uso en la cámara pueden reducir la condensación. Medio líquido puede necesitar hasta 24 horas para reducir en función del volumen y la relación superficie-aire del recipiente utilizado.

    Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

    • Muestra de heces fecales
    • Hisopos estériles
    • Bucles de inoculación estéril
    • 1x PBS (ver Materiales)
    • Placas TCCFA (ver Materiales)
    • BHIS (Brain Heart Infusion medio con extracto de levadura) y placas de caldo (ver Materiales)
    • 50% de glicerol (esterilizada)
    • 10% de L-cisteína (esterilizada)
    • Viales criogénicas

    * Alternativamente, las colonias aisladas se pueden propagar sobre placas de agar BHIS, y posteriormente se rasparon y se resuspendieron en medio líquido BHIS con 15% de glicerol para su almacenamiento a largo plazo a -80 ° C. ** Es importante notar que la tinción de Gram no es una estrategia efectiva para identificar C. difficile directamente a partir de muestras de heces 23 C. difficile primero debe estar aislada de las otras especies de flora presentes en la materia fecal.

    1. Resuspender la muestra de heces en 1x PBS (esto puede llevarse a cabo en condiciones aeróbicas), y asegurar que la muestra de materia fecal está totalmente resuspendió en PBS 1x por agitación. Si la enumeración de C. difficile a partir de las heces, pesar la muestra de heces antes de la adición de PBS 1x.
    2. Hacer diluciones seriadas de la muestra de heces resuspendido en PBS 1X para el aislamiento o la enumeración adecuada de unidades formadoras de colonias (UFC) por gramo de heces.
    3. Utilizando una técnica aséptica, se aplican 100 l de cada dilución en serie a placas de TCCFA.
    4. El uso de una serie de bucles de inoculación estéril, racha de la cultura aplicada para colonias aisladas o difundir la cultura aplicado en la superficie de la placa de TCCFA para la enumeración de colonias de manera uniforme.
    5. Incubar la placa anaeróbicamente durante 48 horas a 37 ° C. Es posible detectar e identificar C. colonias difficile en 24 hr basan enla apariencia plana, irregular de vidrio esmerilado de las colonias 15, aunque se logra una identificación más precisa y enumeración después de 48 hr.
    6. El uso de loops de inoculación estéril, subcultivar las colonias que parecen ser C. difficile en pre-reducción de las placas de agar BHIS, complementado con 0,03% de L-cisteína 20. Elige una colonia individual, y consecutivas sobre la placa en cuadrantes, utilizando un nuevo bucle de inoculación estéril para cada cuadrante, para obtener colonias aisladas. Alternativamente, cuente el C. colonias difficile de cada dilución (esto puede llevarse a cabo en condiciones aeróbicas), y calcular el número de unidades formadoras de colonias por gramo de muestra de heces formando.
    7. Confirmar C. identificación difficile mediante la tinción de Gram. Después de la tinción de Gram, C. difficile aparecerá como barras de color púrpura y algunas células puede contener endosporas terminales. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) la identificación de los genes que codifican la toxina B puede proporcionar una confirmación adicional decepas toxigénicas de C. difficile 21, mientras que la secuencia de multilocus escribiendo (MLST) tiene éxito para la identificación y tipificación precisa de cepas desconocidas y no toxigénicas de C. difficile 22.
    8. Para mantener un stock de C. difficile a -80 ° C, recoger un individuo, colonia aislada de la placa de agar BHIS usando un asa de inoculación estéril y resuspender la colonia en 10 ml de BHIS de pre-reducción de medio líquido suplementado con 0,03% de L-cisteína. *
    9. Incubar toda la noche en condiciones anaerobias a 37 ° C, o hasta que el cultivo se vuelve turbia.
    10. Añadir 333 l de 50% de glicerol y 666 l de la C. cultura difficile a un tubo criogénico ml 1.8 para crear un stock de glicerol de la cepa aislada del 15%.
    11. Estrechamente tapar el tubo criogénico, mezclar bien y retirar de inmediato la acción de la cámara anaeróbica y colocar en un congelador -80 ° para el almacenamiento a largo plazo.

    3. El cultivo de C. difficile

    Este procedimiento proporciona para la recuperación de C. difficile de las existencias almacenadas de glicerol a -80 ° C. Debido a que los ciclos de congelación-descongelación pueden destruir las células vegetativas, es importante mantener los stocks de glicerol congelado en todo momento. No se recomienda el uso de hielo seco para la transferencia de cepas dentro y fuera de la cámara como la evaporación del hielo seco puede cambiar el ambiente dentro de la cámara. En su lugar, se recomienda el uso de bastidores de refrigeración congelado para mantener las reservas de glicerol congelados durante el transporte. Para diversos fines selectivos y diferenciales, tres medios de comunicación se utilizan comúnmente para el cultivo de C. difficile. TCCFA, como se discutió anteriormente, es selectiva para C. difficile y contiene taurocolato de sodio, un germinantes. Infusión de corazón cerebro suplementado con extracto de levadura (BHIS) es un medio enriquecido comúnmente utilizado,, no selectivo que permite el crecimiento de una amplia variedad de organismos (Figura 2A) 24. Frecuentes, L-cisteínae se añade a BHIS como agente reductor 20. Finalmente, la adición de la sangre al medio (Figura 2B) permite para la esporulación más eficiente que en TCCFA y proporciona para la detección de la única fluorescencia verdosa o verde pálido exhibido por C. difficile en virtud de onda larga ultravioleta (UV) 15 (Figura 2 C). Cuando el cultivo de C. difficile de las existencias de esporas, es fundamental recordar que taurocolato de sodio debe ser añadido al medio para asegurar la germinación.

    Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

    • Glicerol congelado Stock (en rejilla de refrigeración)
    • Bucles de inoculación estéril
    • Placas TCCFA o BHIS (ver Materiales)
    • BHIS caldo (ver Materiales)
    • 50% de glicerol (esterilizada)
    • Viales criogénicas
    1. Coloque el glicerol congelada de C. difficile en una rejilla de refrigeración que se ha almacenado a -80 ° C PRIOR utilizar para evitar la descongelación.
    2. Llevar el glicerol congelado en hielo seco en la cámara anaeróbica.
    3. Utilizando una técnica aséptica y un asa de inoculación estéril, coloque una pequeña cantidad de la población sobre la placa y rayos de luz sobre un cuadrante de la placa.
    4. Gire la placa de 90 ° y, con un nuevo bucle de inoculación estéril, siguen en racha el segundo cuadrante.
    5. Repetir para los tercero y cuarto cuadrantes para asegurar el aislamiento de colonias individuales.
    6. Quitarse de inmediato la acción del glicerol congelada de la cámara anaeróbica y volver a la -80 ° C.
    7. Incubar la placa anaeróbicamente durante la noche a 37 ° C. Individuales colonias aisladas deben ser observados después del crecimiento durante la noche.

    4. Purificar Las esporas de C. difficile

    Como se requiere la esporulación para la supervivencia en ambientes ricos en oxígeno y para la transmisión eficiente de la enfermedad 8, la preparación de las existencias de esporas es often necesaria para las aplicaciones posteriores, no se limita a los estudios de microscopía y animales. Es importante señalar que la enumeración de las esporas requiere la repetición para asegurar la reproducibilidad de los recuentos. Medir con una pipeta hacia arriba y abajo varias veces entre diluciones también reduce la pérdida desde esporas se adhieren al plástico también.

    La esporulación de C. difficile no es tan rápida o tan homogénea otras especies esporogénicas. Para optimizar la producción y la recuperación de esporas, se recomienda, ya sea medio de esporulación (SMC) 17,25 o 70:30 medio 26. Otros medios utilizados son BHIS, que requiere 4-5 días de crecimiento antes de la esporulación eficiente se ve 27 y Clospore, un medio líquido que produce altos títulos de esporas (julio 10 a agosto 10 esporas por mililitro) después de 72 h de crecimiento. Otros protocolos utilizan agua enfriada con hielo en lugar de PBS 1X 20, sin embargo, el uso de una solución isotónica puede reducir esporas se peguen entre sí y superficies de plástico. Alternativamente,algunos investigadores purifican aún más sus esporas usando un gradiente de sacarosa para eliminar completamente las células vegetativas y los desechos 29.

    Antes de comenzar, los siguientes elementos deben ser colocados en la cámara anaeróbica:

    • Bucles de inoculación estéril
    • BHIS, SMC y / o 70:30 placas (ver Materiales)
    • BHIS caldo (ver Materiales)
    • Esterilizada con filtro 1x PBS, (ver Materiales)
    1. Cultura cepas a partir de glicerol congelado Stock en placas BHIS pre-reducido y se incuba en condiciones anaerobias durante la noche a 37 ° C.
    2. Restreak en varios pre-reducido SMC o 70:30 placas e incubar anaeróbicamente a 37 ° C durante 24-48 horas. La formación de esporas se puede seguir a través de microscopía de contraste de fase. Las esporas aparecerán fase vegetativa brillante, mientras que las células madre y aparecerá oscura fase. * Como alternativa, las esporas se pueden purificar a partir del medio líquido de 70:30 después de 24-48 horas, lo que da 10 5 -10 6 esporas por mililitro, dependiendo de la strain utilizado.
    3. El uso de un asa de inoculación estéril, raspar las placas y resuspender las células en 10 ml de 1x PBS estéril.
    4. Deseche las placas y retire la suspensión de esporas de la cámara anaeróbica. Sedimentar las células a 3000 xg durante 15 minutos. Lavar las células dos veces en PBS 1x, resuspender completamente el sedimento de células cada vez.
    5. Incubar durante la noche a 4 º C para ayudar en la lisis de las células madre y vegetativo.
    6. Se incuba a 70 ° C durante 20 min para eliminar las células vegetativas residuales.
    7. Para determinar unidades formadoras de colonias (UFC) por mililitro de formación, en serie diluir cada preparación de esporas en 1 x PBS y la placa sobre BHIS + 0,1% taurocolato de sodio. Incubar las placas durante un mínimo de 24 horas antes de la enumeración de colonias.
    8. Las esporas pueden ser almacenados en 1x PBS a temperatura ambiente oa 4 ° C para el almacenamiento a largo plazo. Si se almacena a 4 ° C, puede ser útil para recalentar la preparación de esporas a 55 ° C durante 15 min para restaurar la germinación eficiente.

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    Representative Results

    Un ejemplo de C. difficile crecido en BHIS y Columbia anaeróbica ovejas medios de agar sangre puede ser visto en la Figura 2. C. difficile forma colonias irregulares que son planas y poseen una apariencia de vidrio esmerilado que es evidente en ambos medios. Aquí, un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E 30, se cultiva en BHIS de agar, un medio enriquecido, no selectivo, durante 24 horas a 37 ° C (Figura 2A). Las colonias sobre el Columbia ovejas anaeróbica agar sangre parecen similares a los que se cultivan en BHIS bajo luz blanca (Figura 2B), sin embargo, el uso de este medio también proporciona para la detección de la fluorescencia de color verdoso o verde pálido exhibido por C. difficile en virtud de onda larga ultravioleta (UV) 15 (Figura 2 C). C. colonias difficile en agar TCCFA un aspecto similar al crecimiento en agar BHIS. Debido a la presencia de dos antibióticos en medio TCCFA, un TIMperiodo e de 48 horas de crecimiento es necesario antes de enumerar las colonias.

    Figura 1
    Figura 1. La cámara de Coy Laboratorios Tipo C de vinilo y sus componentes. (A) Una cámara de vinilo Coy Laboratorios Tipo C, que proporciona espacio de trabajo para una sola persona a la vez (42 pulgadas x 32 pulgadas). Contiene un ventilador de caja de catalizador (esquina trasera izquierda) que circula y se calienta el aire, y mantiene el Stak-Pak que contiene el catalizador de paladio necesaria para reducir cualquier contaminación de oxígeno. (B) La esclusa de aire sirve como un intercambio y proporciona un mecanismo para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara, mientras que la prevención de la contaminación significativa de oxígeno en el ambiente anaeróbico. La esclusa de aire tiene dos puertas: una que proporcionan acceso a la parte exterior de la esclusa de aire y el otro que proporciona acceso al interior de th e cámara anaeróbica. La bolsa de aire es programable y permite ciclos personalizados para la entrada en la cámara. Es operable en los modos automáticos, semi-manuales y manuales. (C) anexa, guantes de látex flexibles se proporcionan que permiten el rango de movimiento y alcance dentro de la cámara. Los guantes se fijan a un manguito especializados adjuntos a los manguitos de vinilo con adhesivo de vinilo, que permite la sustitución de guantes sin perturbar la atmósfera anaeróbica de la cámara. Guantes de neopreno también están disponibles. (D) El Modelo 10 Analizador de Gas monitorea continuamente tanto niveles de oxígeno y de hidrógeno que proporcionan una lectura instantánea de la atmósfera dentro de la cámara. Esta unidad permite alertas inmediatas si se produce una fuga, una mezcla de gas errónea se utiliza o se plantean problemas adicionales a través de alarmas audibles y una luz LED que parpadea.

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    Figura 2. La aparición de C. colonias difficile en diversos medios de comunicación. La característica, irregular, apariencia de vidrio plano es evidente con un aislado clínico-eritromicina sensible de C. difficile, 630E 30, que se cultiva en agar BHIS durante 24 horas (A) y Columbia ovejas anaeróbico agar sangre durante 48 horas con luz blanca (B) y largo luz ultravioleta de onda (C).

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    Discussion

    Los métodos descritos aquí permiten una recuperación rápida y sencilla de C. difficile a partir de una variedad de muestras fecales, incluyendo seres humanos, ratones y hámsteres, así como el almacenamiento a largo plazo de C. difficile como stocks de glicerol o de esporas. C. difficile puede ser un organismo difícil de cultivar, pero cuidado mantenimiento de un ambiente anaerobio y la aplicación de técnicas asépticas puede proporcionar para un crecimiento vigoroso y una reducción en la contaminación.

    Cámaras anaeróbicas: Consideraciones y Mantenimiento

    Hay dos tipos de cámaras anaeróbicas: cámaras rígidas o cámaras de vinilo. Cámaras rígidas se hacen típicamente de aluminio o de un polímero rígido (por ejemplo, plexiglás o materiales acrílicos), permitiendo el uso de productos químicos cáusticos. Cámaras rígidos se pueden convertir a un estilo sin guantes y son menos propensos a los pinchazos, sin embargo, las fugas son difíciles de detectar y de encontrar y cámaras rígidas requieren algún método paracompensar el desplazamiento de gas durante el uso. Las unidades de polímero a menudo están equipados con una cámara de aire de purga-solamente, que puede costar más de mantener. Para el mantenimiento de las condiciones estrictas atmosféricas, el coste, la flexibilidad, las necesidades de espacio de laboratorio y de fácil mantenimiento, cámaras anaeróbicas vinilo se recomiendan (Coy Laboratory Products, Figura 1A). Esta cámara anaeróbica se compone de una caja de guantes de vinilo que está soportado por una estructura de aluminio tubular y está conectado a una esclusa de aire que funciona como un intercambio para la transferencia de materiales dentro y fuera de la cámara (Figura 1B), el uso de guantes de látex o neopreno unido a las mangas de vinilo (Figura 1C). Es importante seguir con precisión las instrucciones del fabricante para el correcto procedimiento de configuración de la cámara anaeróbica. Puede ser de temperatura controlada con una (o más, dependiendo del tamaño de la cámara) unidades caja del calentador que proporcionan la circulación de aire a través de un catalizador de paladio. El ca paladioTalyst sirve para reducir la contaminación de oxígeno introducido a través del intercambio mediante la conversión de hidrógeno y oxígeno en agua. Idealmente, ambos niveles de oxígeno y de hidrógeno se controlan usando un analizador de gases (Figura 1D), la visualización de la concentración de oxígeno en partes por millón (ppm) y la concentración de hidrógeno como un porcentaje.

    Los medios líquidos y sólidos deben ser pre-reducida en la cámara anaeróbica antes de su uso. Placas de Petri (100 mm de diámetro) se pueden reducir para sólo dos horas antes de su uso 31, sin embargo, los medios líquidos deben reducirse durante la noche. Es importante destacar que, los medios de comunicación deben ser enfriados antes de la transferencia dentro de la cámara para evitar parpadeo líquido durante la evacuación esclusa de aire. Consumibles de plástico, tales como placas de 96 pocillos, deben ser pre-reducida durante una noche antes de su uso, como el plástico es poroso y puede almacenar las moléculas de oxígeno 32. Dependiendo de la aplicación, algunos plásticos deben ser pre-reducido para un máximo de 48 horas antes de su uso 33. Residuos de riesgo biológico debería se dispuesto de manera apropiada. Una bolsa de riesgo biológico pequeño se puede mantener dentro de la cámara, pero debe reemplazarse con frecuencia.

    Una concentración de hidrógeno de al menos el 3% se debe mantener dentro de la cámara, ya que esto garantizará tanto el buen crecimiento de C. eliminación de oxígeno difficile y eficiente. Si la concentración de hidrógeno cae por debajo de 3% o si la cámara no se ha utilizado durante varios días, un ciclo de cámara debe ser ejecutado para restaurar la concentración de hidrógeno a niveles deseables. Aquí, aproximadamente un tercio del gas en la cámara es aspirado a cabo (la caja de vinilo se desinflará significativamente) y se sustituye con la mezcla de gas fresco. Asegúrese de que la bolsa de aire es anaeróbico antes de comenzar. Bombeo demasiado gas a la cámara de se debe evitar, ya que esto no sólo pone la tensión innecesaria en la bolsa de vinilo, pero también se oponen a que el usuario llegue a la parte trasera de la cámara. Siempre realice este procedimiento en un lugar bien ventilado. Tome precauciones adicionales si el chambre se mantiene en una pequeña habitación, con poca ventilación. Abrir las puertas de la sala ya que el contenido de gas en el interior de la cámara se pueden asfixiar el usuario.

    Mantenimiento adicional incluye la regeneración del catalizador de paladio para asegurar la eliminación de oxígeno eficiente dentro de la cámara. Como el oxígeno y el hidrógeno se reducen en el catalizador, el agua puede acumularse en la superficie de los gránulos de aluminio de paladio-cubierta, reduciendo su eficacia con el tiempo. Para superar esto, los catalizadores de paladio se deben regenerar al menos una vez a la semana por cocción de al menos 230 ° C durante una hora. Además, como resultado de tanto la reducción de oxígeno y evaporación del agua de las placas y los medios de comunicación, la acumulación de agua es un problema común dentro de las cámaras anaerobias. Para garantizar la manipulación cómoda y aumentar la vida media de los equipos dentro de la cámara, paquetes desecantes se pueden usar, pero se deben secar a cabo con frecuencia siguiendo el mismo procedimiento utilizado para los catalizadores de paladio. Alternativamente, un DEhumidificador puede ser utilizado que hace circular el aire a través de un bloque de metal que condensa el agua y se recoge en un recipiente. El dispositivo evita el desbordamiento de los contenedores de agua, sin embargo, deshumidificadores deben ser monitoreados y contenedores deberán vaciarse cuando cerca de lleno. Para limpiar la cámara de vinilo, se recomienda el uso de un paño suave y un limpiador disponible comercialmente recomendada para el cloruro de polivinilo (PVC) (por ejemplo mágico plástico Limpiador, parte no. 1600480, Coy Laboratories). Para evitar rayar o dañar la cámara de vinilo, no use toallas de papel, Kim toallitas o productos que contengan cetonas u otros compuestos que puedan dañar el PVC.

    Finalmente, C. difficile produce gas de sulfuro de hidrógeno (H 2 S), que es extremadamente reactivo y corrosivo. El sulfuro de hidrógeno puede ser perjudicial para la instrumentación, el catalizador de paladio y cualquier metal expuesto. Si es posible, no salir de cualquier instrumentación, tales como homogeneizadores y espectrofotómetros, en el chambER durante largos períodos de tiempo para evitar la corrosión causada por el sulfuro de hidrógeno. Debido a la producción de sulfuro de hidrógeno, tendrán que ser reemplazados periódicamente como parte del mantenimiento regular de cámara de elementos tales como el analizador de catalizador de paladio y gas. Alternativas para reducir los niveles de sulfuro de hidrógeno dentro de la cámara, tales como el uso de carbón activado, acetato de plomo, cloruro de plata o sulfato de plata para absorber o químicamente eliminar el sulfuro de hidrógeno, se han descrito 34 y se puede utilizar para reducir la velocidad de corrosión de los equipos.

    Precauciones adicionales

    Nunca abra una puerta a la esclusa de aire sin asegurarse de que la otra puerta está cerrada y bloqueada para evitar la contaminación de oxígeno. Además, evitar el uso de elementos afilados dentro de la cámara para reducir el riesgo de perforar el vinilo.

    Es importante tener en cuenta que el hidrógeno es un gas inflamable en la presencia de oxígeno. Tenga cuidado al introducir elementos into de la cámara que los altos niveles de contaminación por oxígeno no se producen (mayor de 999 ppm). Es importante utilizar sólo premezclado mezcla inflamable de gas anaeróbico y vigilar de cerca el analizador de gases dentro de la cámara, especialmente cuando se utiliza un nuevo tanque de gas. Si se producen dos concentraciones de hidrógeno y de oxígeno por encima del 4%, garantizar que los procedimientos de emergencia adecuados, que deben estar señalados en los procedimientos operativos estándar del laboratorio (SOP), se siguen.

    Solución de problemas C. crecimiento difficile

    Si un pobre crecimiento de C. culturas difficile se observa en medio rico, esto es lo más a menudo debido a la contaminación de oxígeno dentro de la cámara. La adición de un agente reductor (por ejemplo, L-cisteína o tioglicolato) para el medio puede mejorar el crecimiento, sin embargo, tendría el problema de la contaminación de oxígeno dentro de la cámara a tratar. Monitoreo de los niveles de oxígeno y de hidrógeno dentro de la cámara utilizando un analizador de gases puede rápidamente unalert el usuario a los temas antes de que un retraso en el progreso y la disminución de la productividad se produce. Si se produce la contaminación de oxígeno, identificar rápidamente la fuente con un detector de fugas de gas (disponible en Coy Laboratories) se aconseja. Para aumentar la posibilidad de encontrar la ubicación de una fuga, un trapo empapado en alcohol se puede colocar dentro de la cámara ya que el detector de fugas de gas puede identificar niveles elevados de hidrocarburos, así como el aumento de los niveles de hidrógeno. Una vez encontrado el origen de la fuga, puede ser reparado usando pegamento o silicona, siguiendo las instrucciones del fabricante.

    Un número de organismos crecen fácilmente en ambientes anaeróbicos, incluyendo otras especies clostridiales comunes (por ejemplo, Clostridium perfringens) y el anaerobio facultativo, de Escherichia coli. La técnica aséptica y otras estrategias pueden reducir el riesgo de contaminación. Organización apropiada dentro de la cámara, como la colocación de los elementos a su alcance para reducir el potencial de fo los derrames y la pronta eliminación de los residuos de riesgo biológico acumulado, pueden reducir los riesgos de contaminación. Además, las toallas de papel humedecidas con una solución de lejía diluida pueden ser llevados periódicamente a la cámara para limpiar las superficies y los guantes de látex o neopreno. Es muy importante no dejar las soluciones de lejía o alcohol dentro de la cámara durante largos períodos de tiempo, ya que pueden penetrar en la atmósfera y de los medios sólidos y líquidos, matando C. difficile, así como dañar el vinilo 34. Además, la sustitución periódica de los guantes de látex o neopreno también puede reducir el riesgo de contaminación. Como se mencionó anteriormente, si no está seguro si un organismo es C. difficile o un contaminante, una prueba para la presencia del gen TDCB usando PCR pueden determinar rápidamente si el organismo es C. difficile 21. Por último, si el cultivo de múltiples organismos dentro de la misma cámara anaeróbica, es importante tener en cuenta que C. difficile puede producir subproductos metabólicos (correo. G. Sulfuro de hidrógeno) que inhiben el crecimiento de otros organismos anaerobios y viceversa.

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    Disclosures

    No hay conflictos de interés declarado.

    Acknowledgements

    Nos gustaría dar las gracias a Coy Laboratorios amablemente para proporcionar imágenes de la cámara anaeróbica. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud de subvención DK087763 (SMM) y un plan de estudios STEP / HHMI Desarrollo de la Confraternidad (ANE).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Proteose Peptone no. 2 BD 212120
    Na2HPO4 Fisher S373
    KH2PO4 Fisher BP362
    NaCl Fisher S27
    MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
    á´…-Fructose Fisher L96
    Sodium taurocholate Sigma T4009
    á´…-cycloserine Sigma C6880
    Cefoxitin Fluka C4786
    Brain heart infusion medium BD 237300
    Proteose Peptone BD 211684
    (NH4)2SO4 Sigma A5132
    Tris base Fisher BP152
    Agar BD 214010
    L-cysteine Sigma C7755
    BactoPeptone BD 211684
    Columbian sheep blood agar Fisher L21928
    NaCl Fisher S27
    KCl Fisher P217
    Glycerol Fisher BP2291
    Sterile inoculating loops Fisher 22363596
    Sterile swabs Fisher 1495990
    Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
    Materials
    TCCFA agar

    Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
    Na2HPO4 5 g
    KH2PO4 1 g
    NaCl 2 g
    MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
    Fructose 6 g
    Agar 20 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    After autoclaving, add:
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
    25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
    1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

    BHIS Medium

    Brain heart infusion 37 g
    Yeast extract 5 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):

    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
    10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

    SMC Sporulation Medium

    BactoPeptone 90 g
    Protease peptone 5 g
    (NH4)2SO4 1 g
    Tris base 1.5 g
    Agar 15 g

    Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

    Optional (add after autoclaving):
    3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

    70:30 Medium

    BactoPeptone 63 g
    Protease peptone 3.5 g
    Brain heart infusion 11.1 g
    Yeast extract 1.5 g
    (NH4)2SO4 0.7 g
    Tris base 1.06 g

    For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

    Blood agar

    The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

    1X Phosphate buffered saline (PBS)

    NaCl 8.01 g
    KCl 0.2 g
    Na2HPO4 1.44 g
    KH2PO4 0.27 g

    Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

    References

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