Kultivierung und Pflege

Published 9/14/2013
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Immunology and Infection

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Summary

Clostridium difficile ist ein pathogenes Bakterium, das eine strikte Anaerobier ist und bewirkt, dass Antibiotika-assoziierten Diarrhoe (AAD). Hier, Methoden zur Isolierung, Kultivierung und Pflege von C. difficile vegetativen Zellen und Sporen werden beschrieben. Diese Techniken erfordern eine anaerobe Kammer, die regelmäßige Wartung erfordert, um den richtigen Bedingungen sorgen für optimale C. difficile Anbau.

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Edwards, A. N., Suárez, J. M., McBride, S. M. Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment. J. Vis. Exp. (79), e50787, doi:10.3791/50787 (2013).

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Abstract

Clostridium difficile ist ein Gram-positive, anaerobe, sporenbild Bakterium, das vor allem für Antibiotika-assoziierten Diarrhoe (AAD) verantwortlich ist und der eine bedeutende nosokomiale Erreger. C difficile ist notorisch schwierig zu isolieren und zu kultivieren und ist extrem empfindlich, auch geringe Mengen an Sauerstoff in der Umgebung. Hier sind Verfahren zur Isolierung von C. difficile aus Stuhlproben und anschließend Kultivierung C. difficile zur Herstellung von Glycerin-Stammlösungen für die Langzeitlagerung dargestellt. Techniken zur Herstellung und Auflisten Sporenvorräte im Labor für eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Mikroskopie abwärts und Tierstudien werden ebenfalls beschrieben. Diese Techniken erfordern eine anaerobe Kammer, die eine konsistente anaerobe Umgebung zu angemessenen Bedingungen für eine optimale C gewährleisten hält difficile Wachstum. Wir stellen Protokolle zum Übertragen von Materialien in und aus der Kammer ohne Camit erheblichen Sauerstoffkontamination zusammen mit Vorschlägen für die regelmäßige Wartung erforderlich, um die entsprechenden anaeroben Umgebung für die effiziente und konsequente C aufrecht difficile Anbau.

Introduction

Clostridium difficile ist ein gram-positives, sporenbildendes Bakterium, das ein obligat anaerobe und eine potenziell tödliche Magen-Darm-Erreger von Mensch und Tier ist. Ursprünglich im Jahre 1935 beschrieben, als Kommen Organismus in Stuhlproben von Neugeborenen 1, C. gefunden difficile wurde später gezeigt, dass der Erreger der Pseudomembrankolik mit Antibiotika-Behandlung 2 zugeordnet werden. C difficile-Infektionen (CDI) in der Regel durch Antibiotika-Behandlung, die in der Störung der normalen Darmflora führt, die Schaffung einer Nische für C voraus difficile zu gedeihen 2. C difficile als ruhende Sporen fäkal-oralen Weg übertragen und anschließend keimt innerhalb des Magen-Darm-Trakt, wodurch vegetativen Zellen fähig ist, mehrere Toxine und verursachen schwere Krankheit und Colitis 3. CDI sind oft resistent gegen herkömmliche Behandlungen und diese inInfektionen werden häufig wiederkehrende 4. Als Ergebnis sind CDI für bis zu 4,8 Milliarden Kosten im Gesundheitswesen in den USA 07.05 $ verantwortlich.

C. difficile ist sehr empfindlich auf geringe Mengen an Sauerstoff in der Umgebung. Für C. difficile in der Umwelt verbleiben und effizient von Host zu Host übertragen werden kann, ist die Bildung einer metabolisch inaktiven Sporen kritischen 8. Da der Labor Wartung und Manipulation von C. difficile erfordert einen kontrollierten anaeroben Umgebung, diese Techniken erfordern den Einsatz einer anaeroben Kammer. Verwendung von anaeroben Kammern hat in erhöhte Gewinnung und Isolierung von obligaten Anaerobiern 9-11 geführt und hat eine Reihe von molekularen Techniken, um in einer anaeroben Atmosphäre durchgeführt werden dürfen.

Zusätzlich zu C. difficile, die anaerobe Kammer Gebrauch und die Wartung hier beschriebenen geltenzu anderen obligat anaerobe Bakterien wie Clostridien anderen Spezies (zB C. perfringens), andere Magen-Darm-Arten (z. B. Bacteroides 12) und parodontalen Krankheitserreger (zB Peptostreptococcus Art 13).

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Protocol

Hinweis: C. difficile ist ein Mensch und Tier Krankheitserreger, der Magen-Darm-Erkrankung verursachen können. Experimente mit C. difficile, müssen mit geeigneten Vorsichtsmaßnahmen zur Biosicherheit (BSL-2) durchgeführt werden.

1. Anaerobe Kammer Betriebs-und Wartungs

C. difficile ist eine strenge anaerobe und ist extrem empfindlich auf niedrige Sauerstoffkonzentrationen in der Atmosphäre. Daher wird eine gesteuerte, anaeroben Umgebung für die erfolgreiche Manipulation erforderlich. Die Verwendung einer anaeroben Kammer (Abbildung 1A) bietet die stabile Umgebung und die idealen Bedingungen für eine effektive Kultivierung von C. difficile und andere anaerobe Bakterien 14. Hier kann eine Atmosphäre, die ein Gasgemisch (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2) stabil gehalten werden.

Um alle Elemente in die Kammer ohne nennensSauerstoffKontamination einzuführen,Eine Luftschleuse verwendet werden (Fig. 1B). Diese Einrichtung arbeitet als ein Gasaustausch und arbeitet automatisch, manuell oder semi-manuell. Die Luftschleuse hat zwei Türen: ein Zugang zu der Außenseite der Luftschleuse und der andere Zugang zu dem Inneren der anaeroben Kammer. Je nach Modell kann die Luftschleuse eine zusätzliche Tür zu haben, die den Zugang zu einem angrenzenden anaeroben Kammer anbieten können, das spart die Kosten für einen separaten Luftschleuse. Sofern nicht aktiv bewegten Elemente in die oder aus der Kammer, sollten beide Türen stets geschlossen bleiben, um eine Sauerstoffkontamination zu vermeiden. Die Luftschleuse besitzt einen Ein / Aus-Schalter auf der Vorderseite und eine Platte, die vier Tasten. Die Gasleitungen und Vakuumpumpschlauch in der Rückseite des Luftschleuse, in der Nähe der Platte, wenn die Schalter für die vollständige manuelle Bedienung der Einheit angeordnet ist. Es wird empfohlen, dass zwei Spülzyklen mit Stickstoff (N 2) verwendet werden, vor dem Füllen des Austausch mit Gasgemisch (5% CO 2, 10% H 2, 85% N 2), die Menge an Sauerstoff in die Kammer eingeführt zu reduzieren. Es ist auch wichtig, um nicht eine der Türen verlassen länger als die Menge Zeit benötigt, um Gegenstände in den und aus dem Austausch und zu bewegen offenen sorgfältig planen Experimente, die Frequenz des sich bewegenden Gegenstände in und aus der Kammer zu verringern. Die unterschiedlichen Betriebsverfahren für Vinyl anaeroben Kammern sind unten aufgeführt. Bevor Sie die folgenden Protokolle, sicherzustellen, dass diese mit den Anweisungen des Herstellers mit der Kammer vorgesehen kompatibel sind.

  1. Automatischer Modus
    Dies ist eine programmierbare und kundenModus und wird vollständig von der Luftschleuse durchgeführt. Um die Luftschleuse zu programmieren, um die Anweisungen des Herstellers beziehen. Eine empfohlene Programm zur typischer Eintrag in die Kammer beinhaltet zwei Spülzyklen mit Hilfe von Stickstoff, gefolgt von Nachfüllen der Luftschleuse mit einer Gasmischung, die eng mit der Atmosphäre innerhalb des cham gehalten Spieleber. Während jeder Vakuumzyklus, die Standard-Werk Verfahren empfehlen ein Vakuum bis 20 inHg und Spülen bis 1 inHg.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Gegenstände in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Versiegelten Verpackungen und Behälter sollte vor Beginn des Zyklus geöffnet werden; Verzicht Dabei können sich verformen und Schäden Kunststoffprodukte und Container. Um die Sterilität zu erhalten, öffnen Sie die Pakete nur effizient genug, um den Gasaustausch zu ermöglichen.
    4. Drücken Sie die Taste Start.
    5. Warten, bis die Luftschleuse wurde durch das Programm wieder eingeschaltet und die Anzeige "Anaerobe."
    6. Öffnen inneren Schleusentür.
    7. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    8. Schließen Sie Innentür.
  2. Semi-manuelle Modus
    Dieser Modus kann beim Übertragen von Objekten in die oder aus der Kammer verwendet werden und ist notwendig, wenn cycling das Gas in der Kammer erforderlich ist.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Gegenstände in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Sealed-Pakete, wie Impfösen und 96-Well-Platten müssen vor dem Beginn des Zyklus geöffnet werden.
    4. Drücken Sie Menü.
    5. Drücken Sie Start. Die Luftschleuse wird die Funktion jeder Taste anzeigen und reagiert nicht, bis dieser abgeschlossen ist:
      • Pfeil nach oben: aktiviert die Vakuumpumpe.
      • Pfeil nach unten: leitet den Stickstoff (Spülung) Gasstrom.
      • Beginn: löst den Gasfluss-Mix.
      • Menü: zur Standardanzeige zurück.
    6. Drücken Sie die "Up", Entfernen von Gas aus der Luftschleuse, bis das Display 20 inHg.
    7. Drücken Sie auf "Down" Füllen der Schleuse mit Stickstoff, bis das Display weniger als 1 inHg. Ov nichtershoot, da diese positive Druck innerhalb der Luftschleuse zu schaffen, die ihre Integrität beeinträchtigen können.
    8. Wiederholen Sie die Schritte 6 und 7, eine zusätzliche Reinigungszyklus durchzuführen.
    9. Drücken Sie die "Up", bis im Display 20 inHg.
    10. Drücken Sie auf "Start", Füllen der Austausch mit Gasgemisch, bis das Display weniger als 1 inHg.
    11. Öffnen inneren Schleusentür.
    12. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    13. Schließen Sie Innentür.
  3. Manueller Modus
    Dieser Modus kann verwendet werden, wenn die automatische oder halb-manuelle Modi funktionieren nicht oder es ist keine Leistung an die Luftschleuse. Dieser Modus funktioniert nicht, wenn die Schleuse auf, daher ist es schwierig, den Druck in der Luftschleuse zu bestimmen. Da das Vakuum zu ziehen und Gasspülung Zeiten ist abhängig von Vakuum-und Gasdurchflussraten bzw. die Verwendung eines Druckmesser im Austausch erforderlich ist, um den Druck zu überwachen und das Risiko von Personenschäden und Schäden an der Luftschleuse zu reduzieren.
    1. Sicherzustellen, dass die innere Schleusentür vollständig geschlossen ist.
    2. Öffnen Sie die äußere Schleusentür.
    3. Legen Sie Elemente, einschließlich der Manometer, in Luftschleuse und schließen Sie die äußere Schleusentür. Wenn die Einführung von Flüssigkeiten, schrauben die Kappen auf halbem Weg zu effizienten Gasaustausch zu gewährleisten. Sealed-Pakete, wie Impfösen und 96-Well-Platten müssen vor dem Beginn des Zyklus geöffnet werden.
    4. Suchen Sie die drei Schalter auf der Rückseite der Luftschleuse mit "Manual Control Schalter". Diese werden individuell beschriftet als:
      • Vakuum
      • Stickstoff
      • Gas-Mix
    5. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    6. Klappen Sie den Stickstoff Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    7. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    8. Klappen Sie den Stickstoff Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    9. Klappen Sie den Vakuumschalter zum Umschalten bis das Manometer liest etwa 20 inHg.
    10. Klappen Sie den Gas Mix Kippschalter bis das Manometer liest etwa 1 inHg.
    11. Öffnen inneren Schleusentür.
    12. Verschieben Sie die Elemente in die Kammer.
    13. Schließen Sie Innentür.

2. Die Kultivierung, Aufzählen und Lagerung C. difficile aus Stuhlproben

Dieses Verfahren wurde entwickelt, um C zu erholen difficile aus Stuhlproben, die Sporen und in der Folge beibehalten isolierte Kolonien als vegetative Zellen oder Sporen in langfristige Lagerung als Glyzerin. Alternativ kann dieses Verfahren verwendet, um die Anzahl der C aufzuzählen difficile vorhanden in Stuhlproben (zB von Tierversuchen). Um C selektiv und unterschiedlich bereichern difficile, Taurocholat-Cefoxitin-Cycloserin-Fructose-Agar (TCCFA) wird verwendet, um das Wachstum von normalen Fäkalflora 15-16 hemmen. Cycloserin ist bakteriostatisch für Gram-negative Bakterien, während Cefoxitin hemmt breiter Wachstum von sowohl Gram-negative und-positive Bakterien, mit Ausnahme von C. difficile und die meisten geben Kokken Stämme. Ein pH-Indikator Neutralrot, in dem Medium aufgenommen werden, da die Fermentation von Fructose zu einer Abnahme des pH-Wertes und einer anschließenden Farbwechsel von rot / orange nach gelb führen. Um effizient zu erholen Sporen von C. difficile als vegetative Bakterien, die Gallensalz Natriumtaurocholat wird verwendet, um die Keimung 17-18 induzieren. Da C. difficile-Sporen bildet, Alkohol oder einer Wärmebehandlung der Proben verwendet werden, zu reduzieren oder zu eliminieren vegetativen Zellen, Begrenzung des Wachstums von kontaminierenden Flora, die den Wirkungsgrad erhöhen kann von C. difficile Recovery 19. Wie oben erwähnt, ist es wichtig, vor Verringerung aller Platten für mindestens 1-2 h in die anaerobe Kammer vor der Verwendung, um die Entfernung des Restsauerstoffs zu sichern. Air drying die Platten vor der in der Kammer können Kondensation zu reduzieren. Flüssige Medium möglicherweise bis zu 24 h, je nach dem Volumen und der Oberfläche-zu-Luft-Verhältnis des verwendeten Behälters zu reduzieren.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Stuhlprobe
  • Sterile Tupfer
  • Sterile Impfösen
  • 1x PBS (siehe Materialien)
  • TCCFA Platten (siehe Materialien)
  • BHIS (Brain Heart Infusion Medium mit Hefeextrakt)-Platten und Brühe (siehe Materialien)
  • 50% Glycerin (sterilisiert)
  • 10% L-Cystein (sterilisiert)
  • Kryo-Lagerung Fläschchen

* Alternativ können isolierte Kolonien auf Agar-Platten BHIS bei -80 ° C verteilt werden, und anschließend abgekratzt und in BHIS flüssigen Medium resuspendiert mit 15% Glycerin für die langfristige Lagerung ** Es ist wichtig zu beachten, dass Gram-Färbung ist nicht eine wirksame Strategie zur Identifizierung C. difficile direkt aus Stuhlproben 23 C difficile muss zunächst von den anderen im Stuhl vorhanden Flora isoliert werden.

  1. Resuspendieren der Stuhlprobe in 1x PBS (dies kann unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden), und sicherzustellen, dass die Stuhlprobe vollständig in 1x PBS durch Vortexen resuspendiert. Wenn Aufzählung C. difficile aus dem Stuhl, wiegen die Stuhlprobe vor der Zugabe von 1 × PBS.
  2. Machen serielle Verdünnungen des resuspendierten Stuhlprobe in 1x PBS für geeignete Isolierung oder Aufzählung der koloniebildenden Einheiten (KBE) pro Gramm Stuhl.
  3. Unter aseptischen Bedingungen gelten 100 ul jeder seriellen Verdünnung auf TCCFA Platten.
  4. Mit einer Reihe von sterilen Impfösen, streifen die angelegte Kultur für isolierte Kolonien oder gleichmäßig verteilt die angelegte Kultur auf der Oberfläche der Platte TCCFA für die Zählung von Kolonien.
  5. Die Platte anaerob für 48 Stunden bei 37 ° C. Es ist möglich, zu erkennen und zu identifizieren, C. difficile Kolonien innerhalb von 24 h, bezogen aufdie flache, unregelmäßig, Boden-Glas-Optik der Kolonien 15, obwohl genauere Identifizierung und Zählung wird nach 48 Stunden erreicht.
  6. Mit einer sterilen Impfösen, Subkultur keine Kolonien, die auf C erscheinen difficile auf vorge reduziert BHIS Agar-Platten, mit 0,03% L-Cystein-20 ergänzt. Wählen Sie ein Einzelkolonie und Streifen auf den Teller in den Quadranten, mit einer neuen sterilen Impföse für jeden Quadranten, um isolierte Kolonien zu erhalten. Alternativ zählen die C. difficile-Kolonien von jeder Verdünnung (dies kann unter aeroben Bedingungen durchgeführt werden), und berechnet die Anzahl der koloniebildenden Einheiten pro Gramm Stuhlprobe.
  7. Bestätigen C. difficile-Identifikation über Gram-Färbung. Nach Gram-Färbung, C. difficile als lila Stangen erscheinen und einige Zellen Terminal Endosporen enthalten. Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Identifizierung der Gene, die das Toxin B kodieren kann weitere Bestätigung lieferntoxigenen Stämmen von C. difficile 21, während Multilocus Sequenz Typisierung (MLST) erfolgreich für die Identifizierung und genaue Typisierung von unbekannten und nicht toxigene Stämme von C. ist 22 difficile.
  8. Um einen Bestand von C zu halten difficile bei -80 ° C, wählen Sie eine einzelne, isolierte Kolonie von der Agar-Platte BHIS mit einer sterilen Impföse und resuspendieren Kolonie in 10 ml vorge reduziert BHIS Flüssigmedium mit 0,03% L-Cystein ergänzt. *
  9. Inkubieren über Nacht anaerob bei 37 ° C, oder bis die Kultur trüb.
  10. Hinzufügen von 333 &mgr; l 50% Glycerol und 666 &mgr; l der C difficile-Kultur auf eine 1,8 ml Kryo-Rohr, um eine 15% Glycerin Lager des isolierten Stammes erstellen.
  11. Verschließe das kryogene Rohr, gut mischen und sofort den Stock aus dem anaeroben Kammer und in einem -80 ° C Gefrierschrank für langfristige Lagerung.

3. Kultivierung C. difficile

Dieses Verfahren bietet für die Wiederherstellung von C. difficile aus bei -80 ° C gelagert Glycerinstamm Da wiederholte Frost-Tau-Zyklen können vegetativen Zellen zu töten, ist es wichtig, die Glycerin-Aktien zu jeder Zeit eingefroren zu halten. Wir empfehlen nicht den Einsatz von Trockeneis für die Übertragung von Stämmen in die und aus der Kammer, wie die Verdampfung von Trockeneis kann die Umwelt in der Kammer ändern. Stattdessen empfehlen wir die Verwendung von gefrorenem Kühl Racks Glycerin Aktien während des Transports eingefroren zu halten. Aus verschiedenen selektiven und differentiellen Zwecken werden drei Medien allgemein zum Kulti C verwendet difficile. TCCFA, wie oben diskutiert, ist selektiv für C. difficile und enthält Natriumtaurocholat, ein keim. Hirn-Herz-Infusion mit Hefeextrakt (BHIS) ergänzt ist eine häufig verwendete, angereicherten, nicht-selektiven Medium, das für das Wachstum einer großen Vielzahl von Organismen (2A) 24 ermöglicht. Häufig, L-Cysteine wird BHIS als Reduktionsmittel 20 aufgenommen. Schließlich wird die Zugabe von Blut in das Medium (2B) ermöglicht eine effizientere Sporulation als auf TCCFA und liefert für die Erkennung der einzigartigen grünliche oder gelbgrün Fluoreszenz von C. ausgestellt difficile unter langwelligem UV-Licht (UV) 15 (Abbildung 2C). Beim Kultivieren C. difficile-Sporen von Aktien, ist es wichtig zu bedenken, dass Natriumtaurocholat müssen dem Medium zugesetzt werden, um die Keimung zu gewährleisten.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Gefrorene Glycerin Lager (auf Rack-Kühlung)
  • Sterile Impfösen
  • TCCFA oder BHIS Platten (siehe Materialien)
  • BHIS Brühe (siehe Materialien)
  • 50% Glycerin (sterilisiert)
  • Kryo-Lagerung Fläschchen
  1. Legen Sie die gefrorenen Glycerin Lager von C. difficile in einem Rack-Kühlung, die bei -80 ° C gelagert wurde prIOR zu verwenden, um dem Auftauen zu verhindern.
  2. Bringt die gefrorenen Glycerin Lager auf Trockeneis in den anaeroben Kammer.
  3. Unter aseptischen und sterilen Impföse ein, legen Sie eine kleine Menge der Lager auf der Platte und Streifen über einen Quadranten der Platte.
  4. Drehen Sie die Platte 90 ° und mit einer neuen sterilen Impföse weiterhin Streifen über dem zweiten Quadranten.
  5. Wiederholen der dritten und vierten Quadranten, um die Isolierung von Einzelkolonien zu gewährleisten.
  6. Sofort den gefrorenen Glycerin Lager aus der anaeroben Kammer und zum -80 ° C
  7. Die Platte anaerob über Nacht bei 37 ° C Einzelne isolierte Kolonien sollte nach Wachstum über Nacht beobachtet werden.

4. Reinigende Sporen von C. difficile

Als Sporenbildung ist für das Überleben in sauerstoffreichen Umgebungen und für die effiziente Übertragung von Krankheiten 8 erforderlich ist, ist die Herstellung der Sporen Aktien oftefür nachgelagerte Anwendungen, um nicht zu Mikroskopie und Tierstudien beschränkt n erforderlich. Es ist wichtig zu beachten, dass die Aufzählung Sporen erfordert Wiederholung, um die Reproduzierbarkeit der Zählungen zu gewährleisten. Und Abpipettieren mehrmals zwischen Verdünnungen reduziert auch Verlust seit Sporen haften Kunststoff auch.

Die Sporenbildung von C. difficile ist nicht so homogen, wie schnell oder anderen sporogenen Arten. Zur Optimierung der Sporenproduktion und Wiederherstellung, entweder Sporulationsmedium (SMC) oder 17,25 70:30 Medium 26 wird empfohlen. Andere üblicherweise verwendete Medien sind BHIS, die 4-5 Tagen Wachstum erfordert, bevor eine effiziente Sporulation gesehen 27 und Clospore ein flüssiges Medium, das hohe Titer von Sporen produziert (7. Oktober - 8. Oktober Sporen pro ml) nach 72 h Wachstum. Andere Protokolle verwenden eiskaltem Wasser anstatt 1x PBS 20, jedoch kann die Verwendung einer isotonischen Lösung von Sporen aneinander kleben und Kunststoffoberflächen zu reduzieren. Alternativeinige Forscher weiter zu reinigen, deren Sporen mit einer Saccharose-Gradienten zu vegetativen Zellen und Zelltrümmer 29 vollständig zu entfernen.

Bevor Sie beginnen, sollten die folgenden Punkte in den anaeroben Kammer platziert werden:

  • Sterile Impfösen
  • BHIS, SMC und / oder 70:30 Platten (siehe Materialien)
  • BHIS Brühe (siehe Materialien)
  • 1x PBS, steril filtriert (siehe Materialien)
  1. Kultur-Stämmen aus gefrorenen Glycerin Lager auf vorge reduziert BHIS Platten und Inkubation anaerob über Nacht bei 37 ° C
  2. Restreak auf mehrere vorreduziertes SMC oder 70:30 Platten und Inkubation anaerob bei 37 ° C für 24-48 Stunden. Sporenbildung kann über Phasenkontrastmikroskopie verfolgt werden. Sporen erscheint hell, während vegetative Phase und Mutterzellen Phase dunkel erscheinen. * Alternativ können Sporen von 70:30 flüssigen Medium nach 24-48 Stunden gereinigt werden, welche 10 5 bis 10 6 Sporen pro Milliliter in Abhängigkeit von der strai ergibtn verwendet.
  3. Mit einer sterilen Impföse, kratzen Platten und Resuspendieren der Zellen in 10 ml sterilem 1x PBS.
  4. Entsorgen Platten und entfernen Sporensuspension aus der anaeroben Kammer. Die Zellen zu pelletieren bei 3.000 × g für 15 Minuten. In 1x PBS waschen die Zellen zweimal, jedes Mal vollständig Resuspendieren des Zellpellets.
  5. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C bis zur Lyse des vegetativen und Mutterzellen zu unterstützen.
  6. Inkubation bei 70 ° C für 20 min, um alle restlichen vegetativen Zellen zu töten.
  7. Um zu bestimmen, koloniebildenden Einheiten (CFU) pro Milliliter, seriell verdünnt jedes Sporenzubereitung in 1x PBS und Platte auf BHIS + 0,1% Natriumtaurocholat. Inkubation erfolgt für mindestens 24 Stunden vor der Aufzählung Kolonien.
  8. Sporen können in 1x PBS entweder bei Raumtemperatur oder 4 ° C für die Langzeitspeicher gespeichert werden. Bei 4 ° C gelagert wird, kann es nützlich sein, den Sporenzubereitung bei 55 ° C für 15 min erwärmen, um eine effiziente Keim wiederherzustellen.

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Representative Results

Ein Beispiel C difficile auf BHIS und Columbia anaerobe Schafblut-Agar-Medien gezüchtet in Fig. 2 zu sehen ist. C. difficile bildet unregelmäßige Kolonien, die flach sind und einen Boden-Glas-Optik, die auf beiden Medien ist evident. Hier wird ein Erythromycin-sensitive klinischen Isolat von C. difficile, 630E 30 wird auf BHIS Agar, einer angereicherten, nicht-selektives Medium für 24 Stunden bei 37 ° C (2A) gewachsen. Kolonien auf Columbia anaerobe Schafblut-Agar erscheinen ähnlich denen auf BHIS unter weißem Licht (2B) aufgewachsen, jedoch stellt die Verwendung dieses Medium auch zum Nachweis der grünliche oder gelbgrün Fluoreszenz von C. ausgestellt difficile unter langwelligem UV-Licht (UV) 15 (Abbildung 2C). C difficile Kolonien auf Agar TCCFA ähneln Wachstum auf Agar BHIS. Wegen der Anwesenheit von zwei Antibiotika in TCCFA Medium eine TIMe Zeitraum von 48 h Wachstum ist vor der Aufzählung Kolonien notwendig.

Figur 1
Fig. 1 ist. Die Coy Laboratories Typ C Vinyl Kammer und seiner Komponenten. (A) A Coy Laboratories Typ C Vinyl Kammer, die Arbeitsbereich sorgt für eine einzelne Person zu einer Zeit (42 Zoll x 32 Zoll). Es enthält einen Katalysator Fan-Box (hinteren linken Ecke), die zirkuliert und erwärmt die Luft und hält die Stak-Pak, die den Sauerstoff erforderlich, um eine Kontamination zu verringern Palladium-Katalysator. (B) Die Luftschleuse dient als Austausch und stellt einen Mechanismus für die Übertragung von Materialien in und aus der Kammer und verhindert wesentliche Sauerstoffkontamination in der anaeroben Umgebung. Die Luftschleuse hat zwei Türen: ein Zugang zu der Außenseite der Luftschleuse und der andere Zugang zu dem Inneren des th E anaeroben Kammer. Die Schleuse ist programmierbar und ermöglicht eine maßgeschneiderte Zyklen für den Eintritt in die Kammer. Es ist in automatischen, halbmanuellen und manuellen Modi betreibbar. (C) angebracht, flexibler Latexhandschuhe sind, die volle Bewegungsfreiheit zu ermöglichen und erreichen innerhalb der Kammer. Die Handschuhe werden einem Fach Manschette den Vinyl Hülsen mit Vinylkleber befestigt befestigt, wodurch Austausch von Handschuhen ohne die anaerobe Atmosphäre der Kammer zu stören. Neoprenhandschuhe sind ebenfalls erhältlich. (D) Die Gas-Analysator Modell 10 überwacht kontinuierlich sowohl Sauerstoff als auch Wasserstoff Ebenen aus und stellt eine sofortige Anzeige der Atmosphäre innerhalb der Kammer. Dieses Gerät ermöglicht eine sofortige Benachrichtigung, wenn ein Leck auftritt, eine falsche Gasgemisch verwendet wird, oder weitere Probleme über akustische Alarme und eine blinkende LED-Licht entstehen.

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2. Das Auftreten von C. difficile Kolonien auf verschiedenen Medien. Die charakteristische flache, unregelmäßige, Boden-Glas-Optik ist offensichtlich mit einer Erythromycin-sensitive klinischen Isolat von C. difficile, 630E 30, auf BHIS Agar für 24 h (A) und anaeroben Columbia Schafblut-Agar für 48 Stunden unter weißem Licht (B) und langwelliges UV-Licht (C) gewachsen.

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Discussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen eine einfache und schnelle Wiederherstellung von C difficile aus einer Vielzahl von Stuhlproben, einschließlich Menschen, Mäuse und Hamster, sowie die Langzeitlagerung von C difficile Glycerin oder Sporen Aktien. C difficile kann eine schwierige Organismus zu kultivieren, aber sorgfältige Wartung einer anaeroben Umgebung und die Anwendung aseptischer Techniken können für robustes Wachstum und eine Verringerung der Verschmutzung bieten.

Anaerobe Kammern: Überlegungen und Wartung

Es gibt zwei Arten von anaeroben Kammern: starre Kammern oder Vinyl-Kammern. Starre Kammern sind typischerweise aus Aluminium oder einem starren Polymer (z. B. Plexiglas oder Acrylmaterialien) hergestellt, was die Verwendung von ätzenden Chemikalien. Starre Kammern zu einem schuhlosen Stil umgewandelt werden und sind weniger anfällig für Pannen, jedoch sind Lecks schwer zu erkennen und zu finden und starre Kammern erfordern eine Methode, umAusgleich für Gas Verschiebung während des Einsatzes. Die Polymereinheiten sind oft mit einem Reinigungs nur Schleuse, die mehr kosten kann zu bedienen ist. Für die Wartung des strengen atmosphärischen Bedingungen, Kosten, Flexibilität, Laborplatzbedarf und einfache Wartung, sind Vinyl anaerobe empfohlen (Coy Laboratory Products, 1A). Diese anaeroben Kammer aus einem Vinyl Glovebox, die von einer rohrförmigen Struktur aus Aluminium getragen ist und mit einer Luftschleuse, die als Austausch für die Übertragung von Materialien in und aus der Kammer (1B) dient, mit Latex oder Neoprenhandschuhen geschaltet sind Vinylhülsen (1C) befestigt ist. Es ist wichtig, genau die Anweisungen zur korrekten Einrichtung des anaeroben Kammer. Es kann temperaturgesteuert mit einem (oder mehr, abhängig von der Größe der Kammer) Heizkasten Einheiten, die Luftzirkulation durch einen Palladium-Katalysator bereitzustellen. Das Palladium ca.talyst dient, um durch den Austausch eingeführt Sauerstoffkontamination durch Umsetzung von Wasserstoff und Sauerstoff zu Wasser zu reduzieren. Idealerweise sind beide Sauerstoff und Wasserstoff unter Verwendung eines Stufen-Gasanalysator (Fig. 1D), die Anzeige der Sauerstoffkonzentration in Teilen pro Million (ppm) und die Wasserstoffkonzentration in Prozent beobachtet.

Flüssigen und festen Medien sollten in der anaeroben Kammer vorreduziert werden vor der Verwendung. Petrischalen (100 mm Durchmesser) können nur für zwei Stunden vor bis 31 verwenden reduziert werden, jedoch sollte flüssigen Medien über Nacht reduziert werden. Wichtig ist, dass Medien, bevor sie in die Kammer zu übertragen, um Flüssigkeit Blinken während Schleusen Evakuierung verhindern gekühlt werden. Plastikartikel, wie 96-Well-Platten, sollten vor der Verwendung über Nacht vorreduziert werden, wie Kunststoff porös und können Sauerstoffmoleküle 32 zu speichern. Je nach Anwendung, einige Kunststoffe müssen für bis zu 48 h vorreduziert werden vor der Verwendung 33. Biohazard Abfall sollte be entsprechend entsorgt. Eine kleine biohazard Beutel kann innerhalb der Kammer gehalten werden, sollten jedoch häufig ersetzt werden.

Einer Wasserstoffkonzentration von wenigstens 3% ist innerhalb der Kammer gehalten werden, da dies sowohl eine gute Wachstum von C. gewährleisten difficile und effiziente Entfernung von Sauerstoff. Wenn die Wasserstoffkonzentration auf unter 3%, oder wenn die Kammer für mehrere Tage nicht verwendet worden ist, sollte eine Kammer Zyklus ausgeführt werden, um die Wasserstoffkonzentration auf erwünschte Werte wiederherzustellen. Hier wird etwa ein Drittel des Gases in der Kammer abgesaugt out (die Vinyl-Box deutlich zu entleeren) und mit frischem Gasgemisch ersetzt. Stellen Sie sicher, dass die Luftschleuse ist anaeroben vor Beginn. Pump zuviel Gas in der Kammer vermieden werden sollten, da dies stellt nicht nur eine unnötige Belastung auf den Kunststoffbeutel, sondern auch der Benutzer bis in den hinteren Teil der Kammer zu verhindern. Dieses Verfahren immer in einem gut belüfteten Bereich durchzuführen. Nehmen Sie zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen, wenn die chamber ist in einem kleinen, schlecht belüfteten Raum aufbewahrt. Öffnen Sie alle Türen, um den Raum, als die Gasgehalte in der Kammer können die Benutzer ersticken.

Zusätzliche Wartung umfasst Regeneration des Palladium-Katalysators, um eine effiziente Entfernung des Sauerstoffs innerhalb der Kammer zu gewährleisten. Sauerstoff und Wasserstoff werden durch den Katalysator reduziert wird, kann Wasser auf der Oberfläche der Palladium bedeckten Aluminiumpellets ansammeln, wodurch ihre Wirksamkeit im Laufe der Zeit. Um dies zu überwinden, sind die Palladiumkatalysatoren mindestens einmal pro Woche durch Backen bei mindestens 230 ° C für eine Stunde regeneriert werden. Darüber, wie ein Ergebnis von sowohl Sauerstoff-Reduktion und Verdampfung von Wasser aus Platten und Medien, ist die Ansammlung von Wasser ein häufiges Problem im anaeroben Kammern. Zur komfortablen Handhabung zu gewährleisten und die Halbwertszeit der Geräte innerhalb der Kammer zu erhöhen, kann Trockenmittelbeutel verwendet werden, sollte aber so häufig nach dem gleichen Verfahren für die Palladium-Katalysatoren verwendet, getrocknet werden. Alternativ kann eine deBefeuchter verwendet werden, die Luft durch einen Metallblock, der Wasser kondensiert und in einem Behälter gesammelt zirkuliert. Das Gerät verhindert Überlauf der Wasserbehälter, jedoch muss Luftentfeuchter überwacht und Behälter sollten, wenn nahezu vollständig entleert werden. Um die Vinyl-Kammer zu reinigen, ist die Verwendung von einem weichen Tuch und einem handelsüblichen Reinigungsmittel für Polyvinylchlorid (PVC) empfohlen empfohlen (z. B. Kunststoff-Magic-Reinigungsmittel, Teile-Nr. 1600480, Coy Laboratories). Um Kratzer oder Schäden am Vinyl Kammer zu vermeiden, verwenden Sie keine Papiertücher, Kim-Wischtücher oder Produkte, die Ketone oder andere Verbindungen, PVC beschädigt.

Schließlich C. difficile produziert Schwefelwasserstoffgas (H 2 S), die äußerst reaktiv und ätzend ist. Schwefelwasserstoff kann schädlich sein, Instrumentierung, der Palladiumkatalysator und alle exponierten Metalle. Wenn möglich, lassen Sie keine Instrumente, wie Homogenisatoren und Spektrophotometer, in der chamber für längere Zeiten, um Korrosion durch Schwefelwasserstoff zu vermeiden. Durch die Produktion von Schwefelwasserstoff, werden Einzelteile wie die Palladium-Katalysators und Gasanalysegerät müssen in regelmäßigen Abständen im Rahmen der regelmäßigen Wartung Kammer ersetzt werden. Alternativen zur Reduzierung von Schwefelwasserstoff Niveaus in der Kammer, beispielsweise unter Verwendung von Aktivkohle, Bleiacetat, Silberchlorid oder Silbersulfat zu absorbieren oder chemisch zu entfernen Schwefelwasserstoff, beschrieben worden, und 34 verwendet werden, um Korrosion der Ausrüstung zu verlangsamen.

Zusätzliche Vorsichtsmaßnahmen

Eine Tür zur Luftschleuse Öffnen Sie niemals ohne sicherzustellen, dass die andere Tür geschlossen und verriegelt ist, um Sauerstoff Kontamination zu verhindern. Zusätzlich zu vermeiden Verwendung von scharfen Gegenständen in der Kammer, um das Risiko der Punktion der Vinyl reduzieren.

Es ist wichtig zu beachten, daß Wasserstoff ist ein brennbares Gas in Gegenwart von Sauerstoff. Achten Sie darauf, bei der Einführung von Artikel into der Kammer, dass hohe Sauerstoffkontamination nicht auftreten (mehr als 999 ppm). Es ist wichtig, nur nicht brennbare vorgemischt anaeroben Gasgemisch verwenden, und genau das Gasanalysegerät in der Kammer zu überwachen, vor allem, wenn mit einem neuen Gas-Tank. Wenn beide Wasserstoff-und Sauerstoffkonzentrationen über 4% auf, sicherzustellen, dass die entsprechenden Notfallmaßnahmen, die in Standard-Betriebsverfahren des Labors (SOP) skizziert werden soll, eingehalten werden.

Fehlerbehebung C. difficile Wachstum

Wenn schlechte Wachstum von C. difficile-Kulturen wird in reichem Medium beobachtet wird, ist dies häufig durch Sauerstoffkontamination innerhalb der Kammer. Die Zugabe eines Reduktionsmittels (z. B. L-Cystein oder Thioglykolat) zum Wachstumsmedium zu verbessern, würde jedoch das Problem der Verunreinigung durch Sauerstoff in der Kammer behandelt werden müssen. Überwachung von Sauerstoff und Wasserstoffgehalten in der Kammer mit einem Gasanalysegerät kann schnell zu einemlert der Benutzer Fragen vor einer Verzögerung der Fortschritt und die Verringerung der Produktivität auf. Wenn Sauerstoffverunreinigung auftritt, schnell, die Quelle mit einem Gaslecksuchgerät (erhältlich von Coy Laboratories) wird empfohlen. Um die Wahrscheinlichkeit der Suche nach der Leckstelle zu erhöhen, kann ein alkoholgetränkten Lappen in die Kammer gebracht werden, da die Gas-Leck-Detektor kann erhöhte Kohlenwasserstoffe sowie erhöhte Konzentration von Wasserstoff zu identifizieren. Sobald die Quelle des Lecks gefunden wird, kann es unter Verwendung von Klebstoff oder Silikon nach den Anweisungen des Herstellers repariert werden.

Eine Reihe von Organismen leicht wachsen in anaeroben Umgebungen, einschließlich andere gemeinsame Clostridien-Arten (z. B. Clostridium perfringens) und fakultativ anaerob, Escherichia coli. Aseptische Technik und andere Strategien können das Risiko der Kontamination zu verringern. Entsprechende Organisation innerhalb der Kammer, wie das Anbringen Artikel in Reichweite, um das Potenzial f verringernoder verschütteten und schnelle Entfernung von angesammelten Abfall Biohazard können Kontaminationsrisiken zu reduzieren. Darüber hinaus können Papierhandtücher mit einer verdünnten Bleichlösung angefeuchtet regelmäßig in die Kammer gebracht, um Oberflächen und die Latex-oder Neoprenhandschuhe abwischen werden. Es ist wichtig, nicht verlassen, Bleichmittel oder Alkohollösungen in der Kammer für längere Zeit, da diese die Atmosphäre und die festen und flüssigen Medien durchdringen, tötete C. difficile sowie Beschädigung der Vinyl-34. Zusätzlich können den regelmäßigen Austausch von Latex oder Neopren-Handschuhe auch Kontaminationsrisiko zu reduzieren. Wie oben erwähnt, wenn nicht sicher, ob ein Organismus C. difficile oder eine Verunreinigung, kann ein Test für die Anwesenheit des Gens mittels PCR tdcB schnell festzustellen, ob der Organismus C. 21 difficile. Schließlich, wenn die Kultivierung mehreren Organismen im gleichen anaeroben Kammer, ist es wichtig zu beachten, dass C. difficile kann Stoffwechselnebenprodukte zu erzeugen (e. G. Schwefelwasserstoff), die das Wachstum von anderen anaeroben Organismen und umgekehrt zu verhindern.

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Disclosures

Keine Interessenskonflikte erklärt.

Acknowledgements

Wir möchten Coy Laboratories für die freundliche Bereitstellung von Bildern der anaeroben Kammer danken. Diese Arbeit wurde vom National Institutes of Health Zuschuss DK087763 (SMM) und einem STEP / HHMI Lehrplanentwicklung Fellowship (ANE) unterstützt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Proteose Peptone no. 2 BD 212120
Na2HPO4 Fisher S373
KH2PO4 Fisher BP362
NaCl Fisher S27
MgSO4 (anhydrous) Fisher M65
á´…-Fructose Fisher L96
Sodium taurocholate Sigma T4009
á´…-cycloserine Sigma C6880
Cefoxitin Fluka C4786
Brain heart infusion medium BD 237300
Proteose Peptone BD 211684
(NH4)2SO4 Sigma A5132
Tris base Fisher BP152
Agar BD 214010
L-cysteine Sigma C7755
BactoPeptone BD 211684
Columbian sheep blood agar Fisher L21928
NaCl Fisher S27
KCl Fisher P217
Glycerol Fisher BP2291
Sterile inoculating loops Fisher 22363596
Sterile swabs Fisher 1495990
Coy Vinyl Anaerobic Chamber and Accessories Coy Laboratory Products, Inc Customer Specified These items are custom ordered per laboratory needs
Materials
TCCFA agar

Proteose peptone no. 2 (Difco) 40 g
Na2HPO4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO4 (anhydrous) 0.1 g
Fructose 6 g
Agar 20 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

After autoclaving, add:
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 0.1%)
25 ml of 10 mg/ml á´…-cycloserine, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 250 μg/ml)
1.6 ml of 10 mg/ml cefoxitin, filter-sterilized (dissolve in water; final concentration, 16 μg/ml)

BHIS Medium

Brain heart infusion 37 g
Yeast extract 5 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):

3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)
10 ml of 10% (w/v) sodium taurocholate (dissolve in water; final concentration, 0.1%)

SMC Sporulation Medium

BactoPeptone 90 g
Protease peptone 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris base 1.5 g
Agar 15 g

Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize.

Optional (add after autoclaving):
3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (dissolve in water; final concentration, 0.03%)

70:30 Medium

BactoPeptone 63 g
Protease peptone 3.5 g
Brain heart infusion 11.1 g
Yeast extract 1.5 g
(NH4)2SO4 0.7 g
Tris base 1.06 g

For plates, add 15 g agar. Bring to 1 L with deionized water and autoclave at 121 °C for 20 min to sterilize. After autoclaving, add 3 ml of 10% (w/v) L-cysteine (final concentration, 0.03%).

Blood agar

The use of premade Columbia anaerobic sheep blood agar plates (Fisher Scientific, L21928)35 is recommended.

1X Phosphate buffered saline (PBS)

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2HPO4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

Bring to 1 L with deionized water and adjust pH to 7.4 with HCl. Filter sterilize before use.

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References

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