의 체계적인 분석
1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 6, 1,2,3,4,5

Bioengineering

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Summary

이 연구는 크게 생리학 관련 전단 흐름에 따라 세포 롤링 연구의 처리량을 증가, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 캐스케이드 및 환자 세포의 외인성 개체군의 전신 전달 다음 세포 호밍의 중요성을 원점 다단계 셀에서 셀 압연의 중요성을 감안할 때,이 시스템은 세포 기반 치료를 개선하기위한 스크리닝 플랫폼으로 잠재력을 제공한다.

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Levy, O., Anandakumaran, P., Ngai, J., Karnik, R., Karp, J. M. Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System. J. Vis. Exp. (80), e50866, doi:10.3791/50866 (2013).

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Abstract

세포 기반 치료를위한 주요 과제는 전신 정맥 내 또는 동맥 내 주입 다음 그 조직에 고효율로 생존 세포의 대량을 대상으로 할 수 없다는 것이다. 따라서, 휴대폰 호밍을 증가하는 것은 현재 세포 치료를 개선하기위한 전략으로 연구된다. 혈관 내피 세포에 압은 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계이며 평행 평판 유동 챔버 (PPFC)를 이용하여 시험관 프로빙 할 수있다. 그러나,이 저조한 제어 흐름 조건, 매우 지루한, 낮은 처리량 분석이다. 대신, 우리는 정밀하게 제어, 생리학 관련 전단 흐름 1,2에서 높은 처리량 세포 롤링 특성의 연구를 가능하게하는 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템을 사용했다. 이 논문에서, 우리는 P-및 E-셀렉틴 코팅 표면뿐만 아니라 세포 단층 코팅 표면에 HL-60 (인간 골수성 백혈병) 세포의 회전 특성이 readil 할 수있는 방법을 보여y를 조사했다. 더 염증성 조건을 시뮬레이트하도록, 미세 유체 채널 표면이어서 상당히 동적 조건하에 HL-60 세포와의 상호 작용을 증가 종양 괴사 인자-α (TNF-α)로 활성화 된 내피 세포 (EC에)으로 코팅 하였다. 향상된 처리량과 같은 속도를 압연과 경로를 압연과 같은 매개 변수의 신속한 분석을 허용 통합 된 다중 매개 변수 소프트웨어 분석 플랫폼은 체외 세포 롤링 특성을 평가하기위한 중요한 장점이다. 세포 압연 및 원점 복귀에 영향을 미칠 수 있도록 설계 엔지니어링 방식의 신속하고 정확한 분석을 허용,이 플랫폼은 사전 외인성 세포 기반 치료를하는 데 도움이 될 수 있습니다.

Introduction

세포 기반 치료의 성공적인 임상 번역의 주요 과제 중 하나는 비효율적 인 배달 또는 원하는 사이트 3,4에 체계적으로 주입 된 세포를 대상으로합니다. 따라서, 휴대폰 호밍을 개선하기위한 방법 일정한 검색이있어, 특히 세포 치료를 개선하기위한 전략으로, 압연 전지. 혈관에 롤링 세포는 고전적인 질병 사이트 5 모집 백혈구에 대해 정의 된 세포 유도 폭포,에서 중요한 단계입니다. 이 단계는 내피 셀렉틴 사이 특정 상호 작용에 의해 지배된다, 즉, P-및 E-셀렉틴 (P-및 E-SEL), 백혈구 5,6의 표면에 자신의 카운터 리간드. 더 나은 이해와 셀 원점 복귀의 효율 향상, 특히 압연 단계는 세포 기반 치료를 개선하기 위해 새로운 플랫폼에 대한 탐구에 매우 중요합니다. 지금까지이 두 평면 플랫폼을 포함, 평행 판의 흐름 챔버 (PPFCs)를 사용하여 달성되었다세포 현탁액을 주사기 7,8, 9 펌프 사용하여 관류 통해 상부 플레이트에있는 유입과 유출 포트와 그들 사이 가스켓와 에스. 바닥 판의 표면은 중요한 세포 단층 / 기질로 코팅 될 수 있고, 전단 유동하 관류 세포와 표면 사이의 상호 작용은 다음 7을 탐구이다. 그러나 PPFC 거품 형성, 누출, 주요 단점을 제시 제대로 제어 흐름과 낮은 처리량, 시약 소모 및 매우 지루한 방법입니다.

전통적인 PPFC에 대한 대안 기술은 낮은 시약 소비 1,10으로, 정확하고, 컴퓨터로 제어되는 전단 흐름에서 세포 분석의 높은 처리 성능 (PPFCs보다 최대 10 배 이상)을 허용, 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템입니다. 셀 롤링 실험은 USI를 세포 단일 층 또는 설계 기판 코팅 및 이미지가 될 수는 미세 유체 채널 내에서 수행된다NG 롤링 특성을 가진 현미경은 쉽게 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석 하였다. 이 연구에서, 우리는 인간 골수성 백혈병 다른 표면에 (HL-60) 세포의 회전 특성을 연구하여이 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 보여줍니다. HL-60은 P-및 E-SEL뿐만 아니라 다른 롤링 수용체를 발현하는 세포의 단층을 분석 하였다 같은 기판 상에 롤링. 또한, 항체 (AB)에 그 표면에 HL-60의 회전 운동을 중재의 특정 셀렉틴의 직접 참여를 설명하는 데 사용되었다 블로킹. 롤링 실험은 같은 회전 속도, 회전 세포 수 및 압연 경로 속성으로 키 롤링 매개 변수의 효율적인 분석을 허용하는, 최소한의 시약 / 셀 소비, 안정적인 전단 흐름에 따라, 용량 증가 하였다.

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Protocol

1. 세포 배양

  1. 인간 골수성 백혈병 (HL-60) 세포
    1. 75cm 문화 HL-60 세포를 20 % (V / V) 소 태아 혈청 (FBS), 1 % (V / V) L-글루타민 및 1 보충 Iscove의 수정 된 둘 베코의 중간 (IMDM), 15 ㎖ 2 플라스크 % (V / V) 페니실린 - 스트렙토 마이신을.
    2. 세포 현탁액의 볼륨의 절반을 흡입하고 완전한 IMDM 미디어로 교체하여 3 일마다 미디어를 변경합니다.
    3. 카르복시 디 아세테이트를 들어, 숙신 에스테르 (CFSE) 염색, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 1 μM의 CFSE 용액에 resuspend (데워진 PBS에서 준비) 및 37 ℃에서 15 분 동안 품어 그런 다음 30 분 동안 신선한 데워진 배지에서 원심 분리기 세포, 기음 뜨는에 resuspend 세포. PBS로 세포를 세척 한 후 (P-SEL 코팅 표면에 CFSE 염색 HL-60 세포의 대표 이미지 그림 1B 참조) 롤링 실험을 위해 사용합니다.

  1. 폐의 미세 혈관 내피 세포 (LMVECs)
    1. 코트 100mm 페트리 0.1 % 젤라틴 용액 (PBS에서의 v / V)와 함께 요리와는 적어도 30 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
    2. 전체 내피 성장 매체의 젤라틴 코팅 100mm 배양 접시에 문화 LMVECs은 (내피 기초 매체-2 (EBM-2)), 특정 성장 보조 장비 보충은) 시약을 참조하십시오. 미디어에게 80~90% 합류에 도달하면 매일과 하위 문화의 세포를 변경합니다.
    3. 하위 문화, PBS로 세포를 씻어 준 후 분리 세포를 1X 트립신-EDTA 4 ㎖로 3 분 동안 37 ° C에서 완전 EBM-2 미디어의 동일한 볼륨에 중화. 15 ML 튜브 및 centrifug에 세포 현탁액을 전송E (400 XG, 5 분). 원심 분리 후, 완전한 내피 미디어 1 ML에서 펠렛을 재현 탁하고 혈구와 세포를 계산합니다. 이 모든 실험을위한 통로 (7)에 따라 만 세포를 자신의 형태와 기능 사용에 영향을 미치는 등, 이상하지 통로 세포를 수행합니다.
  1. 중국어 햄스터 난소-P-셀렉틴 (CHO-P) 세포
    1. 안정적으로 인간의 P-SEL을 표현하는 형질 전환 된 CHO 세포이다 CHO-P 세포, 공동 작업자 (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의대) (11, 12)에 의해 제공되었다.
    2. F-12 미디어 25 ㎖에있는 T175의 CM 문화 CHO-P는 세포 2 플라스크.
    3. 계대를 들어, 4 ~ 5 초 동안 PBS 10 ㎖로 세포를 세척 한 다음 전체 미디어에서 중화 한 다음 37 ℃에서 3 분에 대한 1X 트립신-EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 10 ㎖에를 Trypsinize.
    4. 원심 분리 세포 현탁액 (400 XG, 5 분), 정중, 상등액을 흡인 전체 미디어 1 ㎖ 중에 세포 펠렛을 재현 탁과 함께 세포를 세어혈구.

2. 통합 다 잘 플레이트 미세 유체 시스템의 작동

  1. 모든 장비가 제대로 연결되어 있는지 확인하고, 다른 모듈을 켜 : 컴퓨터, 컨트롤러, 거꾸로 현미경과 CCD 카메라.
  2. 이미징 소프트웨어를 열고, 멀티 웰 플레이트 모듈과 영상 모듈이 화면에 표시되어 있는지 확인하십시오.
  3. (컨트롤러에 연결) 증기 트랩에 튜브를 연결하고 또한 그들에게 압력 인터페이스에 연결합니다.
  4. 플레이트 히터 / 어댑터 멀티 웰 플레이트를 놓습니다. 우물 (아래에 설명)에 시약을 추가하고 접시 위쪽에 인터페이스를 연결합니다. 자동화 된 단계에 이미징 플레이트를 놓습니다.
  5. 인터페이스는 플레이트의 상부에 부착하고 멀티 웰 플레이트를 이용하여 쉽게 제어 할 정의 유속 미세 유체 채널을 통해 유체를 구동 웰의 상부에 컨트롤러로부터 공기압을 적용수동 모드에서 모듈 화면.
  6. 웰 사이에 관찰 영역에 걸쳐 채널 흐름 시약. 미세 유체 채널의 크기는 70 μm의 높이 350 ㎛의 넓​​은 x입니다. 선형 채널의 길이가 1mm이고 채널의 바닥은 브라이트, 위상, 및 공 초점 형광 현미경과 호환 180 μM의 유리 커버 슬립을 포함한다.
  7. CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 분석 할 수 있습니다.

3. 단백질 기질 또는 세포 단층과 미세 유체 채널의 코팅

  1. 피브로넥틴 또는 P-/E-selectin과 미세 유체 채널을 코팅
    1. PBS에서 20 ㎍ / ml의 피브로넥틴 용액 1 ㎖를 준비합니다. 코팅되어야하는 채널들의 수 (채널 당 피브로넥틴 25-50 μl를 사용)에 기초하여 부피를 바꾼다.
    2. 물론 각각의 입구에 피브로넥틴 솔루션의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 2 DYN / ㎠의 전단력 적용5 분 채널을 perfuse하는 데 필요한 권한입니다. 액체가 아니라 콘센트에 나타나는의 구슬을 유의하시기 바랍니다. 실온에서 30 ~ 45 분 알을 품다
    3. 우물에서 솔루션 (채널을 공급하는 중간 원에서 직접 흡인하지 않습니다) 1,13 대기음. 콘센트도에 PBS의 200 ~ 500 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 PBS와 채널을 씻어. 채널은 정상적으로 피브로넥틴 및 사용 준비로 코팅된다.
    4. 표면 코팅을 할 수 있도록 37 ° C에서 1 시간 배양과, 상기 한 바와 같이 P 또는 E-SEL, PBS에서 원하는 사람의 재조합 단백질의 5 ㎍ / ㎖의 용액을 제조하고, 코트 채널 코트.
  2. 미세 유체 채널 내부 CHO-P 또는 LMVEC 단층의 생성
    1. 부드럽게 전체 미디어와 원심 분리기의 2 배 용량 (400 XG에서 5 분)를 사용하여 소멸, 3 분 동안 배양 접시에서 세포를 Trypsinize. 전체 미디어와 원심 분리기 10 ㎖ (400 XG에서 5 분)로 재현 탁 셀 전압 강하N.
    2. 현탁액으로 세포 농도를 결정하기 위하여 세포를 카운트. 채널 내부 합류 LMVEC 단층의 형성을 보장 15-20000000 세포 / ml로 세포 농도를 가지고. 합류 CHO-P 세포 단일 층의 경우, 50-60000000 세포 / ml를 사용합니다. 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다 - 따라서 실험에 사용되는 결정 초기 셀 수.
    3. 잘 입구에 적절한 농도로 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 추가합니다. 현미경의 무대에서 접시를 놓고 세포가 전체 채널을 작성 화면에서 관찰하고 흐름을 중단 할 때까지 채널 (2 DYN / ㎠)로 세포를 소개합니다.
    4. 전체 LMVEC 또는 CHO 미디어 중 하나를 200 ㎕ 씩 출구와 입구를 모두 입력합니다. 세포가 정착하자 인큐베이터에서 3 시간 동안 준수 (37 ° C에서 5 % CO 2).
    5. 3 시간 배양 한 후, 무소속 제거하기 위해 전체 미디어 (2 DYN / ㎠, 10 ~ 15 분)와 채널을 씻어세포. 세포는 이제 완전히 합류 나타납니다과 채널의 사용 준비가 완료됩니다. 초기 셀 시딩 밀도에 따라, 안정화 시간을 추가로 2 ~ 3 시간은 세포 표면의 전체 범위를 확인해야 할 수 있습니다.

4. LMVEC 프로 염증 활성화 및 P-/E-selectin의 항체 차단

  1. LMVEC 기초 미디어에서 TNF-α 용액 (10 NG / ML)를 준비합니다.
  2. , 채널에 LMVEC의 염증 활성을 유도 아니라 입구에 TNF-α 용액 100 μl를 추가하고 5 분 동안 2 DYN / ㎠의 전단 흐름을 적용하여 채널에 솔루션을 소개합니다. 제어 채널 (활성화되지 않은되는 EC)는, 흡입구 LMVEC 기저 매체의 100 μl를 잘 추가 채널 (5 분간 2 DYN / cm 2)로 소개한다. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다.
  3. P-SEL 및 LMVECs 및 CHO-P 세포에 E-SEL을 차단하기 위해, P-SEL (복제 AK4, 바에서 5 ㎍ / ㎖의 중화 소개샐 미디어) 또는 E-SEL (복제 P2H3, 기저 미디어 5 ㎍ / ㎖)을 채널로 항체 및 37 ℃에서 1 시간 동안 배양 다음으로, (5 분 2 DYN / ㎠) 기저 매체와 채널을 씻어. 채널은 지금 롤링 분석을위한 준비가되어 있습니다.

5. 기판 / 세포 단층 코팅 미세 유체 채널에서 HL-60 롤링 분석

  1. 조심스럽게 채널이 제대로 (세포와 코팅의 경우, 완전히 합류 세포 단층이 관찰되어야한다) 코팅되어 있음을 확인하기 위해 현미경으로 채널을 검사합니다.
  2. 롤링 실험, 원심 분리기 HL-60 세포 현탁액 (400 XG에서 5 분)에 대한 HL-60 세포 현탁액을 준비하고 기저 매체와 한 번 씻어. 5,000,000 세포 / ml로 HL-60 세포 현탁액을 생성하기 위해 (칼슘 2 + 2 + 및 Mg를 함유 기저 매체) IMDM에서 세포에 resuspend 횟수. 롤링 분석을 수행하기 위해 각 채널에 대한 세포 현탁액의 25 ~ 50 μl를 사용합니다.
  3. 셀 suspe의 25 ~ 50 μl를 추가합니다nsion 현미경 단계에 온도 조절 플레이트 홀더 (37 ° C) 및 장소 안에 잘 장소 접시를 콘센트에. 다음으로, (세포가 입구에 콘센트에서 흐르는 15 초 이내에 관찰되어야한다) 2 DYN / ㎠의 전단력을 적용하여 채널에 세포를 소개합니다.
  4. 전단 응력의 ​​함수로서 압연 응답을 검사하려면, (5 DYN까지 0.25부터 서서히 전단력을 증가 DYN / cm 2 0.25 전단을 줄이고 원하는 각 전단에 ( "스트림 취득"기능을 사용) 20 ~ 30 초의 영상을 취득 / cm 2. 그것은) 높은 가위를 사용하는 것도 가능하다.
  5. CCD 카메라 (스트림 획득, 11 프레임 / 초)를 사용하여 영상을 획득하고 호환 가능한 소프트웨어를 통해 경로를 회전하고 회전 속도를 분석 할 수 있습니다.

6. 표면 분자의 발현을 감지하는 유동 세포 계측법

  1. 트립신 처리 후, 원하는 세포 유형 (HL-60,-CHO의 (1-2 × 105 세포 / 샘플을 사용) 세포 현탁액을 준비PBS에서 P 또는 LMVECs) (- / -), 2 % FBS가 보충. 두 번 세포를 세척하고 50 μL (같은 버퍼를 사용하여)에 샘플 볼륨을 가져온다.
  2. 20 분 4 ° C에서 원하는 형광 - 복합 AB (자세한 내용은 첨부 표 참조) (알루미늄 호일로 커버) 각 샘플을 품어.
  3. 두 번 (같은 버퍼) 세포를 세척하고 200 μL에 스테인드 세포 현탁액의 최종 볼륨을 가져옵니다. 표면 분자의 발현을 검출하는 유동 세포 계측기를 사용하여 샘​​플을 분석한다.

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Representative Results

HL-60 세포가 피브로넥틴에 P-및 E-셀렉틴 표면에 롤 아니지만

그들은 롤링 리간드 P-SEL 당 단백질 리간드-1 (PSGL-1) 시알 릴 루이스 X (SLEX)을 포함하여 원점 복귀 리간드의 다양한 5,14 (그림 1A 표현으로 HL-60 세포는 황금 표준 "롤러"로 간주됩니다 ). 과 특정 상호 작용을 매개하는 테트라 당 SLEX위한 발판으로 표면 단백질 PSGL-1의 역할, P-및 E-SEL, 염증 5,6,15시 내피에 상향 조절되는. 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 기능을 테스트하기 위해, 다수의 미세 유체 채널은 그 표면을 분석 하였다 서로 다른 기질과 HL-60 세포의 구름 상호 작용과 동시에 코팅 하였다. HL-60 세포는 별개의 회전 운동에 의해 다음에 제 1 유동에서 캡처 한 세포로, P-SEL 코팅 표면에 강력한 회전 동작을 보였다. 도 1C에 도시 한 구성으로 제문학 ENT는 HL-60 세포는 E-SEL 표면에 유사한 롤링 동작을 나타냅니다, 아직 피브로넥틴 코팅 기판 14,16-19에. 호환 소프트웨어를 통해 분석 셀 속도는,,에 대한 세포의 강력한 롤링 응답을 보여, 전단 응력에 대해 도시 된 P-및 1-12 μm의 / 초 사이의 평균 속도와 E-SEL.

HL-60 세포는 미세 유체 채널을 코팅 CHO-P 단일 층에 롤

다음으로, 또한 효율적으로 세포 표면을 코팅 세포 단층 사이의 상호 작용을 시험하기 위해 마이크로 유체 시스템을 사용할 수있는 가능성을 평가하기위한 목적. 롤링 마커를 발현하는 세포 단층과 HL-60 세포의 상호 작용을 탐구하기 위해, 우리는 안정적으로 표현하는 형질 CHO-P 세포 사용 P을 수 있지만 E-, SEL (그림 2A. 또한 대표는 그림 2B 참조 미세 유체 채널) (11, 12)을 코팅 CHO-P 단일 층에 HL-60 세포의 이미지. HL-60 세포는 CHO-P 세포에 강한 롤링 응답 (그림 2C)를 표시. 이 회전 운동이 실제로 P-SEL에 의해 매개되어 있는지 여부를 테스트하기 위해, CHO-P 단일 층을위한 항체를 블로킹으로 미리 배양 된 P-또는 이전 채널로 HL-60 세포의 관류에 E-SEL, 하나. AB 그 P-SEL을 보여주는 표면에 HL-60 세포를 압연의 수가 크게 감소 결과 P-SEL로 CHO-P 단일 층을 차단,도 2c에 도시 된 바와 같이 참 HL-60은 앞서 설명한 롤링 중재 (14, 18). 미세 유체 채널 분석을 수행하면 25 ㎕의 한 작은 만 작은 볼륨을 사용하여 서로 다른 조건과 수용체의 효율적인 차단을 신속 심사를 허용합니다. 아이소 타입 컨트롤 또는 시종 (CHO-P 세포에서 발현되지 않는) E-SEL 차단 정확하게 특정 계면의 직접적인 관여를 핀 포인팅이 분석의 강도를 보여주는, CHO-P 세포에 롤링 세포의 수에 영향을 미치지 않았다휴대 롤링 상호 작용에 전자 표식.

TNF-활성화 LMVECs에 HL-60 세포의 롤링은 E-셀렉틴에 의해 매개된다

내피 세포는 염증 5,6의 사이트에 백혈구의 채용에 지원, 염증 동안, 같은 P-및 E-SEL로 최대 조절 접착 표면 마커로 알려져있다. 뮤린의 EC는 인터루킨 -1 (IL-1) 및 종양 괴사 인자-α (TNF-α)와 같은 염증성 자극에 반응하여 P-및 E-SEL 모두를 표현하면서 그러나, 사람의 내피는 이들에 대응하여 E-SEL 간편 (20, 21)를 사이토 카인. 이는 E-SEL의 발현을 보여주는 분석 세포 계측법 우리의 흐름을 확인하지만,이 되었나요 P-SEL, TNF-α 자극 (그림 3A)에 대한 응답으로 폐의 미세 혈관 내피 세포 (LMVEC)에 대한 것입니다. 다 잘 미세 유체 플레이트는 여러 다른 조건의 높은 처리량 테스트를 허용, 수많은 별도의 미세 유체 채널로 구성되어 있습니다. 우리는이 유리한 디자인을 사용빠르게 여러 조건에서의 EC와 HL-60 세포의 상호 작용을 분석 할 수있는 미세 유체 채널 (그림 3B) 내부 LMVECs를 판에. 염증 설정을 시뮬레이션하기 위해 LMVECs은 염증성 사이토 카인 TNF-α 전처리 하였다. 흥미롭게도, HL-60 세포는 않은 활성화 LMVECs와 상호 작용하지 않았으며, 세포는이 표면에 롤 관찰되지 않았다. 반대로, HL-60 세포는 5 ~ 15 μm의 / 초 평균 속도 (그림 3C)와 TNF-α 활성화 LMVECs에 강한 회전 동작을 표시.

우리는 그 다음 HL-60 세포와 활성화 LMVECs 사이의 롤링 상호 작용 P-SEL 또는 E-SEL의 참여를 탐구하는 것을 목표로. 이를 위해, TNF-α는 활성화 된 내피 P-SEL 또는 항체를 차단 E-SEL 함께 예비 인큐베이션시키고, HL-60 세포의 말기를 분석 하였다. TNF-α 활성화 LMVECs에 상향 조절했다 E-SEL을 차단,도 4a에 도시 된 바와 같이, signific 결과활성화 된 내피 세포 단일 층에 롤링의 수 개미 감소. 반대로, 활성화 된 내피에 표현되지 않은 P-SEL, 대 이소 제어 또는 AB를 사용하여 HL-60이 활성화 된 내피 층에 압연에 중요한 영향을 미치지 않았다. 이 데이터는 이전의보고 (20, 21)와 일치, TNF-α 활성화되는 EC에 롤링 HL-60 E-SEL의 직접 참여를 보여줍니다. 취득 된 영상으로부터, 분석 소프트웨어는 기판과 상호 작용하는 각 셀의 경로를 추적하는 일을 허용한다. 우리는 특별히 E-SEL 차단 WO 승 / TNF-α가 활성화되는 EC와 상호 작용 개별 셀의 경로를 추적하기 위해이 기능을 사용했습니다. 도 4b에 도시 된 바와 같이, 블록화 활성화 LMVECs에 세포를 압연 개수가 활성화되는 EC E-SEL 차단에보다 현저하게 높았다. 게다가, 차단을 해제 LMVECs에 HL-60의 회전 운동이 지속적이고 강력한 것이 등장하면서 세포의 회전 경로E-SEL 차단되는 EC에 (각 색이 다른 셀을 나타내는 그림 (b)에 GL 대 AF 예를 들어 셀에 대한 참조) 세분화했다. 이 연구 결과와 일관성에서 차단을 해제 TNF-α가 활성화되는 EC에 HL-60 세포의 회전 속도는 E-SEL 차단되는 EC (그림 4C)에 자신의 회전 속도보다 유의하게 낮았다.

그림 1
그림 1. HL-60 세포는 P-및 E-셀렉틴 코팅 표면에 롤. (A) HL-60 세포는 표현 롤링 리간드 PSGL-1과 SLEX (ISO 클릭률 - 이소 제어, 아니 AB - 아니 항체). (B) P-SEL에 CFSE 염색 HL-60 세포의 대표 스냅 샷 이미지 흐름에 따라 표면을 코팅. (C) HL-60 세포가 견고 P-및 E-SEL 코팅 표면에 롤 있지만 피브로넥틴 코팅 표면에. 회전 속도는 전단 응력에 대해 도시 (N = 10-1된다데이터 포인트 당 5 개 세포, 속도는) 호환 소프트웨어에 의해 분석 하였다. 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 2
그림 2. HL-60 CHO-P 세포 단일 층에 롤링 직접 P-SEL에 의해 매개된다. (A) CHO-P 세포는 P-SEL을 표현할 수 있지만 E-SEL. (B) 미세 유체 채널 (10X 배율)의 표면을 코팅하는 CHO-P 단일 층에 HL-60 세포의 대표적인 이미지. (C)를 ​​HL *, CHO-P 단일 층은 이소 컨트롤을 배양하는 항체, 이소의 CTR-CHO-P 단일 층으로 배양되지 않았다 - AB 차단이 해제 (분석을 차단하여 시연으로 CHO-P 단일 층에 롤링 -60 세포를 직접 P-SEL에 의해 매개된다 P <0.05, ANOVA는 Tukey의 HSD 사후 테스트에 사용 된 단방향, 오차 막대 대표SEM, N = 3.

그림 3
그림 3. HL-60 세포는 TNF-α 활성화 LMVECs에 롤. (A) LMVECs의 TNF-α의 활성화는 E-SEL의 표면 발현을 유도,하지만 P-SEL. (B) 두 개의 미세 유체 채널 (4X 배율)에 합류 LMVEC 단층의 대표 이미지. (C) HL-60 세포를 전시 TNF-α 활성화 LMVECs에 강력한 롤링 응답,하지만 유엔 활성화 LMVECs에. 이소 클릭률 - 이소 제어, unact되는 EC - 활성화되지 않은 내피 세포, TNF-α-행위의 EC -. TNF-α 활성화 내피 세포는 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오 .

그림 4 < BR /> 그림 4. HL-60은 TNF-α 활성화 LMVECs에 롤링은 E-셀렉틴에 의해 매개된다. (A) HL-60에 롤링 TNF-α 활성화 AB 차단에 의해 입증으로 LMVECs이 아니라 P-SEL보다, E-SEL에 의해 매개된다 분석 (이소 컨트롤을 배양 이소의 CTR-EC의 단일 층, * P <0.05, ANOVA는 Tukey의 HSD 사후 테스트에 사용 된 단방향, 오차 막대는 SEM을 나타내고, N = 3) (B) 휴대 경로 분석은 지속적으로 보여준다. 및 차단을 해제 활성화되는 EC에 HL-60 세포의 강력한 롤링 E-SEL 차단 활성화되는 EC 관찰 조각, 약한 압연에 비해 (각 색깔이 다른 셀을 나타냅니다. 분석이 적합한 소프트웨어를 통해 수행되었다). (C) HL-60 압연 TNF-α가 활성화되는 EC에 속도는 E-SEL 차단 활성화되는 EC (사용되는 전단 응력에 비해 차단을 해제 활성화되는 EC에 느립니다. 2 DYN / cm 2 * P <0.05, 짝 양측 t-검정, 오차 막대가 나타 SEM, 그룹 당 n = 17-36 세포).www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "대상 ="_blank "> 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

외인성 세포 기반 치료의 성공적인 번역의 주요 과제 중 하나는 효율적으로 높은 생착 효율 3 부상과 염증의 사이트에 세포를 제공 할 수 없다는 것입니다. 셀룰라 롤링 결국 조직 (5)에 내피 통해 확고한 부착 및 이주에 이르는, 혈관의 벽에 세포의 감속을 용이 셀 원점 복귀하는 과정에서 중요한 단계를 나타낸다. 후보 세포 유형에 대한 압연 공정의 더 나은 이해는 세포 호밍을 강화하고 세포 기반 치료를 개선하는쪽으로 크게 기여하는 기술의 개발로 이어질 수 있습니다.

PPFC 전단 흐름에 따라 세포 압연뿐만 아니라 다른 세포의 행동을 탐구하는 널리 사용되는 도구입니다. 내피 세포에서 호중구의 접착력을 조사하기위한 PPFC의 적용은 1987에 처음. 로렌스 등으로 공부했고, 그 이후 시중에서 생산 된TS는 8,9를 개발되었다. PPFCs은 챔버 (7)의 크기를 제어하는 개스킷에 의해 분리 된 두 개의 평판으로 구성되어 있습니다. 상판은 주사기 펌프를 사용하여 챔버 7,8 통해 세포 현탁액의 관류 수 유입 및 유출 포트를 포함한다. 함께 7을 누르면 번호판을 유지 부압 (진공)에 적용되는 추가 포트도 있습니다. 평행 평판 유동 챔버 효과적으로 전단 유동 조건 하에서 세포 롤링 세포 반응을 조사하기 위해 사용되었지만, 그 효과를 감소 많은 제한이있다. 유량 용기의 주요 제한은 세포에 의한 흐름 시스템 (7) 내에서 큰 죽은 볼륨에 필요한 시약의 큰 볼륨의 높은 숫자입니다. 또 다른 중요한 문제는 쉽게 잠재적으로 세포 단층 기판을 방해, 유동 챔버를 조립하는 동안 발생할 수있는 기포의 존재이며바닥 판 (22)에 코팅. 그러나, 상기 변형은 공기의 제거를 용이하게 기포 트랩으로서 작용하는 상부 플레이트에 추가 포트를 통합하는 전통적인 PPCFs에 적용된 23 거품. PPFC 실험을 설정하는 것은 지루하고도이며, 개스킷이 손상되거나하지 깊게 조립되면 플로우 셀은 누설에 민감하다. 끝으로, 균일 한 유량의 좁은 범위의 결과 원하는 실험적 적용된 전단 율 사이의 차이가있다. 이론적으로 입구와 출구의 위치를 변화와 함께 네 PPFCs을 비교함으로써, 그것은 구성의 두 최대 75 % (24)에 의해 계산 된 전단 속도에서 이탈 전단 율을 모델링 한 것으로 나타났습니다. 동일한 챔버를 재사용하는 것은 시간 소모적 세척 단계를 필요로하며, 상기 과제와 결합이 PPFCs 상당히 번거롭고 낮은 처리량 만든다.

우리의 연구에서, 우리는 완벽하게 통합 된 멀티 - 웰 (P)를 사용정확하게 제어 전단 흐름 1,2,13에 의존 후반 마이크로 유체 시스템. 이 48 개 미세 판은 미세 유체 채널의 1.25와 연결 인접 우물의 각 쌍 (24) 미세 유체 채널을 포함한다. 10-12 압연 분석법은 하루에 수십 조건의 신속한 선별을 가능하게 한 시간에 수행 될 수있다. 미세 유체 채널을 손쉽게 단백질 기질 또는 세포 단일 층으로 코팅 될 수 있고, 또한 표면의 세포 사이의 상호 작용은 CCD 카메라에 의해 취득하고 호환 가능한 소프트웨어로 분석 현미경을 이용하여 묘화 될 수있다. 이러한 세포의 정량화, 회전 속도의 계산 및 특정 트랙 경로 분석 등의 주요 매개 변수는 쉽게 효율적으로 다수의 기판 (13)에 회전 동작을 분석하는 얻을 수있다. 이 연구에서, 우리는 키를 표현, 잘 설립 된 "롤러"HL-60 골수성 백혈병 세포주를 사용하여 세포 롤링 연구에서이 시스템의 효율성을 평가함께 P-및 E-SEL 15,26에 대한 대응 리간드 역할 등 PSGL-1과 SLEX으로 압연 리간드. 이전 보고서와의 상관 관계에서, HL60 세포는 실제로 1-12 μm의 / 초 14,17-19의 느린 회전 속도와, P-및 E-SEL 코팅 된 미세 유체 채널의 강력한 회전 동작을 보였다. HL-60 세포는 미분화 된 HL-60 세포를 피브로넥틴 (16)와 접착제의 상호 작용을 나타내지 않는 것을 보여주는 이전의보고와 일치, 피브로넥틴 표면에 굴하지 않았다. 10-12까지 분석 / 시간을 허용하는 멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템의 디자인은 PPFCs를 사용하여 테스트 할 수 있습니다 만 1-2 분석 / 인사, 크게 최소 5 배의 처리량을 증가에 비해. 또한, PPFCs 더 성능 속도를 늦추고, 각각은 다시 사용하기 전에 재 조립 및 세척해야합니다. 또, 용이하게 제어 흐름은 좀처럼 적합한 소프트웨어를 통해 분석 될 수 전단 의존성 실험의 빠른 성능을 가능하게한다.

(도 2A) (11, 12)를 과발현하는 형질 감염 CHO-P, CHO 세포를 사용 하였다. HL-60 세포는 효율적으로 세포 단층의 완전성을 위태롭게 할 수있다 거품의 형성을 방지 디자인 관련 전단 유동하 세포 - 세포 상호 작용을 탐구하는 본 시스템을 사용하는 능력을 보여주는, CHO-P 세포에 상당한 롤링 반응을 나타냈다 어느 PPFCs 22, 23를 사용할 때 자주 발생합니다. 우리는 압연 공정에서의 잠재적 인 참여를 탐구하는 P 또는 E-SEL 항체 CHO-P 세포를 차단했습니다. P-SEL 차단이 크게 이전보고 14,18,20과 일치 HL-60 압연, 중재에 P-SEL의 직접적인 참여를 나타내는 CHO-P 단일 층에 세포를 압연의 수를 감소시켰다.E-SEL AB 및 아이소 타입 컨트롤 AB 차단이 효율적으로 세포 - 세포 상호 작용을 매개하는 특정 마커를 검출하기 위해 마이크로 유체 시스템에서 사용할 수 있음을 보여 CHO-P에 HL-60에 압연에 아무런 영향을 미치지 않았다. 중요한 것은, 각 채널은 시약이 소요 PPFC과 전형적인 대형 죽은 볼륨 7과는 달리이 분석에 대한 비용이 많이 드는 절대 또는 세포 현탁액의 최소한의 볼륨을 적게 25-50로 μl를 필요로합니다.

우리는 다음 HL-60 세포와 내피가 미세 유체 채널을 코팅 사이의 상호 작용을 분석하여이 멀티 웰 플레이트 시스템을 테스트했다. 내피는 표현하는 P-및 E-SEL을 염증 과정 5시 알려져있다. 염증성 자극으로 내피를 제공하기 위해, 우리는 TNF-α로 사전 처리. E-SEL 규제 업 동안, P-SEL은, 문학은 인간의 내피는 E-SEL을 표현하지만 P-SEL은, TNF-α의 활성화에 응답 영장류 P-SEL 프로모터는 TNF가 부족하기 때문에 것을 보여주는 일치하지 않습니다 -α 응답 요소 열매단지 E-SEL (20, 21)의 전사 유도에 lting. 염증성 조건은 다음 EC 표면과의 상호 작용을 탐구하는 HL-60 세포의 관류 한 후, TNF-α와 EC의 단층을 배양하여 채널 내에서 시뮬레이션되었다. HL-60은 활성화되지 않은 내피와 상호 작용하지 않는 동안, 그들은 문학 22에서보고 된 반응과 상관 TNF-α가 활성화되는 EC (그림 3C)에 대한 강력한 롤링 응답을 표시했다. AB 실험 (그림 4A)를 차단하면 다음 E-SEL,하지만 P-SEL이 활성화되는 EC에 롤링 HL-60에있는 뜻 깊은 감소의 결과 블로킹 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 E-SEL의 직접적인 개입을 입증하고, TNF-α 활성 인간의 내피 (20, 21)에 HL-60의 롤링을 매개로하지 P-SEL. AB는 반대로 P-SEL 매개가 CHO-P에 롤링 대 활성화되는 EC에 E-SEL 매개 롤링을 보여주는 실험을 차단, 더 AB의 blocki의 가능성과 타당성을 검증NG 실험 급속이 마이크로 유체 시스템에서 수행 하였다. 흥미롭게도, 롤링이 억제는 VCAM-1과 같은 다른 표면 수용체는 또한 활성화되는 EC (27)에 회전 HL-60에 참여할 것을 제안 (약 70 % 감소) 완료되지 않았습니다. 트랙 경로 분석은 또 다른 흥미로운 현상을 밝혀 - 차단을 해제 활성화되는 EC에 HL-60의 회전 연속 강력한 동안, 여전히 E-SEL에 압연 세포의 낮은 수의 EC는 (차단되는 EC에 조각 구름 경로를 표시 활성화 차단 된 그림 (b)). 이 현상은 P-SEL 차단 또는 이소 타입 컨트롤 (데이터 미도시)과 함께 배양되는 EC에서 관찰되지 않았다. 이 강력 EC E-SEL이 차단 될 때 롤링 응답이 다른 마커를 통해 가능하지만,이 구름이 활성화되는 EC 5,22 만 느슨한 부분 롤링 응답을 지원하고, 약한 부분 HL-60-EC의 상호 작용에 의존하는 것이 좋습니다 ,27-29. 이것은도 4c에 도시 된 데이터에 의해지지된다 30-33을 설명하고, 여기에 제시된 멀티 웰 플레이트 시스템을 통해 미세 유체의 처리량을 개선하고, 더 하이라이트를 향해 키 롤링 속성의 효율적이고 정확한 분석을위한이 기술의 잠재적 인 치료 응용 프로그램 개선 .

이 연구는 HL-60 세포를 사용하여 생리 학적으로 적절하고 정확하게 제어 전단 흐름에 따라 단백질의 기질 및 세포 단일 층에 롤링의 시험에 초점을 맞춘멀티 웰 플레이트 미세 유체 시스템. 마찬가지로, 다른 세포 유형 및 다른 기판 / 세포 단층을 용이 그들의 롤링 특성을 연구하기 위해 이용 될 수있다. 사용과 간단한 분석의 용이성이 중요한 회전 속성과 다른 성장 인자 또는 억제제와 AB 차단 또는 활성화 롤링 응답 분자 마커의 잠재적 인 참여를 탐색하는 데 사용할 수에 대한 정확한 분석을 허용합니다. 이 줄기 세포 기반 치료 34-36을 개선하기 위해 설계 될 수있다 줄기 세포 압연 및 원점 복귀를, 공부를 향한 구체적으로 유용 할 수 있습니다. 중요한 것은, 여러 조건으로는 플레이트 디자인으로 인해 롤링 속성의 신속하고 효율적인 연구를 허용, 개선 된 처리량 (PPFCs 대 ~ 10 배 이상)를 테스트 할 수 있습니다. 이러한 세포 부착, 화성과 윤회와 같은 세포 호밍에 대한 기타 관련 분석은 또한이 시스템 1,10,13을 사용하여 연구 할 수있다. 전반적으로,이 마이크로 유체 시스템은 세포 압연의 공부를 할 수있는 강력한 기술로 나온다해야할 것 외인성 세포 기반 치료의 임상 번역에 도움이되는 유용한 도구 역할을합니다.

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Disclosures

저자는 이익의 갈등을 선언하지 않습니다.

Acknowledgments

CHO-P 세포 박사 바바라 Furie (베스 이스라엘 디코 니스 메디컬 센터, 하버드 의과 대학)에서 일종의 선물이었다. 이 작품은 JMK에이 작품은 또한 JMK에 Movember - 전립선 암 재단 챌린지 상에 의해 부분적으로 지원되었다 건강 보조금 HL095722의 국립 연구소에 의해 지원되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells ATCC CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156
EBM-2 Media Lonza CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements Lonza CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots Lonza CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x Gibco 12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) Gibco 11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S) Gibco 15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM Gibco 25030
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals Sa550
Petri Dishes BD Falcon BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) MedSupply Partners TC1500
T75 Flasks BD Falcon 353136
Gelatin Solution (2%) Sigma G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E R&D Systems BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA21
Anti-hP-Selectin R&D Systems BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control BD Bioscience 555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 Santa Cruz SC70545
FITC Conjugated Santa Cruz SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control Santa Cruz SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 BD Pharmingen 556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control BD Pharmingen 550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4) Santa Cruz SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 Millipore MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control Santa Cruz SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha PeproTech 300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry Invitrogen C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma Invitrogen 33016-015
Equipment
Bioflux 1000 Fluxion Biosciences Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Bioscience CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera Photometrics

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