の体系的な分析
1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 1,2,3,4,5, 6, 1,2,3,4,5

Bioengineering

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Summary

この研究は、有意に生理学的に関連するせん断流の下で細胞ローリング研究のスループットを向上させる、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムを用いる。カスケードおよび患者における細胞の外因集団の全身送達後の細胞のホーミングの重要性をホーミング多段階の細胞における細胞ローリングの重要性を考えると、このシステムは、細胞ベースの治療を改善するためのスクリーニングプラットフォームとしての可能性を提供しています。

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Levy, O., Anandakumaran, P., Ngai, J., Karnik, R., Karp, J. M. Systematic Analysis of In Vitro Cell Rolling Using a Multi-well Plate Microfluidic System. J. Vis. Exp. (80), e50866, doi:10.3791/50866 (2013).

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Abstract

細胞ベースの治療のための主要な課題は、全身静脈内または動脈内注入後、目的の組織への高い効率での生存細胞を大量に標的とすることができないことである。従って、細胞ホーミングを増大は、現在細胞治療を改善するための戦略として検討されている。血管内皮上の細胞ローリングは、細胞ホーミングの過程における重要なステップであり、平行平板流動チャンバ(PPFC)を用いてインビトロで調べることができる。しかしながら、これは、コントロール不良のフロー条件で、非常に退屈な、低スループットアッセイである。代わりに、我々は正確に制御され、生理学的に関連するせん断流1,2の下で、より高いスループットで携帯圧延性質の研究が可能になり、マルチウェルプレートのマイクロ流体システムを使用していました。本論文では、HL-60の転がり特性(人間の前骨髄球性白血病)、P-およびE-セレクチンでコーティングされた表面上での細胞だけでなく、細胞の単層でコーティングされた表面にはreadilする方法を示しYは、検討した。良好な炎症状態をシミュレートするために、マイクロ流体チャネルの表面は、次いで、有意に動的条件下でのHL-60細胞との相互作用を増大させる、腫瘍壊死因子-α(TNF-α)で活性化した内皮細胞(EC)でコーティングした。強化されたスループットと、このような速度を圧延パス圧延などのパラメータの迅速な分析を可能にする統合されたマルチパラメータ解析ソフトウェアプラットフォームは、 インビトロの細胞ローリングの特性を評価するための重要な利点である。細胞ローリングおよびホーミングに影響を与えるように設計された工学的アプローチの迅速かつ正確な分析を可能にし、このプラットフォームは、あらかじめ、外因性細胞ベースの治療を助けるかもしれない。

Introduction

細胞ベースの治療の成功臨床翻訳の主要な課題の一つは、非効率的な配信や希望のサイト3,4に全身注入された細胞の標的である。従って、細胞ホーミングを改善するためのアプローチのための一定の探索があり、具体的には細胞療法を改善するための戦略として、ローリング細胞。血管に細胞ローリングは、古典的に疾患部位5に補充される白血球のために定義され、細胞のホーミングカスケードにおける重要なステップである。このステップは、すなわち 、内皮セレクチン間の特異的相互作用によって支配されるP-およびE-セレクチン(P-およびE-SEL)、及びそれらのカウンターリガンド白血球5,6の表面に。理解と細胞のホーミング、具体的には、圧延工程の効率改善は、細胞ベースの治療を改善するための新しいプラットフォームのための探求で非常に重要である。今日まで、この2つの平らなプラットフォームを含む、パラレルプレートフローチャンバー(PPFCs)を使用することによって達成されている細胞懸濁液をシリンジポンプ7,8、9を用いて灌流されたプレートを介して上部に位置する流入および流出ポートと、それらの間にガスケットを有するエス。底板の表面は、関連する細胞単層/基材で被覆することができ、せん断流下灌流細胞と表面との間の相互作用は、その後7を検討ている。しかし、PPFCは気泡形成、漏洩、および主要な欠点​​を提示するコントロール不良の流れと、低スループット、試薬がかかり、かなり面倒な方法です。

従来のPPFCの代替技術は、低消費1,10試薬と細胞アッセイ(PPFCsより最大10倍高い)正確な、コンピュータ制御されたせん断流の下で、より高いスループット性能を可能にする、マルチウェルプレート、マイクロ流体システムである。細胞ローリング実験は、マイクロ流体チャネル内で実行されている細胞単層または操作された基材で被覆することが可能とUSIをイメージngのローリング特性を有する顕微鏡は、容易に適切なソフトウェアを用いて分析した。本研究では、異なる表面上のヒト前骨髄球性白血病(HL-60)細胞のローリングの特性を研究することによって、このマルチウェルプレート、マイクロ流体システムの能力を実証する。 HL-60 P-およびE-selの様基板上の、ならびに異なるローリング受容体を発現する細胞単層上を転動を分析した。また、ブロッキング抗体(Ab)は、それらの表面上のHL-60の回転運動を媒介する特定のセレクチンの直接的な関与を実証した。ローリング実験は、圧延速度、ローリング細胞の数、および圧延パス特性などの主要圧延パラメータの効率的な解析を可能にする、最小限の試薬/細胞消費で、安定したせん断流の下で、増大したスループットを用いて行った。

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Protocol

1。細胞培養

  1. ヒト前骨髄球性白血病(HL-60)細胞
    1. 75センチメートル培養HL-60細胞を20%(v / v)ウシ胎児血清(FBS)、1%(v / v)のL-グルタミンおよび1を補充したイスコフ改変ダルベッコ培地(IMDM)、15 mlの2フラスコ%(v / v)のペニシリン - ストレプトマイシン。
    2. 細胞懸濁液体積の半分を吸引し、完全IMDM培地に置き換えて3日毎に培地を変更します。
    3. カルボキシフルオレセインジアセテートは、スクシンイミジルエステル(CFSE)染色、遠心HL-60細胞懸濁液(400×gで、5分間)、(予め温めたPBSで調製)1μMCFSE溶液中で再懸濁し、37℃で15分間インキュベートするその後、30分間、新鮮な温めておいた培地中の遠心分離機細胞、吸引上清と細胞を再懸濁。 PBS中で細胞を洗浄した後、(P-SELでコーティングされた表面にCFSE染色したHL-60細胞の代表的な画像については、図1(b)参照 )、圧延実験に使用しています。

  1. 肺微小血管内皮細胞(LMVECs)
    1. コー​​ト100ミリメートルのペトリ皿を0.1%ゼラチン溶液(PBS中のv / v)を有する少なくとも30分間37℃でインキュベートする。
    2. 特定の成長サプリメントキットを補充した完全内皮増殖培地中のゼラチンコート100ミリメートルペトリ皿(内皮基本培地-2(EBM-2))が、試薬を参照してください上の文化LMVECs)。メディアの80〜90%のコンフルエンスに達したとき、一日おきにサブ培養細胞を変更します。
    3. 継代培養のために、PBSで細胞を洗浄した後、細胞を1×デタッチトリプシン-EDTA 4mlで3分間、37℃で、完全EBM-2培地の等量を中和。 15mlチューブとcentrifugに細胞懸濁液を転送する電子メール(400×gで、5分間)。遠心分離後、完全な内皮培地1ml中にペレットを再懸濁し、血球計算板を用いて細胞を数える。これはすべての実験のための通路7でのみ細胞、それらの形態や機能、使用に影響を与えるように、オーバー継代細胞をしないでください。
  1. チャイニーズハムスター卵巣-P-セレクチン(P-CHO)細胞
    1. 安定的にヒトP-SELを発現するようにトランスフェクトしたCHO細胞であるCHO-P細胞は、共同研究者(ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部)11,12によって提供された。
    2. T175のCMにおける培養したCHO-P細胞のF-12培地25ml中2のフラスコ。
    3. 継代のために、4〜5秒間10mlのPBSで細胞を洗浄した後、完全なメディアで中和し、37℃で3分間1Xトリプシン-EDTA 10mlにトリプシン処理。
    4. 細胞懸濁液を遠心分離(400×gで、5分間)、注意深く上清を吸引完全培地1ml中に細胞ペレットを再懸濁して細胞を数える血球計数器。

2。統合されたマルチウェルプレートのマイクロ流体システムの動作

  1. すべての機器が正しく接続されていることを確認し、異なるモジュールをオンにする:コンピュータ、コントローラ、倒立顕微鏡、CCDカメラ。
  2. イメージングソフトウェアを開き、マルチウェルプレートモジュール及び撮像モジュールが正しく画面に表示されていることを確認してください。
  3. (コントローラに接続されている)、蒸気トラップにチューブを接続し、また、圧力のインターフェイスに接続します。
  4. プレートヒーター/アダプタでマルチウェルプレートを置きます。ウェルに試薬を追加します(後述)、プレートの上にインターフェイスを接続します。自動化されたステージ上で画像化のためにプレートを置きます。
  5. インタフェースは、プレートの上面に取り付けられ、定義された流速でマイクロ流体チャネルを通して流体を駆動する、ウェルの上部に、コントローラからの空気圧を印加し、容易にマルチウェルプレートを使用して制御マニュアルモードでモジュール画面。
  6. 井戸の間に位置し、観察領域、全体のチャネルフローの試薬。マイクロ流体チャネル寸法は70μmで高さ350μm幅Xです。線形チャネルの長さは1mmであり、チャネルの底部は、明視野、位相、蛍光および共焦点顕微鏡と互換性のある180μmのカバースリップガラスを含む。
  7. CCDカメラ(ストリーム取得、11フレーム/秒)を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用して分析します。

3。タンパク質基質や細胞単層を持つマイクロ流体チャネルのコーティング

  1. フィブロネクチンまたはP-/E-selectinとマイクロ流体チャネルをコーティング
    1. PBS中20μg/ mlのフィブロネクチン溶液1mlを準備します。コー​​ティングされるチャンネル数(チャネルあたりフィブロネクチンの25〜50μlを使用する)に基づいてボリュームを変更します。
    2. 各ウェル入口にフィブロネクチン溶液を25〜50μlを加える。 2 DYN / cm 2のせん断力を加え、5分のチャネルを灌流するため。液体がよく口に登場するのビードに注意してください。室温で30〜45分間インキュベート
    3. 1,13(チャネルを供給する中央のサークルから直接吸引していない)をウェルから溶液を吸引除去する。コンセントウェルにPBSを200〜500μLを加え、5分間2ダイン/ cm 2のせん断流を適用することにより、PBSでチャンネルを洗う。チャネルが正しくフィブロネクチンおよび使用可能な状態で被覆される。
    4. 表面コーティングを可能にするために、37℃で1時間インキュベーションして、上記のようにP-またはE-selの、PBS中で所望のヒト組換えタンパク質を5μg/ mlの溶液を調製し、コートチャンネルをコートする。
  2. マイクロ流体チャネルの内部CHO-PまたはLMVEC単層の作成
    1. 穏やかに完全培地および遠心分離機の2倍容量(400×gで5分間)を用いてクエンチし、3分間培養皿から細胞をトリプシン処理。フルメディアや遠心分離機の10ミリリットル(400×gで5分)で細胞を再懸濁agaiN。
    2. 懸濁液中の細胞濃度を決定するために、細胞を計数。チャネル内部のLMVECコンフルエントな単層の形成を確実にするために15〜20万細胞/ mlに細胞濃度をもたらす。コンフルエントCHO-P細胞単層の場合は、50から60000000個/ mlを使用しています。各チャンネルごとに細胞懸濁液の25〜50μlを使用する - それに応じて実験に用いた最初の細胞数を決定する。
    3. よく入口に適当な濃度での細胞懸濁液の25〜50を添加する。顕微鏡ステージ上でプレートを置き、細胞が全体のチャンネルを埋め、画面上で観察されるまで、チャネル(2 DYN / cm 2)の中に細胞を導入してから、流れを止める。
    4. フルLMVECまたはCHO培地のどちらか200μlの出口及び入口の両方を記入してください。細胞が沈降しましょうし、インキュベーター(37℃、5%CO 2)で3時間付着する。
    5. 3時間のインキュベーション後、付着していない削除する完全なメディア(2 DYN / cm 2で、10〜15分)でチャンネルを洗う細胞。細胞は完全にコンフルエント表示され、チャネルが使用できるようになりました。初期細胞播種密度に依存して、整定時間の追加の2〜3時間、細胞と表面の完全な被覆を確実にするために必要とされてもよい。

4。 LMVECは、炎症誘発性活性化とP-/E-selectinの抗体ブロッキング

  1. LMVEC基礎培地中のTNF-α溶液(10 ng / mlの)を準備します。
  2. チャンネル内LMVECの炎症活性化を誘導よく入口に、TNF-α溶液100μlを加え、5分間2 DYN / cm 2のせん断流を適用することにより、チャネル内にソリューションを導入することができる。制御チャネル(非活性ECS)の場合は、よく入口にLMVEC基礎培地を100μlを加え、チャンネル(5分間2 DYN / cm 2)の中に導入する。チャネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。
  3. P-SELとLMVECs及びCHO-P細胞に対するE-SELをブロックするには、P-SEL(クローンAK4、BAにおける5μg/ mlの中和紹介SALメディア)またはE-SEL(クローンP2H3、基礎培地中の5μg/ ml)をチャネルに抗体および37℃で1時間インキュベート次に、(5分間2ダイン/ cm 2)を基本培地でチャンネルを洗う。チャンネルは現在、ローリングアッセイの準備ができている。

5。基板/細胞単層被覆マイクロ流体チャネル上で、HL-60ローリングアッセイ

  1. 注意深く(細胞によるコーティングの場合には、完全にコンフルエントな細胞単層が観察されるべきである)チャネルが適切に被覆されていることを確認するために顕微鏡下でのチャネルを調べる。
  2. ローリング実験は、遠心機HL-60細胞懸濁液(400×gで5分)HL-60細胞懸濁液を調製し、基本培地で一回洗浄する。 IMDM中の細胞を再懸濁をカウント(基本培地のCa 2 +およびMg 2 +を含有する)3万細胞/ mlのHL-60細胞懸濁液を作成する。ローリングアッセイを行うために、チャネルごとに細胞懸濁液を25〜50μlを使用する。
  3. セルsuspeの25〜50μlを添加nsionは、顕微鏡ステージ上に温度制御されたプレートホルダ(37°C)と場所の内部で、ウェル場所プレート出口する。次に、(細胞が入口にコンセントから流れる10月15日秒以内に観察されるべきである)2 DYN / cm 2のせん断力を加えることにより、チャネルに細胞を導入する。
  4. せん断応力の関数としてローリング応答を調べるために、(5 DYNまで0.25から徐々に剪断力を高めるDYN / cm 2で0.25に剪断力を減少させ、各々の所望の剪断(「ストリーム取得」機能を使用して)、20〜30秒のビデオを取得する/ cm 2あることがより高い剪断を使用することも可能である)。
  5. CCDカメラ(ストリーム取得、11フレーム/秒)を使用してビデオを取得し、互換性のあるソフトウェアを使用してパスをロール圧延速度を分析する。

6。表面分子の発現を検出するために、フローサイトメトリー

  1. トリプシン処理後、所望の細胞型(HL-60、CHO-(1-2×10 5細胞/サンプルを使用して)細胞懸濁液を調製PBS中のP又はLMVECs)( - / - )、2%のFBSを補充した。細胞を2回洗浄し、50μL(同じバッファを使用)にサンプル量を持って来る。
  2. 20分間、4℃で所望の蛍光団結合抗体(詳細については、添付の表を参照)(アルミホイルでカバー)で各サンプルをインキュベートする。
  3. 細胞を2回洗浄する(同一緩衝液)200μlに染色された細胞懸濁液の最終体積をもたらす。表面分子の発現を検出するためにフローサイトメーターを用いてサンプルを分析する。

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Representative Results

HL-60細胞は、フィブロネクチン上でP-およびE-セレクチンの表面上にロールではなく、

彼らはローリングリガンド、P-SEL糖タンパク質リガンド-1(PSGL-1)およびシアリル-ルイスX(のSLeX)を含むホーミングリガンドの様々 5,14( 図1(a)を表現するように、HL-60細胞は、ゴールドスタンダード"ローラー"と考えられている)。との特異的な相互作用を媒介する四糖類のSLeXための足場として表面タンパク質、PSGL-1の行為、P-及びE-SEL、炎症5,6,15時の内皮上にアップレギュレートされている。マルチウェルプレート、マイクロ流体システムの能力を試験するために、多数のマイクロ流体チャネルは、それらの表面を分析し、異なる基質及びHL-60細胞のローリング相互作用を同時にコーティングした。 HL-60細胞は、別個の回転運動に続いて第一流から捕捉された細胞を用いて、P-selのコーティングされた表面に強固なロール挙動を示した。 図1Cに示すように、とから構成され文献とENT、HL-60細胞は、フィブロネクチン被覆基質14,16-19上のE-SELの表面に同様のロール挙動を示すが、まだいない。互換性のあるソフトウェアを介して分析した細胞速度は、、/秒1から12ミクロンの間の平均速度で、P-およびE-SEL上の細胞の頑強なローリング応答を示す、せん断応力に対してプロットした。

HL-60細胞は、微小流体チャネルを被覆するCHO-P単層上を転動

次に、我々は、効率的に目的の細胞および表面を被覆する単層細胞間の相互作用をテストするには、このマイクロ流体システムを使用することの実現可能性を評価することを目的とした。ローリングマーカーを発現する細胞の単層で、HL-60細胞の相互作用を調べるために、我々は安定的に発現するようにトランスされたCHO-P細胞、使用されるPは、ではなく、E-、SEL( 図2(a)はまた、代表については、図2(b)参照マイクロ流体チャネル)11,12を被覆するCHO-P単層上HL-60細胞の画像。 HL-60細胞は、CHO-P細胞( 図2C)に強いローリング応答を示した。この回転運動が実際にP-SELによって媒介されるかどうかをテストするには、CHO-P単層をチャネルに先立って、HL-60細胞の灌流に、P-またはE-SELいずれかに対する抗体をブロックすることでプレインキュベートした。 図2Cに示すように、P-selのAbを用いてCHO-P単層を遮断するP-selのが実際に前述のようにHL-60は圧延媒介することを実証し、表面上のHL-60細胞ローリング数の有意な減少をもたらした14,18。マイクロ流体チャネル内のアッセイを実行する25μlのできるだけ少ないだけ小さな体積を用いることにより、異なる条件および受容体の効率的な遮断の迅速なスクリーニングを可能にする。 (CHO-P細胞に発現していない)、E-SELをブロックするアイソタイプコントロールまたはAbを正確にピンポイントする特定surfacの直接的な関与は、このアッセイの強さを実証し、CHO-P細胞に対するローリングする細胞の数に影響を及ぼさなかった携帯ローリング相互作用の電子マーカー。

TNF-活性化LMVECs上のHL-60細胞のローリングを、E-セレクチンにより媒介される

内皮細胞は、炎症5,6の部位への白血球の動員を助ける、炎症の間に、例えば、P-およびE-selのようなアップレギュ接着表面マーカーに知られている。マウスのECは、インターロイキン-1(IL-1)および腫瘍壊死因子-α(TNF-α)のような炎症性刺激に応答して、P-およびE-selの両方を発現しながら、しかし、人間のECはこれらのみに応答してE-SELを発現サイトカイン20,21。これは、E-SELの発現を示す、サイトメトリーアッセイたちの流れの中で検証されたが、ありませんでした、P-SEL、TNF-αの刺激( 図3A)に応じて、肺の微小血管内皮細胞(LMVEC)に。マルチウェルマイクロ流体プレートは、複数の異なる条件の高スループット·テストを可能にし、多数の独立したマイクロ流体チャネルで構成されています。我々は、この有利な設計を使用急速に複数の条件の下でのECとのHL-60細胞の相互作用を分析するためのマイクロ流体チャネル( 図3B)の内部LMVECsプレートする。炎症の設定をシミュレートするために、LMVECsは炎症性サイトカインTNF-αで前処理した。興味深いことに、HL-60細胞は、未活性化LMVECsと相互作用しなかった、細胞を、この表面上で転がることが観察されていませんでした。逆に、HL-60細胞は、5〜15μmの/秒の平均速度( 図3C)で、TNF-α活性化LMVECsに強いロール挙動を示した。

次に、HL-60細胞および活性化LMVECs間の転がり相互作用のP-SELまたはE-SELの関与を調査することを目的とした。このために、TNF-α活性化されたECは、P-selの又はE-selの遮断抗体とプレインキュベートし、HL-60細胞のローリングを分析した。 図4Aに示されるように、アップレギュTNF-α活性化さLMVECsオンで ​​あったE-selのを、阻止、significを生じ活性化内皮単層上ローリング細胞数の蟻の減少。これとは対照的に、活性化したEC上に発現していなかった、P-SEL、反対アイソタイプコントロールまたは抗体を使用して、HL-60活性化内皮層の上に転がりに大きな影響を持っていませんでした。このデータは、以前の報告20,21と一致して、TNF-α活性化のEC上でローリングHL-60中のE-SELの直接の関与を示しています。取得した映像から、解析ソフトウェアは、基板と相互作用する個々の細胞の経路を追跡できるようにするものである。オラクル社は、E-SELブロックWO /ワット、TNF-α活性化のECと相互作用し、個々の細胞のパスを追跡するために、この機能を使用していました。 図4Bに示すように、非ブロック活性化LMVECs上のローリング細胞の数は、E-selのブロックされた活性化のEC上でよりも有意に高かった。さらに、それは、非ブロックLMVECs上のHL-60のローリング運動が連続的で堅牢であるように見え、一方細胞の圧延パスE-SEL-ブロックされたECに(各色が異なる細胞を表し、 図4(b)のGL対AF例えば、セルを参照されたい)断片化した。この知見と一貫性では、ブロックされていない、TNF-α活性化のEC上で、HL-60細胞のローリング速度は、E-SEL-ブロックされたEC( 図4C)上での圧延速度よりも有意に低かった。

図1
図1。 HL-60細胞は、P-およびE-セレクチンでコーティングされた表面上を転がる。 (A)HL-60細胞は、エクスプレスローリングリガンドPSGL-1とのSLeX(ISOのCTR -アイソタイプコントロール、無抗体-抗体なし)。(B)P-SELにCFSE染色したHL-60細胞の代表的なスナップショットイメージ流下で表面をコーティングした。(C)HL-60細胞は強固に、P-およびE-SELでコーティングされた表面上ではなく、フィブロネクチン被覆表面上を転がる。ローリング速度はせん断応力(N = 10月1日に対してプロットされているデータポイントごとに5細胞は、速度が)対応ソフトウェアで分析した。 大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図2
図2。 CHO-P細胞単層上を転動HL-60を、直接P-selのにより媒介される。 (A)CHO-P細胞はE-selのP-selのを表現ではなく、(B)マイクロ流体チャネル(10×倍率)の表面を被覆CHO-P単層上HL-60細胞の代表的画像。(C)HL *; CHO-P単層を、アイソタイプ対照とインキュベートし、抗体アイソタイプCTR-CHO-P単層とインキュベートしていなかった - Abはブロック解除(アッセイをブロックすることにより実証されたように、CHO-P単層上を転動-60細胞を直接、P-SELによって媒介されるはp <0.05、一元配置ANOVAはTukeyのHSDポストホック検定で使用された、エラーバーが表すSEM、n = 3である。

図3
図3。 HL-60細胞は、TNF-α活性化LMVECs上を転がる。 (A)LMVECsのTNF-α活性化は、E-selの表面発現を誘導ではなく、P-selの(B)2のマイクロ流体チャネル(4×倍率)でコンフルエントLMVEC単層の代表的な像。(C)HL-60細胞を、示すことTNF-α活性化LMVECs上の堅牢なローリング応答ではなく、不活性化LMVECs上。 ISOのCTR -アイソタイプコントロール、unactのEC -活性化されていない内皮細胞、TNF-α行為のEC - TNF-α活性化内皮細胞大きな画像を見るにはここをクリックしてください

図4 < BR /> 図4。 TNF-α活性化LMVECsは、E-セレクチンによって媒介される上で、HL-60は、ローリング(A)、HL-60、TNF-α活性化LMVECs上を転がるのAbブロックすることによって実証されたように、むしろ、P-SELよりも、E-SELによって媒介されるアッセイ(アイソタイプ対照と共にインキュベートアイソタイプCTR-EC単層を、*はp <0.05、ANOVAはチューキーHSDポストホック検定で用いたワンウェイ、エラーバーはSEMを表し、n = 3)は(B)細胞経路解析は、連続明らかにする。そしてブロックされていないアクティブ化のEC上で、HL-60細胞の頑強なローリングは、E-SEL-ブロックされ、活性化のEC上で観測断片化された、弱いローリングと比較(すべての色が異なるセルを表します。分析は、適切なソフトウェアを介して行われた)。(C)HL-60ローリングTNF-α活性化のEC上での速度は、E-SEL-ブロックされて活性化したEC(使用せん断応力に比べてブロックされていない活性化したECに遅くなります。2 DYN / cm 2と * P <0.05、対応のない両側t検定、エラーバーを表すSEM、N =グループあたり17-36細胞)。www.jove.com/files/ftp_upload/50866/50866fig4large.jpg "ターゲット=" _blank ">大きな画像を見るにはここをクリックしてください。

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Discussion

外因性の細胞ベースの治療の成功翻訳の主要な課題の一つは、効率的に、高い生着効率3で ​​傷害や炎症部位 ​​に細胞を送達することができないことである。細胞ローリングは、最終的に組織5への内皮を通して、強固な接着および遊出を導く血管壁上のセルの減速を促進する、細胞のホーミングの過程における重要なステップを表している。候補セルタイプの圧延プロセスのより良い理解は、細胞のホーミングを増強し、細胞ベースの治療を改善するに向かって有意に貢献する技術の開発につながる可能性がある。

PPFCは、せん断流動下で細胞ローリングだけでなく、他の細胞の挙動を探るに広く使用されるツールです。内皮上の好中球の接着を調べるためのPPFCの適用は、第ローレンスによって研究された。1987年、次いで市販の生産以来TSは8,9を開発されている。 PPFCsは、チャンバー7の大きさを制御したガスケットで区切られた2枚の平板で構成されています。上部プレートは、シリンジポンプの使用を介してチャンバ7,8を介して細胞懸濁液の灌流を可能にし、流入および流出口を含んでいる。一緒に7を押したプレートを維持するための負圧(真空)を適用する追加のポートもあります。パラレルプレートフローチャンバーを効果的にせん断流条件下で細胞ローリングを含む細胞応答を、調査するために使用されてきたが、その有効性を低下させる多くの制限が存在する。フローチャンバーの主な制限は、流動システム7内の大きなデッドボリュームに必要とされる細胞および試薬の大量の数が多いです。別の重要な問題は簡単に潜在的に細胞単層および基板を妨げる、フローチャンバアセンブリの間に生じ得る気泡の存在である底板22上に塗布する。しかしながら、さらなる改変が空気の除去23気泡を容易にするために気泡トラップとして作用する上部プレート上の追加のポートを組み込むために従来のPPCFsになされている。 PPFC実験をセットアップすることも面倒であり、ガスケットが破損していたり​​、慎重に組み立てられていない場合は、フローセルは、漏れの影響を受けやすい。最後に、均一な流量の狭い範囲になる所望の、実験的に印加される剪断速度との差がある。理論的には入口と出口の位置を変えることを有する4つのPPFCsを比較することにより、その構成の二つの75%まで24により算出剪断速度からずれ剪断速度をモデル化していることがわかった。同じチャンバーを再利用するには時間がかかるの洗浄工程を必要とし、上記の課題に合わせて、これはPPFCsはかなり退屈で低スループットになります。

我々の研究では、完全に統合されたマルチウェルpを用い正確に制御せん断流1,2,13に頼る後半のマイクロ流体システム。この48ウェルマイクロ流体プレートは、マイクロ流体チャネル1,25に接続された隣接するウェルの各ペアで、24マイクロ流体チャネルを含む。 10-12ローリングアッセイは、1日で数十条件の迅速なスクリーニングを可能にする、1時間で行うことができる。マイクロ流体チャネルは、容易にタンパク質基質又は細胞単層で被覆することができ、目的と表面の細胞間の相互作用は、CCDカメラにより取得された顕微鏡を用いて画像化し、対応するソフトウェアによって分析することができる。このような細胞の定量化、圧延速度を計算し、特定のトラックパス分析などの重要なパラメータは、容易に効率的に複数の基板13上にローリング挙動を分析するために得ることができる。本研究では、HL-60前骨髄球性白血病細胞株を使用して、細胞ローリングを研究する中で、このシステムの効率を評価したキーを発現する、十分に確立された "ローラ"一緒に、P-およびE-SEL 15,26のためのカウンターパートリガンドとして作用などのPSGL-1とのSLeX転リガンド、。これまでの報告との相関では、HL60細胞は確かに1から12ミクロン/秒14,17-19の遅い圧延速度で、P-およびE-SELでコーティングされたマイクロ流体チャネル上で堅牢なロール挙動を示した。 HL-60細胞は、未分化HL-60細胞は、フィブロネクチン16と接着性相互作用を示さないことを示す以前の報告と一致して、フィブロネクチン表面上を転がるませんでした。 PPFCsを用いて試験することができるだけ1-2アッセイ/時と比較して10-12アッセイ/時間まで可能マルチウェルプレート、マイクロ流体システムの設計は、かなりの少なくとも5倍のスループットを増加させる。また、PPFCsはさらにパフォーマンス速度を遅くし、各再使用する前に再組み立てし、洗浄する必要がある。また、簡単に制御された流れは、その後すぐに、適切なソフトウェアを使用して解析することができ、剪断依存実験の迅速なパフォーマンスを可能にします。

2A)11,12 使用した。 HL-60細胞は、効率的に細胞単層の完全性を危うくすることがあり、気泡の形成を防止する設計所与のせん断流の下で細胞間相互作用を探索するために、このシステムを使用する能力を実証し、CHO-P細胞上有意なローリング応答を示し、これPPFCs 22,23を使用する場合によく発生します。私たちは、その後、圧延工程におけるそれらの潜在的関与を探索するために、P-またはE-SEL抗体を用いて、CHO-P細胞をブロックした。かなりのブロッキングP-SELは、以前の報告14,18,20と一致したHL-60ローリングを媒介するP-SELの直接的な関与を示す、CHO-P単層上を転動する細胞の数を減少させた。E-selのAbおよびアイソタイプ対照は、Abブロッキングが効率的に細胞 - 細胞相互作用を媒介する特異的マーカーを検出するために、このマイクロ流体システムで使用することができることを実証し、CHO-P上のHL-60上のローリングに影響を及ぼさなかった。重要なのは、各チャネルは、試薬がかかりPPFCとその典型的な大デッドボリューム7とは異なり、25〜50μL、わずかように、このアッセイのための高価なABSまたは細胞懸濁液の最小限の量を必要とします。

我々は次に、HL-60細胞間の相互作用を分析し、電気部品がマイクロ流体チャネルを塗布して、このマルチウェルプレートシステムをテストした。電気部品を表現するために、P-及びE-SELの炎症過程5の間に知られている。炎症性刺激と電気部品を提供するために、我々は、TNF-αでそれらを前処理し。 E-SELがアップレギュレートされたが、P-SELは、人間のECは、P-SEL E-SELを表現ではなく、TNF-αの活性化に応答して、霊長類のP-SELプロモーターは、TNFを欠いているので、ことを示す文献と一貫していなかった-α応答エレメント、RESU20,21 E-SELのみの転写誘導にlting。炎症状態は、その後、EC表面との相互作用を探索するHL-60細胞の灌流、続いて、TNF-αとEC単層をインキュベートすることにより流路内シミュレートした。 HL-60は活性化されていない電気部品と相互作用しなかったが、彼 ​​らは文学22での報告された応答と相関し、TNF-α活性化のEC( 図3C)、上の堅牢なローリング応答が表示されました。抗体ブロッキング実験( 図4A)を、E-selのではなく、P-selのは、HL-60は活性化のEC上を転動の有意な減少をもたらしたブロッキングすることを示した。これらのデータは、E-SELの直接的な関与を証明し、TNF-αの活性化ヒトECの20,21上のHL-60のローリングを媒介するしないのP-SEL、。 Abは、逆に、P-SEL媒介は、CHO-Pにローリング対アクティブ化のEC上で、E-SEL媒介ローリングを示す、ブロッキング実験、さらに抗体のブロックBLOCKiの実現可能性と妥当性を検証ngの実験では、急速にこのマイクロ流体システムで行わ。興味深いことに、圧延、この阻害は、VCAM-1などの他の表面受容体は、また、活性化のEC 27を転動HL-60に関与することを示唆している(約70%減)完全ではなかった。トラックパス解析は、さらに別の興味深い現象を明らかにした - ブロックされていないアクティブ化のEC上で、HL-60のローリングが連続して堅調に推移しましたが、まだE-SELに巻かれた細胞の数が少ないのECがブロックのEC(上の断片ローリングパスを表示しアクティブにブロックされた図4B)。この現象は、P-selの阻止またはアイソタイプコントロール(データは示さず)と共にインキュベートしたECでは観察されなかった。このことは、EC、E-SELがブロックされたときに転がり応答は、他のマーカーを介して可能であるが、このローリングがアクティブのEC 5,22のみ緩い、部分的なローリング応答をサポートし、弱い部分HL-60-ECの相互作用に依存していることを示唆している,27-29。これは、 図4(c)に示すデータにより支持されている30〜33を示し、ここで提示されたマルチウェルプレートシステムを介して、マイクロフルイディクスのスループットを向上させる、さらなるハイライトされた。

本研究では、HL-60細胞を用いて、生理学的に関連して正確に制御された剪断流下でタンパク質基質および細胞単層上の転がりの調査に焦点を当てたマルチウェルプレートのマイクロ流体システム。同様に、他の細胞型および他の基質/細胞単層を、容易にそれらのローリング特性を研究するために使用することができる。使用および単純な分析の容易さは重要なローリング特性の正確な分析を可能にし、異なる成長因子または阻害剤とのAb遮断または活性化は、ローリング応答における分子マーカーの潜在的な関与を探索するために使用することができる。これは、幹細胞ベースの治療34-36を改善するように操作することができる幹細胞のローリングおよびホーミングを研究に向かって特に有用であり得る。重要なのは、複数の条件は、プレート設計による転がり特性の迅速かつ効率的な研究を可能にする、改良されたスループット(PPFCs対5〜10倍以上)でテストすることができます。例えば、細胞接着、走化性および遊出などの細胞ホーミングに関連する他のアッセイもまた、このシステム1,10,13を用いて研究することができる。全体的に、このマイクロ流体システムは、細胞のローリングとsを研究するための強力な手法として現れるhould外因性の細胞ベースの治療の臨床翻訳を支援するための有用なツールとして役立つ。

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Disclosures

著者らは、利害の競合を宣言していません。

Acknowledgments

CHO-P細胞は博士バーバラ·フューリー(ベスイスラエルメディカルセンター、ハーバード大学医学部)からの親切な贈り物だった。この作品は、この作品にもJMKにMovember - 前立腺がん財団チャレンジ賞によって部分的にサポートされていましたJMKに健康グラントHL095722の国立研究所によってサポートされていました

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Human Lung Microvascular Endothelial Cells Lonza CC-2527
P-selectin-expressing Chinese Hamster Ovary Cells (CHO-P) Kind gift by Dr. Barbara Furie11,12
HL-60 Cells ATCC CCL-240
Cell Culture Reagents
Endothelial Basal Medium Lonza CC-3156
EBM-2 Media Lonza CC-3156
Endothelial Basal Medium Supplements Lonza CC-4147
EGM-2 MV SingleQuots Lonza CC-4147
IMDM - Iscove's Modified Dulbecco's Medium 1x Gibco 12440
F-12 (1x) Nutrient Mixture (Ham) Gibco 11765-054
Penicillin Streptomycin (P/S) Gibco 15140
L-Glutamine (L/G) 200 mM Gibco 25030
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals Sa550
Petri Dishes BD Falcon BD-353003
100 mm Cell Culture Dish, Tissue-Culture Treated Polystyrene
Centrifuge Tubes (15 ml polypropylene conical tubes) MedSupply Partners TC1500
T75 Flasks BD Falcon 353136
Gelatin Solution (2%) Sigma G1393
dPBS (without calcium chloride and magnesium chloride) Sigma D8537
Trypsin-EDTA Solution (10x) Sigma T4174
Antibodies
Anti-hE-Selectin/CD62E R&D Systems BBA21
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA21
Anti-hP-Selectin R&D Systems BBA34
FITC Conjugated Mouse IgG1 R&D Systems BBA34
FITC Mouse IgG­1 κ Isotype Control BD Bioscience 555748
Anti-SLeX /CD15s Ab, Clone: 5F18 Santa Cruz SC70545
FITC Conjugated Santa Cruz SC70545
Normal Mouse IgM-FITC Isotype Control Santa Cruz SC2859
PE Mouse Anti-Human CD162, Clone: KPL-1 BD Pharmingen 556055
PE Mouse IgG1 k Isotype Control BD Pharmingen 550617
Anti-P-Selectin Ab (AK4) Santa Cruz SC19996
Anti-E-Selectin Ab, Clone P2H3 Millipore MAB2150
Mouse IgG1 Isotype Control Santa Cruz SC3877
Other Reagents
Recombinant Human TNF-alpha PeproTech 300-01A
Cell Trace CFSE Cell Proliferation Kit - For Flow Cytometry Invitrogen C34554
Human P-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 137-PS-050
Human E-selectin-FC recombinant protein R&D Systems 724-ES-100
Fibronectin Human, Plasma Invitrogen 33016-015
Equipment
Bioflux 1000 Fluxion Biosciences Bioflux Montage was the software used to run the experiments and analyze the data
BioFlux 48-well plates Fluxion Biosciences
BD Accuri C6 Flow Cytometer BD Bioscience CFlow Plus was the software used to run the experiments and analyze the data
Nikon Eclipse Ti-S Nikon
CoolSnap HQ2 CCD camera Photometrics

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References

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