Идентификация мышиный эритробласта субпопуляции обогащенный энуклеирующий События на нескольких спектральных изображений проточной цитометрии

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Настоящий протокол описывает новый метод выявления население энуклеирующий ортохроматических эритробласты по многоспектральным потока изображений цитометрии, обеспечивая визуализацию процесса энуклеации эритробластов.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konstantinidis, D. G., Pushkaran, S., Giger, K., Manganaris, S., Zheng, Y., Kalfa, T. A. Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (88), e50990, doi:10.3791/50990 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Эритропоэз у млекопитающих заключает с драматической процессе энуклеации, что приводит к ретикулоцитов образования. Механизм энуклеации до сих пор не выяснена. Общей проблемой столкнулись при изучении локализации ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластов с помощью микроскопии является трудность наблюдать достаточное количество клеток, подвергающихся энуклеации. Мы разработали протокол о романе анализа с использованием многопараметрическую высокоскоростной визуализации клеток в потоке (Multi-спектральных изображений проточной цитометрии), метод, который сочетает в себе Иммунофлуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии, с целью выявления эффективно значительное количество энуклеирующий событий, что позволяет получить измерения и выполнить статистический анализ.

Мы сначала опишем здесь два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для того, чтобы синхронизировать мышиных эритробласты и увеличить вероятность захвата энуклеации в гое время оценки. Затем мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии. Наряду с размером и DNA/Ter119 окрашивания, которые используются для идентификации ортохроматических эритробласты, мы используем параметры "Соотношение сторон" ячейки в канале светлого поля, что помогает в признании удлиненных клеток и "дельта центроидного XY Ter119/Draq5 "что позволяет идентифицировать клеточных событий в которой центр Ter119 окрашивания (зарождающейся ретикулоцитов) является далеко друг от друга от центра Draq5 окрашивания (ядро претерпевает экструзии), что указывает на ячейку собирается выяснять. Подмножество ортохроматической населения эритробластов с высокой дельта тяжести и малого удлинения настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки.

Introduction

Терминальной дифференцировки эритроидных в линии у млекопитающих заключает с резким процессе энуклеации, через который ортохроматический эритробласт вытесняет его мембрану в корпусе ядро (pyrenocyte) 1, генерируя ретикулоцитов 2. Точный механизм этого процесса, который также является ограничение скорости шаг успешным, масштабная, производство красных кровяных клеток в пробирке, еще не полностью выяснены. Локализация ключевых белков и сооружений в пределах энуклеирующий эритробластах основывается на использовании флуоресцентного и электронной микроскопии 3-5. Этот трудоемкий процесс обычно приводит к идентификации ограниченного числа энуклеации событий и не всегда позволяет значимого статистического анализа. Развивая метода идентификации эритробластов описанной ранее МакГрат и др.. 6, мы разработали новый подход к идентификации и изучения энуклеации события по многоспектральные ИмаПеренять проточной цитометрии (многопараметрических высокоскоростной визуализации клеток в потоке, метод, который сочетает в себе флуоресцентной микроскопии с проточной цитометрии) 7, которые могут обеспечить достаточное количество наблюдений, чтобы получить измерения и выполнить статистический анализ.

Здесь мы описываем первые два в пробирке эритропоэз культуры методами, используемые для синхронизации эритробласты и повысить вероятность захвата энуклеацию на момент оценки. Тогда мы подробно описать окрашивание эритробластах после фиксации и проницаемости для изучения локализации внутриклеточных белков или липидного плоты во время энуклеации по многоспектральная потока изображений цитометрии.

Образцы работать на потоке изображений цитометр и собранные клетки закрытого соответствующим определить ортохроматических эритробласты 6. Ортохроматический эритробластов затем анализируют на основе их пропорции, как измерено в светлое IMAПеренять, по сравнению с их значение для параметра дельта центроидного XY Ter119-ДНК, которая определяется как расстояние между центрами областей, окрашенных для Ter119 и ДНК соответственно. Популяция клеток с низким соотношением сторон и высокой дельта тяжести XY Ter119/DNA настоятельно обогащенный энуклеирующий клетки. Использование дикого типа (WT) эритробластов по сравнению с эритробластов Mx-Cre опосредованного условной делеции Rac1 на RAC2 - / - или комбинированной RAC2 - / -; Rac3 - / - генетический фон и этот анализ новый протокол из нескольких спектральных изображений потока цитометрии, недавно мы показали, что энуклеации напоминает асимметричную цитокинеза, и что формирование актомиозинового кольца регулируемого частично Rac GTPases важен для энуклеации прогрессии 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Долгосрочный Экстракорпоральное эритропоэза культуры (Экс естественных эритроидной дифференцировки Культура протокол по Giarratana др.. 8, модифицированы и адаптированы для мышиных клеток)

Это 3-ступенчатый долгосрочная экстракорпоральное протокола эритропоэза. На первом этапе (0-4 дней) 2 х 10 5 клеток / мл помещают в среду роста эритробластов с добавлением фактора стволовых клеток (SCF), интерлейкин-3 (IL-3) и эритропоэтин (ЕРО). На втором этапе (дни 5-6), клетки ресуспендировали в 2 х 10 5 клеток / мл и культивируют совместно на прилипающих клеток стромы (MS5) в свежей среде роста эритробластов, дополненной только с ЕРО. На третьем этапе (7-9 дней) клетки культивируют на слое MS-5 клеток в свежей среде роста эритробласт без цитокинов до энуклеации (рис. 1а).

Все протоколы животных были утверждены уходу и использованию животных комитета институционального (IACUC) побочныхБольница Медицинского центра Цинциннати Детская.

  1. Урожай костей и изоляции низкой плотности клеток костного мозга
    1. Добавить 2 мл стерильной среде IMDM, содержащей 2% фетальной бычьей сыворотки (FBS) в 15 мл коническую пробирку и хранить на льду.
    2. Усыпить на 2-6 месячного дикого типа C57/BL6 мышь (наряду с или без генетически-целевой мыши интереса) после учреждения утвержденных протоколом (например CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков).
    3. Изолировать тазовые кости, бедра и голени обеих ног с помощью щипцов и скальпель, добавьте их в пробирку, содержащую IMDM +2% FBS и держать на льду.
    4. Добавить 1 мл IMDM +2% FBS в стерильной проточной цитометрии трубки и флеш костей с помощью щипцов и туберкулиновые шприцы с 25-G х 5/8 "Игла. Флеш IMDM +2% FBS через кости несколько раз мягко ( путем аспирации ~ 500 мкл из клеточной суспензии и промывки его снова через кость), и собирать клетки костного мозга в проточной cytometrу трубки. Промывка будет завершена, когда кости появляются белые.
    5. Фильтр-клеток суспензии через клеточный фильтр набора 40 мкм на вершине 50 мл коническую пробирку. Промыть фильтр клеток с IMDM +2% FBS и с использованием тех же среда регулировать конечный объем клеточной суспензии в 5 мл.
    6. Подготовка низкой плотности клеток костного мозга (LDBM) по центрифугирования в градиенте плотности: тщательно наслаивать 5 мл клеточной суспензии на 5 мл разделения градиент плотности клеток среднего 1,083 г / мл в 15-мл пробирку и спина при 750 мкг в течение 25 мин при комнатной температуре (RT), без тормозов / низкая ускорения.
    7. Передача супернатант (все примерно до 2-мл отметки 15-мл пробирку для того, чтобы приобрести Баффи пальто) на новую 15-мл трубки и выполнять еще одну стирку с IMDM +2% FBS при 525 мкг в течение 5 мин при RT.
    8. Аспирируйте супернатант и любые оставшиеся лизировать красные кровяные клетки (RBC) суспендированием осадка в 3 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 5 мин при комнатной температуре. Если больше, чистота эритробластов являетсятребуется на конечной стадии (например, для биохимических исследований), очистить LDBM клетки дальше на этом этапе к Лин нег клеток путем магнитной сепарации.
  2. Экс естественных эритроидных дифференциация протокол культуры, начиная с LDBM или Лин нег клеток (рис. 1А)
    1. Добавить 7 мл IMDM +2% FBS, спина при 525 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре и ресуспендируйте осажденные клетки в 2 мл роста эритробласт среды (ВОСА), состоящий из:
      . StemPro-34 средний, содержащий
      б. 2,6% StemPro-34 среднего добавка,
      с. 20% БИТ-9500,
      г. 900 нг / мл сульфат железа,
      э. 90 нг / мл нитрат трехвалентного железа,
      е. 100 ед / мл пенициллина / стрептомицина, 2 мМ L-глутамина
      г. 10 -6 М гидрокортизон
      час и недавно добавил цитокины:
      я) 100 нг / мл SCF,
      II) 5 нг / IL-3 мл,
      III) 3 МЕ / мл ЕРО.
    2. Граф клеток с использованием автоматического счетчика клеток или вручную на микроскопе с использованием крайocytometer.
    3. Пластина в клеточной культуральной пластины 6-луночный в концентрации 5 × 10 5 клеток / лунку в конечном объеме 2,5 мл в EGM (2 × 10 5 LDBM клеток / мл) и инкубировали при 37 ° С (это считается как день # 0 культуры).
    4. Изменение среды путем аспирации 1,5 мл надосадочной жидкости, вращается со скоростью 525 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре, ресуспендирования в 1,5 мл свежей среды, содержащей все три цитокины и добавление обратно в лунки каждый день по дням # 2, 3, 4, чтобы оптимизировать пролиферативная фаза. На 3-й день, удалить все клетки, считать и разделен на соответствующее количество скважин для поддержания концентрации также сотовые ~ 2 х 10 5 клеток / мл. Поддерживать культуру при 37 С / 5% СО 2 °.
    5. На 4-й день, пластина MS5 клетки (мышиный линии стромальных клеток) в лунки новой клеточной культуры 6-луночный планшет. Клетка-культуральная среда MS5 в α-МЕМ, содержащей 20% FBS, 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина.
    6. На 5-й день, подсчитать количествоклетки (теперь значительно обогащен эритробластов) в каждую лунку исходного культуральном планшете с использованием автоматического счетчика клеток или вручную на микроскопе с помощью гемоцитометра.
    7. Лифт все клетки из каждой лунки и передать 15-мл конические пробирки, спин вниз при 525 х г в течение 5 мин при комнатной температуре, аспирата супернатанта и растворить гранулы со свежим EGM, содержащей только EPO (3 МЕ / мл) до концентрации 2 х 10 5 клеток / мл.
    8. Аспирируйте супернатант из лунок, где MS-5 Клетки высевали в предыдущий день (направлена ​​на 70-80% слияния во время совместного культивирования) и добавить эритроидных клеток в этих скважинах в EGM, содержащей только EPO (хотя не их среда выбор, MS-5 клеток выживать в ВОСА в течение нескольких дней).
    9. Изменение средней добавив, свежий EPO на день # 6.
    10. Изменение среды на день # 7, используя внеочередное собрание акционеров без добавления цитокинов. В дни с 7 по 9, тестовые образцы для энуклеации с проточной цитометрии после окрашивания анти-Ter119 и SYTO-16 ежедневно и рroceed для окрашивания образцов для нескольких спектральных изображений проточной цитометрии (как описано в разделе 3).
      Примечание:. Перед покрытием и в день 2, 4, 6 и 7 культуры, мониторинг культивируемые клетки для обогащения эритробластов и дифференциации с проточной цитометрии путем оценки поверхностные маркеры CD44 и Ter119 против размера (FSC) 9 альтернативы CD71, Ter119 и FSC также могут быть использованы 10, 11.

2. Быстрый Энуклеация Анализ, В соответствии с протоколом, описанным Yoshida и соавт. 12 с изменениями (рис. 1В)

  1. Стресс эритропоэз индукция и стромы клеточный препарат для в пробирке эритропоэза культуры
    1. Обезболить в 2-6 месячного дикого типа C57/BL6 мышь за руководящими принципами IACUC (например, с изофлурана решения). Убедитесь, что мышь была адекватно наркоз путем проверки отсутствия рефлексивных ответов на пологом задние лапы-шнура и длярегулярные дыхания во время процедуры. Используйте ветеринар глазной мази на глазах, чтобы предотвратить сухость в то время как под наркозом.
    2. Вызвать стресс эритропоэз через хвост кровотечение до конечного объема 500 мкл. Использование инсулиновый шприц, вводят равный объем физиологического раствора внутрибрюшинно заверить жидкости реанимации животного (держать животное в положение Тренделенбурга перед инъекцией и впрыснуть в нижней части живота, чтобы не повредить внутренние органы).
    3. Не оставляйте без присмотра мышь, пока он не восстановил контроль двигателя, как указано животного начинает двигаться по клетке и быть в состоянии стоять и ходить, не падая. Phlebotomized Мышь помещают в клетку без других мышей.
    4. После 2 дней, плиты MS-5 клеток в лунки клеточного культурального планшета 24-луночного. Инкубировать MS-5 клеток на 37 ° C / 5% CO 2 в MS5 клеточной среде (-МЕМ, содержащей 20% FBS, 100 единиц / мл пенициллина / стрептомицина и 2 мМ L-глутамина) с целью быть 70-80 % сливной ян планшетов после 48 часов.
  2. Урожай селезенки и обработки спленоцитов
    1. Четыре дня (96 ч) после индукции стресс эритропоэза, усыпить ранее кровь мыши через IACUC-утвержденным протоколом (например CO 2 ингаляции следуют путем смещения шейных позвонков).
    2. Урожай селезенки и положить его в 15-мл коническую трубку с IMDM 2% FBS и держать на льду.
    3. Еще в лаборатории, в капот культуры ткани в стерильных условиях, инвертировать селезенки, содержащие трубки на сито 40 мкм клеток, установленного в верхней части 50-мл пробирку. Давка селезенки, используя поршень из 5-мл пластиковый шприц.
    4. Промыть фильтр клеток с IMDM +2% FBS и с использованием той же среды, регулировать конечный объем клеточной суспензии в 5 мл.
    5. Осторожно слой в 5 мл суспензии спленоцитов на 5 мл плотности разделения градиента клеток среднего 1,083 г / мл в 15-мл пробирку и спина при 750 мкг в течение 25 минут при комнатной температуре, без тормозов / низкая ускорения.
    6. Передачасупернатант (раствор примерно до 2-мл отметки 15-мл пробирку для того, чтобы приобрести Баффи пальто) на новый 15-мл трубки и выполнять еще одну стирку с IMDM +2% FBS в 525 мкг в течение 5 минут при комнатной температуре .
    7. Аспирируйте супернатант и лизиса эритроцитов путем суспендирования осадка в 3 мл буфера для лизиса эритроцитов в течение 5 мин при комнатной температуре.
    8. Добавить 7 мл IMDM +2% FBS мыть клетки и разбавить и нейтрализовать буфер для лизиса и спина РБК в 525 мкг в течение 5 мин при 4 ° С.
    9. Аспирируйте супернатант и приостановить осажденные клетки в 2 мл среды роста эритробластов (EGM).
  3. Культура изолированных спленоцитах низкой плотности, обогащенных эритробластах, на пластик (первый этап быстрого эритропоэза культуры в пробирке)
    1. Подсчет клеток на автоматическом счетчике клеток или вручную гемоцитометре. Обычная количество клеток, выделенных на селезенке на данном этапе составляет ~ 15 х 10 6.
    2. Приостановить клетки далее в ВОСА, содержащие цитокины (в фИнал концентрации): SCF 50 нг / мл, IL-3 5 нг / мл, и Epo 2 Ед / мл.
    3. Пластинчатые 1-5 х 10 6 клеток в конечном объеме 1 мл / лунку (такое же количество клеток на лунку в зависимости от общего числа клеток) в 24-луночный клеточной культуральный планшет и инкубируют O / N при 37 ° С / 5% СО 2.
  4. Культура эритробластах на MS5 клеток (второй этап быстрого эритропоэза культуры в пробирке
    1. Аспирируйте супернатант из пластика скважины и поднимать клетки (высоко обогащенных эритробластов) добавлением 2 мл холодного 10 мМ ЭДТА в PBS в течение 5 мин, на льду в каждую лунку.
    2. Положите клеток в свежие пробирки, мыть один раз в ВОСА (без цитокинов) и ресуспендируйте в то же самое.
    3. Пластинчатые 5 х 10 5 -1 × 10 6 клеток в объеме 1-2 мл в каждую ячейку MS5 покрытием лунку 24-луночного планшета. Если фармакологические ингибиторы, которые используются в эксперименте, добавить их в соответствующих концентрациях теперь.
    4. Выдержите в течение 6 до 8 часов (время руководствуясьмикроскопическим наблюдением примерно 30% -40% энуклеации в необработанном образце WT). Связывание эритробластах для MS-5 клеток ускоряет их энуклеации.
    5. Лифт клеток из каждой лунки добавлением 2 мл холодного PBS + 10 мМ ЭДТА, в течение 5 мин, на льду. Наряду с эритробластах, MS-5 клеток также будут собраны, но они позже могут быть легко исключены при анализе цитометрического потока как FSC привет Ter119 - клеток.
    6. На данном этапе клетки могут быть зафиксированы и окрашены для анализа нескольких спектральных изображений проточной цитометрии.

3. Окрашивание эритробласты для локализации внутриклеточных белков или липидного плоты момент энуклеации по Multi-спектральных изображений проточной цитометрии

  1. Промыть клеток в PBS, спина 525 мкг в течение 5 мин при комнатной температуре и аспирации супернатант.
  2. Fix клетки ресуспендированием ячейки гранул в 500 мкл 3,7% формальдегида в PBS в течение 15 мин (время фиксирования может варьироваться в зависимости от антипоколения зондируемой) и пипетки осторожно.
  3. Переход к 1,5-мл пластиковые центрифужные пробирки и инкубируют в течение 15 мин при комнатной температуре.
  4. Спин на скамейке микроцентрифужную 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и выполнить одно мытье, добавив 500 мкл PBS в каждую пробирку и пипетки осторожно.
  5. Спин на скамейке микроцентрифужную 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и держать труб на льду в течение не менее 15 мин. Permeablization шаги 3.6-3.9 должно быть сделано быстро и эффективно, и после спиннинг / стремление при комнатной температуре, клеточные осадки сразу следует положить обратно на льду, для того, чтобы клетки, чтобы лучше сохранить их целостность.
  6. Возьмите ацетон решения из -20 ° C морозильник и поставить на лед. Проницаемыми клетки ресуспендированием ячейки гранул сначала в 500 мкл ледяного 50% ацетона (1:1 с дН 2 O) и пипетки осторожно.
  7. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют осадков клеток в 500 мкл60; ледяной 100% ацетона с помощью пипетки осторожно.
  8. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют осадков клеток более раз в 500 мкл ледяного 50% ацетона с помощью пипетки осторожно.
  9. Спин на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и мыть клетки один раз в холодном буфере FACS (PBS + 0,5% BSA) с помощью пипетки осторожно.
  10. Подготовка маркировки коктейль с антителами или маркеров для молекул, представляющих интерес: 0,1 мкл U/100 AF488-фаллоидином для F-актина окрашивания и 1 мкл μl/100 Ter119-PECy7 для окрашивания эритроидных клеток. Альтернативных или дополнительных окрашивание также можно сделать с помощью AF-488-анти-β-тубулина антитела (1:50), AF-594-сопряженных холерный токсин субъединицы B маркировать липидов плоты (1:200), анти-pMRLC (Ser19) Первичные антитела к фосфорилированной регуляторной легкой цепи миозина (1:50), с последующим анти-кроличьего AF-488-конъюгированным вторичным антителом (1:400) и анти-γ-тубулин первичный кроличье антитело (1:100) с последующим анти-кроличьего AF-555-конъюгированного вторичного антитела (1:300).
  11. После супернатанта аспирацией, ресуспендируют осадка клеток в 100 мкл коктейля маркер, пипетки осторожно и инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре.
  12. Подготовка FACS буфера, содержащего 2,5 мкм в пятно Draq5 ядерной.
  13. Вымойте клеток в FACS буфера, спин вниз на скамейке микроцентрифуге 2000 мкг в течение 20 сек, аспирации супернатант и ресуспендируют в 60 мкл FACS буфера, содержащего Draq5.
  14. Запуск образцы на визуализации проточного цитометра собрать не менее 10 тысяч событий в эксперименте, компенсировать файлы исходных данных, как ранее опубликованной 13, и анализировать результаты, как показано на рисунке 2, используя программное обеспечение для анализа, специфичную для визуализации проточного цитометра.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Во-первых, клетки анализируются на основе их светлое Aspect Ratio (соотношение длины их незначительное по сравнению с их главной оси) и их Светлое Площадь (ориентировочная от их размера). События с значение Светлое Площадь ниже 20 и выше, чем 200, в основном мусор и клеточные агрегаты, соответственно, и исключены из анализа (рис. 2А). Отдельные клетки (ворота "R1") затем анализировали на основе их значения параметра Градиент RMS, что указывает резкость изображения. Ворота "R2" создается содержащие клетки со значением Градиент RMS больше, чем 50-го процентиля, чтобы выбрать снимки, сделанные также в фокусе (рис. 2В). Затем клетки закрытого на основе их размере, определяется их светлого пространства, и их положительность для эритроидных маркера Ter119 как измерено флуоресцентного параметра пятно Среднее Pixel Ter119 (ворота "Ter119 позитивный", 2С). Клетки очень низких или очень высоких для Ter119, либо не erythroids или оставшиеся агрегаты клеток, соответственно, и исключены из анализа. На следующем этапе клетки выбраны на основе их Draq5 Аспект отношение интенсивностей (отношение малой по сравнению с пиком интенсивности оси их ядра) и интенсивность Draq5 (рис. 2D). Draq5 негативные клетки (в основном энуклеированные клетки, такие как ретикулоцитов и эритроцитов), а клетки с низким Draq5 Aspect Ratio (в основном дублетов) исключены из анализа. Draq5 положительных клеток (ворота "ДНК положительный", в основном эритробласты в этой точке) затем анализируются на основе их Ter119 Площадь, что указывает на размер ячейки, и их Ter119 среднее Pixel / Area (плотность выражения Ter119), который указывает на то, яркость окраски Ter119. Ортохроматических эритробласты (ворота "OrthoE") признаются в качестве небольших Ter119 привет клеток (рис. 2Е). Наконец, субпопуляции в orthochroхор эритробласты сильно обогащены энуклеирующий клетки характеризуется низкой светлого Aspect Ratio, которая является измерение удлинения клеток, рассчитывается по соотношению малая ось / большая ось изображения клеток в канале светлого М01, и по высокой Delta центроидом XY Ter119 / Draq5, которая определяется расстоянием между центром зарождающейся Ter119 +-ретикулоцитов и центре Draq5 +-ядра (ворота "энуклеирующий клеток" в рисунке 2F).

Наряду с антителами против Ter119 и ДНК-пятно Draq5, клетки были также окрашены для нитчатых актина (F-актин) с флуоресцентным фаллоидином оценить локализацию F-актина во эритробластов энуклеации 7. Следует отметить, что прогрессирование энуклеации могут быть визуализированы в фиксированных клеток, а клетки с уменьшающимся соотношением сторон (т.е. более удлиненный) и наблюдаются увеличение дельта центр тяжести XY Ter119/Draq5 (рис.Юр 3). F-актин наблюдается сосредоточиться на борозде расщепления во время энуклеации а затем рассеять раз ядро ​​выдавливается. Кроме того, совместная локализация актина и миозина в щели расхождения между начальной ретикулоцитов и ядра может быть продемонстрировано с помощью мульти-спектральной потока изображений цитометрии после совместного окрашивания WT эритробластах для pMRLC (фосфорилируются регуляторной легкой цепи миозина) и F-актина 7.

Другие белки и структуры интерес также могут быть окрашены с соответствующими антителами или флуоресцентными маркерами, чтобы позволить изображений исследования их роли в процессе энуклеации. Формирование поляризованный микротрубочек виден в WT ортохроматических эритробластах до энуклеации, но не в эритробластах получавших колхицин (рис. 4, а). Ингибирование полимеризации тубулина колхицином уменьшается клеток поляризации, о чем свидетельствует измерения параметра дельта центр тяжести XY BF/Draq5 между центтер тела клетки видно на светлое канал и центром ядерного окрашивания достигается при Draq5 (фиг.4В).

Используя WT или Rac-дефицитных (после генетической или фармакологической манипуляции) эритробласты в мульти-спектральной потока изображений цитометрии разрешенных методов визуализации, которые демонстрируют роль Rac GTPases в энуклеации. Rac GTPases регулировать по крайней мере частично на формирование актомиозинового кольца, а также слияние липидных плотах в борозде между начальной ретикулоцитов и pyrenocyte 7.

Рисунок 1
Рисунок 1. Принципиальная демонстрация эритропоэз протоколов в пробирке, используемых для получения энуклеирующий эритробласты для исследований. А. Долгосрочный экстракорпоральное эритропоэза культуры initiatред от LDBM или Lin -.. клетки Б. Быстро энуклеация анализ инициирован спленоцитах высоко обогащенных эритробластах после стресса эритропоэза индукции в естественных условиях по кровопускания Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 2
Рисунок 2. Анализ данных используя программное обеспечение для анализа, характерные для потока изображений цитометр. Последовательное стробирование популяций интерес показан на панели AF. Цифры в скобках указывают приблизительный процент соответствующего родительской популяции, в этом эксперименте. A. Исходное стробирования населения R1 удаляет клеточных агрегатови клеточный дебрис. B. Выход из R2 R1 включает клетки, которые были четко вошедшие в образ, за исключением из целевых клеток. С. Ter119-позитивных клеток (из R2) выбраны, за исключением клеток, которые либо отрицательным для Ter119 или которые слишком интенсивно окрашенная из-за их присутствия в агрегатах. D. ДНК-позитивные клетки (из Ter119-позитивных клеток) выбираются, после построения профиля, отношение интенсивности по сравнению с интенсивностью ядерной пятно (здесь Draq5 читать в канале 5). Е. клетки ДНК-и Ter119-положительные имеют закрытый в базофильной, полихроматофильных и ортохроматических эритробластах на основе их расположения в Ter119 Mean Pixel против Ter119 Площадь (здесь читать в канале 3), как показано ранее Макграт и др. 5. Ф. В энуклеирующий клетки эти клетки из ортохроматических эритробластах, которые имеют низкую Aspect Ratio (измерения клеточной elongatионов в светлое (BF) канала) и высокой Дельта Centroid XY Ter119/Draq5 (расстояние между центром формирования Ter119 +-ретикулоцитов и центр ядра). Это исследование было впервые опубликована в крови: Konstantinidis Д.Г., Pushkaran С, и др. сигнализации и требованиям цитоскелета в эритробластов энуклеации крови... 2012;. 119 (25) :6118-6127 Американского общества гематологии Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3. Представитель изображения энуклеирующий эритробласты с постепенного увеличения Дельта Centroid XY Ter119/Draq5. WT мыши ортохроматических эритробласты, окрашенные Ter119-PECy7, фаллоидином-AF488 и Draq5, которые закрытого за их соотношения сторон и дельта тяжести XY Ter119/Draq5. Клетки показано фиксируется в различных, последовательных этапов энуклеации, с прогрессией, которая соответствует уменьшения формата изображения и повышения дельта центра тяжести XY Ter119/Draq5 (зелено-кросс в пределах желтой ворот показывает положение ячейки отображаемого справа). В клеточных изображений сверху вниз, F-актин можно наблюдать во время энуклеации сконцентрироваться на щели расхождения, а затем рассеять раз ядро выдавливается (как показано в ячейке # 4782 на нижнем изображении). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенное рисунке.

Рисунок 4
Рисунок 4. Формирование однополярного собраний и поляризации orthochroma микротрубочектик эритробласты предшествует энуклеации. А. Поляризовыванная образование микротрубочек видна в контрольных WT эритробластов (окрашивали анти-б-тубулина-AlexaFluor-488 и пятно Draq5 ядерного), тогда как B-тубулина диффузно окрашивают в эритробластов, инкубированных с колхицином (5 мкМ) в течение 6 часов в быстро в пробирке энуклеации анализа. Б. многоспектральные цитометрии потока изображений может предложить количественную оценку клеточной поляризации путем анализа распределения параметра Delta центроидом XY BF/Draq5, который измеряет расстояние между центром тела клетки как показано на светлом поле и центром ядерного окрашивания достигается при Draq5 (схематическое изображение на вставке). Значения Дельта Centroid BF/Draq5 колхицина обращению WT ортохроматических эритробластах статистически значительно отличается от контроля значения Дельта Centroid BF/Draq5 (р <0,001). Это исследование было впервые опубликована в Blooг:.. Konstantinidis Д.Г., Pushkaran С, и др. сигнализации и требования цитоскелетные в эритробластов энуклеации крови. 2012;. 119 (25) :6118-6127 Американского общества гематологии Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В последние годы изучение эритробластов энуклеации приобрел большее импульс, так как это является шагом в в пробирке эритропоэз культур, которые наиболее трудно воспроизвести эффективно для достижения успешного, крупномасштабное производство красных кровяных клеток экс естественных условиях. До недавнего времени изучение эритробластов энуклеации используются в основном флуоресцентной микроскопии и проточной цитометрии методы. Методы флуоресцентной микроскопии, хотя полезны в выявлении, участвующих молекул, требуют дни микроскопом, чтобы определить небольшое количество ортохроматических эритробластах проходящих энуклеации в сотни клеток фиксированных на определенный момент времени. Проточной цитометрии методов, с другой стороны, очень полезны при оценке темпов энуклеации в культуре, а также эффекты фармакологического или генетических манипуляций отдельных молекул на этом процессе, но не предоставляют никаких данных о intracellulар локализации этих молекул.

Multi-спектральный поток изображений цитометрии сочетает в себе преимущества проточной цитометрии и иммунофлуоресцентного микроскопии, так как это позволяет быстро приобретение как цитометрии потока и морфологических данных о нескольких тысяч клеток. Это является существенным преимуществом по сравнению с классической проточной цитометрии в эритропоэз исследований, так как на различных этапах эритробластов дифференциации (proerythroblasts, базофильная, полихроматофильных и ортохроматический) были определены с использованием морфологических критериев 6. Тем не менее, в нескольких спектрах цитометрии потока изображений является оптимальным для визуализации клеточных структур, а не относительных сравнений количественного в численности населения. Для таких сравнений, рутина потока цитометрии, что не требует шаг необходимую пермеабилизации для иммунофлуоресценции внутриклеточных структур работает лучше. Например относительная доля BasoE: PolyE: OrthoE на рисунке 2Е

Данные изображений могут быть обработаны в ассоциации с проточной цитометрии с использованием данных программное обеспечение для анализа конкретной потоку изображений цитометра, позволяя сбор клеток с определенными морфологическими характеристиками в жилищах. Приблизительно сто энуклеирующий клетки могут быть идентифицированы в популяции 10000 эритробластов с помощью метода анализа, описанного выше в быстро и эффективно 7, позволяя более значимые наблюдения и статистическую оценку.

Кроме того, обработка изображений облегчается с анализа программного обеспечения, характерные для потока изображений цитометра позволяя количественный анализ таких характеристик, как Дельта центроидом XY учиться например относительного положения ядра вцитоплазма, которые могут быть использованы в качестве меры поляризации.

Критические шаги в протоколе и устранения неисправностей

Хорошо известно, что даже осторожно пипеткой может привести к разделению ретикулоцитов и pyrenocyte 12. Это имеет потенциал, чтобы серьезно ограничить количество энуклеации событий в образ. В результате, необходимо соблюдать осторожность, особенно при подъеме эритробластов, связанные с MS5 клеток в культуре.

Фиксация с раствором формальдегида может вызвать изменения в внеклеточных регионах поверхностных маркеров приводит к снижению специфических антител обязательного и / или связывания увеличился неспецифические антитела. Преимущество потока изображений цитометра является то, что окрашивание поверхности визуализируется и его качество может таким образом быть оценены. Пунктирная, вместо униформы, окрашивание на обильные поверхностных маркеров, таких как Ter119 указывает overfixation и должны решаться путем сочетания нижней формальдегидКонцентрация Хайд и короче продолжительность фиксации.

После фиксации, сохраняя клетки на льду в течение не менее 15 мин является жизненно важным, чтобы предотвратить избыточное разрушение клеток в процессе пермеабилизации из-за разницы температур. Хотя ацетон пермеабилизации сохраняет хрупкие поздние erythroids лучше, чем моющего средства опосредованного проницаемости, этап, где требуется 100% ацетон приведет к заметному, но не в ущерб, потерю клеток. В конце, после стирки с холодным буфером FACS, клетки могут при комнатной температуре в течение шагов антитела инкубации.

Поток изображений цитометр имеет набор скорости потока (ячеек / с) в зависимости от используемого объектива (ставка снизилась по мере увеличения). После последней промывки перед измерением, рекомендуется, что клеточные осадки ресуспендируют в небольшом объеме (50-60 мкл), с тем чтобы ускорить обработку образца. Для большого числа образцов, которые повторнодесть большую продолжительность перспективе (более 30 мин), образцы должны храниться на льду.

Долгосрочная энуклеация анализ дает преимущество расширенного производства эритроидных клеток с целью получения достаточно клетки, которые могут быть собраны на стадии энуклеации для биохимического оценки как иммуноблотинга и отжимания. Быстрый энуклеация анализ дает преимущество времени, требующей только 2 дня, чтобы выполнить, хотя мышь должна быть Phlebotomized за 4 дня до эксперимента. Мы не наблюдается существенное различие в эффективности энуклеации между двумя методами. Следует отметить, что проточной цитометрии оценки, который не требует шаг проницаемости, необходимую для иммунофлуоресценции внутриклеточных структур, как описано выше 7, является наиболее подходящим для количественной оценки эффективности энуклеации.

Ограничения технике

Описанный здесь метод ИМПlizes индуцированной стрессом эритропоэз в естественных условиях и культуры в среде, содержащей гидрокортизон в пробирке для амплификации эритроидных населения и синхронизировать их на стадии энуклеации. Оба эти условия, вероятно, подражать эритробласта-энуклеации в условиях стресса. Кроме того, гидрокортизон значительно увеличивает выход эритроидного и выживание. Для получения аналогичной выход энуклеации событий из клеток костного мозга, полученных от мышей дикого типа с стационарном эритропоэза и культивируют без гидрокортизона (поэтому избежать синхронизации), мы должны были бы культуре клеток из нескольких мышей и бегать и обрабатывать гораздо больше событий через мульти -спектральных изображений проточной цитометрии. Хотя мульти-спектральный поток изображений цитометрии ускоряет сбор данных морфологических огромной по сравнению с использованием иммунофлуоресцентного микроскопа увеличение объектива до 60x, сравнение наблюдений, полученных изображений проточного цитометра с классическим, Z-Stack,и конфокальной микроскопии изображения ценно получить больше деталей, так как линза объектива в микроскоп может обеспечить увеличение до 100x и изображения Z-Stack дать 3-мерное представление о структурах, что не достижимо потока изображений цитометр в то же самое клеток. Относительное большое количество подобных клеток, собранных в многоспектральным потока изображений цитометрии эксперимента, при случайной ориентации, частично компенсирует это ограничение, позволяющее наблюдения с другом точка зрения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют каких конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Авторы благодарят Исследования проточной цитометрии Ядро в больнице Research Foundation Цинциннати Детская и Ричард Demarco, Sherree другу, и Скотт Мордехая от Amnis Corporation (часть EMD Milllipore) для экспертной технической поддержки. Эта работа была поддержана Национальными Институтами Здоровья предоставляет K08HL088126 и R01HL116352 (TAK) и P30 DK090971 (YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM medium CellGro 15-012-CV
IMDM medium Hyclone (Thermo Scientific) SH30228.01
Stempro-34 SFM GIBCO (Life Tech) 10640
Stempro-34 nutrient supplement GIBCO (Life Tech) 10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals 512450
BIT9500 Stemcell Technologies 09500
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS) Hyclone (Thermo Scientific) SH30028.02
Penicillin/Streptomycin Hyclone (Thermo Scientific) SV30010
L-glutamine Hyclone (Thermo Scientific) SH30590.01
Isothesia (Isoflurane) Butler-Schein 029405
Histopaque 1.083 mg/ml Sigma 10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) BD Biosciences 555899
Acetone Sigma-Aldrich 534064
Formaldehyde Fisher Scientific BP 531-500
Hydrocortisone Sigma H4001
Stem Cell Factor (SCF) Peprotech 250-03
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech 213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) AMGEN available by pharmacy
CD44-FITC antibody BD Pharmingen 553133
CD71-FITC antibody BD Pharmingen 553266
Ter119-PECy7 antibody BD Pharmingen 557853
Phalloidin-AF488 Invitrogen (Life Technologies) A12379
β-tubulin-AF488 antibody Cell Signaling #3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A21428
AF594-cholera toxin B subunit Invitrogen (Life Technologies) C34777
pMRLC (Ser19) antibody Cell Signaling #3671
γ-tubulin antibody Sigma T-3559
Syto16 Invitrogen (Life Technologies) S7578
Draq5 Biostatus DR50200
Ferrous sulfate Sigma F7002
Ferric nitrate Sigma F3002
EDTA Fisher Scientific BP120500
15-ml tubes BD Falcon 352099
50-ml tubes BD Falcon 352098
6-well plates BD Falcon 353046
24-well plates BD Falcon 351147
Flow tubes BD Falcon 352008
Tuberculin syringe BD 309602
Insulin syringe BD 329461
Syringe needle 25-G 5/8 BD 305122
Capped flow tubes BD 352058
40-μm cell strainer BD Falcon 352340
Scalpel (disposable) Feather 2975#21
FACS Canto Flow Cytometer BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter Drew Scientific CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Mini Mouse Bench centrifuge Denville C0801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics