मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो द्वारा Enucleating घटनाक्रम में एक murine लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका subpopulation समृद्ध की पहचान

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

वर्तमान प्रोटोकॉल cytometry, मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह द्वारा orthochromatic erythroblasts enucleating लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण प्रक्रिया का एक दृश्य प्रदान की आबादी की पहचान करने के लिए एक उपन्यास विधि का वर्णन करता है.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konstantinidis, D. G., Pushkaran, S., Giger, K., Manganaris, S., Zheng, Y., Kalfa, T. A. Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (88), e50990, doi:10.3791/50990 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

स्तनधारियों में एरिथ्रोपोएसिस reticulocyte गठन में यह परिणाम है कि स्पष्टीकरण के नाटकीय प्रक्रिया के साथ समाप्त. स्पष्टीकरण का तंत्र अभी तक पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है. माइक्रोस्कोपी द्वारा enucleating erythroblasts भीतर प्रमुख प्रोटीन और संरचनाओं के स्थानीयकरण का अध्ययन सामना करना पड़ा जब एक आम समस्या स्पष्टीकरण के दौर से गुजर कोशिकाओं की एक पर्याप्त संख्या में निरीक्षण करने के लिए मुश्किल है. हम प्रवाह में Multiparameter उच्च गति सेल इमेजिंग (मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो), कुशलता enucleating की घटनाओं का एक महत्वपूर्ण संख्या की पहचान करने के क्रम में, प्रवाह cytometry साथ immunofluorescent माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक विधि का उपयोग कर एक उपन्यास विश्लेषण प्रोटोकॉल विकसित किया है, जो करने के लिए अनुमति देता है माप प्राप्त और सांख्यिकीय विश्लेषण करते हैं.

हम यहाँ पहली बार murine erythroblasts सिंक्रनाइज़ और वें पर स्पष्टीकरण पर कब्जा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया दो में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति विधियों का वर्णनमूल्यांकन के ई समय. फिर, हम बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा स्पष्टीकरण दौरान intracellular प्रोटीन या लिपिड rafts का स्थानीयकरण का अध्ययन करने के क्रम में विस्तार से निर्धारण और permeabilization के बाद erythroblasts के धुंधला वर्णन. आकार और orthochromatic erythroblasts की पहचान करने के लिए उपयोग किया जाता है जो DNA/Ter119 धुंधला के साथ, हम लम्बी कोशिकाओं और "डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/Draq5 की मान्यता में एड्स कि उज्ज्वल क्षेत्र चैनल में एक सेल के मापदंडों" पहलू अनुपात "का उपयोग "कि Ter119 धुंधला (नवजात reticulocyte) के केंद्र दूर DRAQ5 धुंधला (नाभिक के दौर से गुजर बाहर निकालना) के केन्द्र से है जिसमें सेलुलर घटनाओं, की पहचान इस प्रकार व्याख्या करना करने के बारे में एक सेल का संकेत देता है. उच्च डेल्टा केन्द्रक और कम पहलू अनुपात के साथ orthochromatic लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका जनसंख्या का सबसेट अत्यधिक कोशिकाओं enucleating में समृद्ध है.

Introduction

स्तनधारियों में एर्य्थ्रोइद वंश के भीतर टर्मिनल भेदभाव orthochromatic लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका एक reticulocyte 2 पैदा करने, अपनी झिल्ली encased नाभिक (pyrenocyte) 1 expels जिसके माध्यम से स्पष्टीकरण की नाटकीय प्रक्रिया, के साथ समाप्त. भी सफल की दर सीमित कदम है जो इस प्रक्रिया की सटीक व्यवस्था, बड़े पैमाने पर, इन विट्रो में लाल रक्त कोशिकाओं के उत्पादन, अभी तक पूरी तरह स्पष्ट नहीं है. enucleating erythroblasts भीतर प्रमुख प्रोटीन और संरचनाओं के स्थानीयकरण फ्लोरोसेंट और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 3-5 के उपयोग पर निर्भर करता है. इस थकाऊ प्रक्रिया आम तौर पर स्पष्टीकरण की घटनाओं का एक सीमित संख्या की पहचान में यह परिणाम है और हमेशा सार्थक सांख्यिकीय विश्लेषण की अनुमति नहीं है. मैक्ग्रा एट अल. 6 द्वारा पहले से वर्णित लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका की पहचान की एक विधि पर विस्तार, हम मल्टी स्पेक्ट्रल भारतीय सैन्य अकादमी से स्पष्टीकरण की घटनाओं की पहचान और अध्ययन का एक उपन्यास दृष्टिकोण विकसित किया हैमाप प्राप्त और सांख्यिकीय विश्लेषण प्रदर्शन करने के लिए टिप्पणियों के लिए पर्याप्त संख्या प्रदान कर सकते हैं जो ging फ्लो (प्रवाह में Multiparameter उच्च गति सेल इमेजिंग, फ्लो के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी को जोड़ती है एक विधि) 7.

यहाँ, हम erythroblasts सिंक्रनाइज़ और मूल्यांकन के समय पर स्पष्टीकरण पर कब्जा करने की संभावना को बढ़ाने के लिए इस्तेमाल पहली दो में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति विधियों का वर्णन. तो फिर हम बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो द्वारा स्पष्टीकरण दौरान intracellular प्रोटीन या लिपिड rafts का स्थानीयकरण का अध्ययन करने के क्रम में विस्तार से निर्धारण और permeabilization के बाद erythroblasts के धुंधला वर्णन.

नमूने cytometer एक इमेजिंग प्रवाह पर चलाए जा रहे हैं और एकत्र कोशिकाओं orthochromatic erythroblasts 6 की पहचान करने के लिए उचित gated हैं. Brightfield आईएमए में मापा Orthochromatic erythroblasts तो, उनके पहलू अनुपात के आधार पर विश्लेषण कर रहे हैंging, क्रमशः Ter119 और डीएनए के लिए दाग क्षेत्रों के केंद्रों के बीच की दूरी के रूप में परिभाषित किया गया है जो पैरामीटर डेल्टा केन्द्रक XY Ter119 डीएनए, के लिए अपने मूल्य बनाम. कम पहलू अनुपात और उच्च डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/DNA साथ कोशिकाओं की आबादी अत्यधिक कोशिकाओं enucleating में समृद्ध है. / - है - या संयुक्त Rac2 - / - जंगली प्रकार (WT) का उपयोग करना Rac2 पर Rac1 की एमएक्स Cre मध्यस्थता शर्तों को हटाएँ साथ erythroblasts बनाम erythroblasts; Rac3 - / - आनुवंशिक पृष्ठभूमि और मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह के इस उपन्यास विश्लेषण प्रोटोकॉल cytometry, हम हाल ही में स्पष्टीकरण असममित cytokinesis जैसा दिखता है और आरएसी GTPases के हिस्से में विनियमित एक actomyosin अंगूठी के गठन स्पष्टीकरण प्रगति 7 के लिए महत्वपूर्ण है कि कि प्रदर्शन किया.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति में 1. लंबी अवधि (पूर्व vivo erythroid भेदभाव संस्कृति प्रोटोकॉल Giarratana द्वारा एट अल. 8, संशोधित और चूहे की कोशिकाओं के लिए अनुकूलित)

इस विट्रो एरिथ्रोपोएसिस प्रोटोकॉल में एक 3 कदम लंबी अवधि है. पहले चरण में (दिन 0-4) 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल स्टेम सेल कारक (एससीएफ), इंटरल्यूकिन -3 (आईएल 3), और erythropoietin (ईपीओ) के साथ पूरक लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका मध्यम विकास में रखा जाता है. दूसरे चरण (दिनों 5-6) में, कोशिकाओं x 10 2 में resuspended हैं 5 कोशिकाओं / केवल ईपीओ के साथ पूरक ताजा लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका मध्यम विकास में पक्षपाती स्ट्रोमा कोशिकाओं (MS5) पर मिलीलीटर और सह सुसंस्कृत. तीसरे चरण (दिनों 7-9) में, कोशिकाओं को स्पष्टीकरण के लिए साइटोकिन्स (चित्रा 1 ए) के बिना ताजा लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका मध्यम विकास में एमएस-5 कोशिकाओं की एक परत पर सुसंस्कृत हैं.

सभी पशु प्रोटोकॉल के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति (IACUC) द्वारा अनुमोदित किया गयासिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल के मेडिकल सेंटर.

  1. हड्डियों और कम घनत्व अस्थि मज्जा की कोशिकाओं के अलगाव की फसल
    1. 2 मिलीलीटर से 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में 2% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) युक्त बाँझ IMDM जोड़ने और बर्फ पर रहते हैं.
    2. (ग्रीवा अव्यवस्था के बाद जैसे सीओ 2 साँस लेना,) संस्था को मंजूरी दी प्रोटोकॉल के बाद (के साथ या ब्याज की आनुवंशिक रूप से लक्षित माउस के बिना साथ) एक 2-6 महीने पुराने जंगली प्रकार C57/BL6 माउस euthanize.
    3. , संदंश और स्केलपेल का उपयोग श्रोणि हड्डियों, femurs, और दोनों पैरों के tibiae पृथक IMDM 2% FBS युक्त ट्यूब के लिए उन्हें जोड़ने और बर्फ पर रख.
    4. (एक 25 जी एक्स के लिए कई बार धीरे हड्डियों के माध्यम से 5/8 "सुई. फ्लश IMDM 2% FBS के साथ संदंश और एक टुबरकुलीन सिरिंज का उपयोग कर एक बाँझ प्रवाह cytometry ट्यूब और फ्लश हड्डियों में 1 मिलीलीटर IMDM 2% FBS जोड़ें सेल निलंबन से ~ 500 μl aspirating और) हड्डी के माध्यम से फिर से यह निस्तब्धता, और प्रवाह के cytometr में अस्थि मज्जा कोशिकाओं को इकट्ठा करकेY ट्यूब. हड्डियों सफेद दिखाई देते हैं जब फ्लशिंग पूरा हो गया है.
    5. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन सेल झरनी सेट के माध्यम से सेल निलंबन तक. IMDM 2% FBS और एक ही मध्यम 5 एमएल सेल निलंबन के अंतिम मात्रा समायोजित उपयोग करने के साथ सेल झरनी धो लें.
    6. घनत्व ढाल centrifugation द्वारा कम घनत्व अस्थि मज्जा की कोशिकाओं (LDBM) तैयार करें: ध्यान से मध्यम 1.083 मिलीग्राम / छ 750 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में 25 के लिए घनत्व ढाल सेल जुदाई के 5 एमएल पर सेल निलंबन के 5 एमएल परत मिनट कोई ब्रेक / कम तेजी के साथ कमरे के तापमान (आर टी) पर.
    7. स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला (सब कुछ करने के लिए ऊपर से 15 मिलीलीटर ट्यूब के 2 मिलीलीटर निशान बफी कोट के अधिग्रहण के क्रम में) के बारे में एक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब और 5 मिनट पर के लिए 525 XG पर IMDM 2% FBS के साथ एक और धोने के लिए प्रदर्शन आरटी.
    8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और आरटी पर 5 मिनट के लिए 3 मिलीग्राम आरबीसी lysis बफर में गोली निलंबित करके किसी भी शेष लाल रक्त कोशिकाओं (आरबीसी) lyse. Erythroblasts का अधिक से अधिक शुद्धता है तो(जैव रासायनिक अध्ययन के लिए जैसे) अंतिम चरण में आवश्यक है, चुंबकीय जुदाई द्वारा लिन neg कोशिकाओं को इस कदम पर आगे LDBM कोशिकाओं को शुद्ध.
  2. LDBM या लिन neg कोशिकाओं से शुरू पूर्व vivo एर्य्थ्रोइद भेदभाव संस्कृति प्रोटोकॉल (चित्रा 1 ए)
    1. जोड़ें 7 मिलीलीटर IMDM 2% FBS, 5 आरटी पर मिनट और से मिलकर, 2 मिलीलीटर लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका मध्यम विकास (ईजीएम) में pelleted कोशिकाओं resuspend के लिए 525 XG पर स्पिन:
      एक. जिसमें StemPro-34 मध्यम,
      बी. 2.6% StemPro -34 मध्यम पूरक,
      सी. 20% बीआईटी-9500,
      डी. 900 एनजी / एमएल फैरस सल्फेट,
      ई. 90 एनजी / एमएल फेरिक नाइट्रेट,
      एफ. 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, 2 मिमी एल glutamine
      जी. 10 -6 एम hydrocortisone
      ज. और हौसले से साइटोकिन्स कहा:
      मैं) 100 एनजी / एमएल एससीएफ,
      द्वितीय) 5 एनजी / एमएल आईएल -3, और
      iii) 3 आइयू / एमएल ईपीओ.
    2. एक हेम का उपयोग कर एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर या स्वयं एक माइक्रोस्कोप में कक्षों की गणनाocytometer.
    3. अच्छी तरह / ईजीएम में 2.5 मिलीलीटर (2 X 10 5 LDBM कोशिकाओं / एमएल) के अंतिम मात्रा करने के लिए और 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते 5 x 10 5 कोशिकाओं के एक एकाग्रता में 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली में प्लेट (यह माना जाता है संस्कृति का दिन # 0 के रूप में).
    4. सतह पर तैरनेवाला की 1.5 एमएल aspirating आरटी पर 5 मिनट के लिए 525 XG पर कताई, सभी 3 साइटोकिन्स युक्त और दिन # 2 पर वापस वेल्स को हर दिन जोड़ने ताजा माध्यम से 1.5 मिलीलीटर में resuspending द्वारा मध्यम बदलें, 3, 4, अनुकूलन करने के लिए proliferative चरण. 3 दिन, सभी कोशिकाओं को हटाने गिनती और ~ 2 x 10 5 कोशिकाओं / एमएल की अच्छी तरह से सेल सांद्रता को बनाए रखने के क्रम में कुओं की उपयुक्त संख्या में विभाजित है. 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 संस्कृति को बनाए रखने.
    5. 4 दिन, एक नया सेल संस्कृति 6 अच्छी तरह से थाली के कुओं के लिए थाली MS5 कोशिकाओं (murine stromal सेल लाइन). MS5 सेल संस्कृति के माध्यम से 20% FBS युक्त, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 मिमी एल glutamine-सदस्य α है.
    6. सुबह 5 पर, संख्या की गिनतीएक स्वचालित सेल काउंटर या स्वयं एक hemocytometer का उपयोग एक खुर्दबीन पर उपयोग कर मूल संस्कृति की थाली के प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं (अब काफी erythroblasts में समृद्ध).
    7. प्रत्येक अच्छी तरह से सभी कोशिकाओं लिफ्ट और 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों के लिए स्थानांतरण, आरटी, सतह पर तैरनेवाला Aspirate पर 5 मिनट के लिए 525 XG पर नीचे स्पिन और 2 एक्स 10 के एक एकाग्रता के लिए केवल ईपीओ (3 आइयू / एमएल) युक्त ताजा ईजीएम साथ छर्रों भंग 5 कोशिकाओं / एमएल.
    8. एमएस-5 कोशिकाओं पिछले दिन (सह संस्कृति के समय में 70-80% confluency के लिए लक्षित) चढ़ाया और केवल ईपीओ युक्त ईजीएम में इन कुओं में एर्य्थ्रोइद कोशिकाओं जोड़ रहे थे, जहां कुओं से सतह पर तैरनेवाला Aspirate (नहीं उनके माध्यम से हालांकि चुनाव, एमएस-5 कोशिकाओं) कई दिनों के लिए ईजीएम में अच्छी तरह से जीवित रहते हैं.
    9. दिन # 6 पर ताजा ईपीओ जोड़ने मध्यम बदलें.
    10. कोई गयी साइटोकिन्स साथ ईजीएम का उपयोग कर, दिन # 7 पर मध्यम बदलें. दिनों में से 9 तक 7 cytometry, दैनिक विरोधी Ter119 और Syto-16 के साथ धुंधला हो जाना और पी के बाद प्रवाह के साथ स्पष्टीकरण के लिए परीक्षण के नमूनेमल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो (धारा 3 में विस्तृत रूप में) के लिए नमूनों को धुंधला roceed.
      नोट:. दिन 2, 4, 6, और संस्कृति के 7 पर चढ़ाना और इससे पहले, cytometry आकार (एफएससी) बनाम सतह मार्कर CD44 और Ter119 का आकलन करने से प्रवाह के साथ लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका संवर्धन और भेदभाव के लिए संवर्धित कोशिकाओं की निगरानी 9 वैकल्पिक रूप से CD71, Ter119, और FSC यह भी 10, 11 का इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. फास्ट स्पष्टीकरण परख, योशिदा एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल के अनुसार. संशोधनों के साथ 12 (चित्रा 1 बी)

  1. इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति के लिए तनाव एरिथ्रोपोएसिस प्रेरण और स्ट्रोमा सेल तैयारी
    1. IACUC दिशा निर्देशों के अनुसार एक 2-6 महीने पुराने जंगली प्रकार C57/BL6 माउस (जैसे isoflurane समाधान के साथ) anesthetize. माउस पर्याप्त रूप से एक सौम्य हिंद पंजा चुटकी करने के लिए बाध्य प्रतिक्रियाओं के अभाव के लिए और के लिए जाँच द्वारा anesthetized किया गया है कि यह सुनिश्चित करेंप्रक्रिया के दौरान नियमित रूप से respirations. संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक नेत्र मरहम का प्रयोग करें.
    2. 500 μl के अंतिम मात्रा करने के लिए खून बह रहा पूंछ के माध्यम से तनाव एरिथ्रोपोएसिस प्रेरित. एक इंसुलिन सिरिंज का प्रयोग, intraperitoneally जानवर के तरल पदार्थ पुनर्जीवन (इंजेक्शन लगाने से पहले Trendelenburg स्थिति में पशु पकड़ और आंतरिक अंगों को नुकसान के रूप में नहीं तो पेट के निचले हिस्से में इंजेक्षन) आश्वस्त करने के लिए सामान्य नमक के बराबर मात्रा इंजेक्षन.
    3. पिंजरे के चारों ओर स्थानांतरित करने के लिए शुरू करने और गिरने के बिना खड़े होने और चलने में सक्षम होने के जानवर ने संकेत दिया है कि यह मोटर नियंत्रण में आ गया है जब तक नायाब माउस मत छोड़ो. phlebotomized माउस अन्य चूहों के बिना एक पिंजरे में रखा गया है.
    4. 2 दिनों के बाद, 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के कुओं में एमएस-5 कोशिकाओं थाली. MS5 सेल के माध्यम से 37 डिग्री सेल्सियस / 5% सीओ 2 में एमएस-5 कोशिकाओं को सेते हैं (एक सदस्य 20% FBS युक्त, 100 इकाइयों / एमएल पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 मिमी एल glutamine) लक्ष्य के साथ 70-80 होने के लिए % मिला हुआ मैं48 घंटे के बाद पता थाली कुओं.
  2. तिल्ली और splenocytes के प्रसंस्करण की फसल
    1. चार दिन (96 घंटे) तनाव एरिथ्रोपोएसिस अधिष्ठापन के बाद, पहले से IACUC अनुमोदित प्रोटोकॉल (ग्रीवा अव्यवस्था के बाद जैसे सीओ 2 साँस लेना) के माध्यम से माउस लहूलुहान euthanize.
    2. हार्वेस्ट प्लीहा और IMDM 2% FBS युक्त एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में डाल दिया और बर्फ पर रख.
    3. वापस प्रयोगशाला में, बाँझ शर्तों के तहत टिशू कल्चर हुड में, एक 50 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर सेट एक 40 माइक्रोन सेल झरनी पर तिल्ली युक्त ट्यूब पलटना. एक 5 मिलीलीटर की प्लास्टिक सिरिंज के सवार का उपयोग तिल्ली क्रश.
    4. IMDM 2% FBS के साथ सेल झरनी धो लें और एक ही माध्यम का उपयोग कर, 5 एमएल सेल निलंबन के अंतिम मात्रा समायोजित करें.
    5. ध्यान से 5 एमएल घनत्व ढाल सेल जुदाई पर 5 एमएल splenocyte निलंबन परत मध्यम कोई ब्रेक / कम तेजी के साथ आरटी पर 25 मिनट के लिए 750 XG पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब और स्पिन में 1.083 मिलीग्राम / छ.
    6. स्थानांतरणएक नया 15 मिलीलीटर ट्यूब और आरटी पर 5 मिनट के लिए 525 XG पर IMDM 2% FBS के साथ एक और धोने के प्रदर्शन पर तैरनेवाला (Buffy कोट के अधिग्रहण के क्रम में 15 मिलीलीटर ट्यूब के 2 मिलीलीटर निशान के बारे में करने के लिए नीचे समाधान) .
    7. आरटी पर 5 मिनट के लिए 3 मिलीग्राम आरबीसी lysis बफर में गोली निलंबित करके सतह पर तैरनेवाला Aspirate और lyse लाल रक्त कोशिकाओं.
    8. कोशिकाओं को धोने के लिए और कमजोर करने के लिए और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 525 XG पर आरबीसी lysis बफर और स्पिन बेअसर 7 मिलीलीटर IMDM 2% FBS जोड़ें
    9. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका मध्यम विकास (ईजीएम) के 2 मिलीलीटर में pelleted कोशिकाओं को निलंबित.
  3. प्लास्टिक पर erythroblasts में समृद्ध पृथक कम घनत्व splenocytes,, (उपवास में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति के प्रथम चरण) की संस्कृति
    1. एक स्वचालित सेल काउंटर पर या स्वयं एक hemocytometer द्वारा कोशिकाओं की गणना. इस स्तर पर तिल्ली प्रति अलग कक्षों की संख्या सामान्य ~ 15 x 10 6 है.
    2. एफ (साइटोकिन्स युक्त आगे ईजीएम में कोशिकाओं निलंबितinal सांद्रता): एससीएफ 50 एनजी / एमएल, आईएल 3 से 5 एनजी / एमएल, और ईपीओ 2 यू / एमएल.
    3. / 24 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली के 1 मिलीग्राम / अच्छी तरह से (अच्छी तरह से कोशिकाओं की कुल संख्या के आधार पर प्रति कोशिकाओं की एक ही नंबर) के अंतिम मात्रा में और 37 डिग्री सेल्सियस पर ओ / एन सेते प्लेट 1-5 x 10 6 कोशिकाओं 5% सीओ 2.
  4. MS5 कोशिकाओं पर erythroblasts (उपवास में इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति के दूसरे चरण की संस्कृति
    1. महाप्राण अच्छी तरह से प्लास्टिक से सतह पर तैरनेवाला और अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए बर्फ पर, 5 मिनट के लिए पीबीएस में ठंड से 10 मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़कर (अत्यधिक erythroblasts में समृद्ध) कोशिकाओं उठा.
    2. (साइटोकिन्स के बिना) ईजीएम में एक बार धोने और उसी में resuspend, ताजा ट्यूब में कोशिकाओं डाला.
    3. करने के लिए एक 1-2 एमएल मात्रा में प्लेट 5 एक्स 10 5 -1 एक्स 10 6 कोशिकाओं प्रत्येक MS5 सेल में लिपटे एक 24 अच्छी तरह से थाली की अच्छी तरह से. औषधीय inhibitors प्रयोग में इस्तेमाल किया जा रहा है, अब उचित मात्रा में जोड़ें.
    4. द्वारा निर्देशित 6 से 8 घंटे (समय के लिए सेतेअनुपचारित गुम्मट नमूने में लगभग 30% -40% स्पष्टीकरण) का सूक्ष्म अवलोकन. एमएस-5 कोशिकाओं को erythroblasts के बंधन उनके स्पष्टीकरण accelerates.
    5. बर्फ पर, 5 मिनट के लिए, ठंड पीबीएस + 10 मिमी EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़कर प्रत्येक अच्छी तरह से कोशिकाओं उठा. Erythroblasts के साथ साथ, एमएस-5 कोशिकाओं को भी एकत्र किया जाएगा लेकिन बाद में इन आसानी FSC हाय Ter119 के रूप में प्रवाह cytometric विश्लेषण के दौरान बाहर रखा जा सकता है - कोशिकाओं.
    6. इस स्तर पर, कोशिकाओं मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो द्वारा विश्लेषण के लिए तय की और दाग जा सकता है.

3. मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो द्वारा स्पष्टीकरण दौरान intracellular प्रोटीन या लिपिड rafts का स्थानीयकरण के लिए Erythroblasts का धुंधला

  1. , पीबीएस में कोशिकाओं को धो 5 आरटी पर मिनट और सतह पर तैरनेवाला Aspirate के लिए 525 XG स्पिन.
  2. (निर्धारण समय विरोधी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं 15 मिनट के लिए पीबीएस में 3.7% formaldehyde के 500 μl में सेल छर्रों resuspending द्वारा कोशिकाओं को ठीक करेंजनरल जांच) और धीरे pipetting किया जा रहा है.
  3. 1.5 मिलीलीटर की प्लास्टिक ट्यूब पर स्थानांतरण और आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं.
  4. 20 सेकंड, सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे प्रत्येक ट्यूब और pipetting के लिए 500 μl पीबीएस जोड़कर एक धोने के प्रदर्शन के लिए एक बेंच microcentrifuge 2,000 XG पर स्पिन.
  5. 20 सेकंड, सतह पर तैरनेवाला Aspirate के लिए एक बेंच microcentrifuge 2,000 XG पर स्पिन और कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर ट्यूबों रखें. Permeablization 3.6-3.9 जल्दी से और कुशलता से किया जाना चाहिए, और आरटी पर कताई / आकांक्षा के बाद, सेल छर्रों तुरंत कोशिकाओं को बेहतर उनके अखंडता बनाए रखने के लिए आदेश में, बर्फ पर वापस रखा जाना चाहिए दोहराएँ.
  6. -20 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर से एसीटोन समाधान बाहर ले जाओ और बर्फ पर डाल दिया. धीरे 500 μl बर्फ ठंड 50% एसीटोन (DH 2 हे के साथ 1:1) और pipetting में पहली सेल छर्रों resuspending द्वारा कोशिकाओं permeabilize.
  7. बेंच microcentrifuge पर स्पिन 500 μl में 20 सेकंड, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल छर्रों के लिए 2,000 XG60; धीरे pipetting द्वारा ठंडा 100% एसीटोन.
  8. बेंच microcentrifuge पर स्पिन धीरे pipetting द्वारा 500 μl बर्फ ठंड 50% एसीटोन में एक बार और 20 सेकंड, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend सेल छर्रों के लिए 2,000 XG.
  9. बेंच microcentrifuge पर स्पिन 2,000 20 सेकंड के लिए XG, सतह पर तैरनेवाला Aspirate और धीरे pipetting द्वारा ठंड FACS बफर (पीबीएस + 0.5% बीएसए) में कोशिकाओं को एक बार धोने.
  10. ब्याज के अणुओं के लिए एंटीबॉडी या मार्कर के साथ लेबलिंग कॉकटेल तैयार: एर्य्थ्रोइद सेल धुंधला के लिए एफ actin धुंधला और 1 μl/100 μl Ter119-PECy7 के लिए 0.1 U/100 μl AF488-phalloidin. वैकल्पिक या अतिरिक्त धुंधला हो जाना भी (1:50), वायुसेना 594 संयुग्मित हैजा विष सबयूनिट बी लिपिड rafts लेबल करने के लिए (1:200), विरोधी pMRLC (Ser19) वायुसेना 488-विरोधी β-ट्यूबिलिन एंटीबॉडी का उपयोग किया जा सकता है phosphorylated मायोसिन विनियामक प्रकाश विरोधी खरगोश वायुसेना 488 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:400) द्वारा पीछा श्रृंखला (1:50), और विरोधी γ-tubu के लिए प्राथमिक एंटीबॉडीलिन प्राथमिक खरगोश एंटीबॉडी (1:100) विरोधी खरगोश वायुसेना 555 संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी (1:300) द्वारा पीछा किया.
  11. सतह पर तैरनेवाला आकांक्षा के बाद, धीरे मार्कर कॉकटेल, पिपेट की 100 μl में सेल छर्रों resuspend और आरटी पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
  12. परमाणु दाग ​​DRAQ5 के 2.5 माइक्रोन युक्त FACS बफर तैयार करें.
  13. बेंच microcentrifuge पर DRAQ5 युक्त 60 μl FACS बफर में 20 सेकंड, महाप्राण सतह पर तैरनेवाला और resuspend के लिए 2,000 XG नीचे स्पिन, FACS बफर में कोशिकाओं को धो लें.
  14. इमेजिंग पर चलाने के नमूने इमेजिंग के लिए विशिष्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रवाह cytometer का उपयोग, प्रयोग के अनुसार कम से कम 10,000 घटनाओं इकट्ठा पहले प्रकाशित 13 के रूप में कच्चे डेटा फ़ाइलों को क्षतिपूर्ति, और चित्रा 2 में दिखाया गया है परिणामों का विश्लेषण करने के लिए प्रवाह cytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

सबसे पहले, कोशिकाओं उनके Brightfield पहलू अनुपात (उनके प्रमुख धुरी की तुलना में उनके नाबालिग की लंबाई का अनुपात) और उनके Brightfield क्षेत्र (उनके आकार का संकेत) पर आधारित विश्लेषण कर रहे हैं. एक brightfield क्षेत्र मूल्य 20 से कम है और 200 से अधिक के साथ घटनाक्रम क्रमशः, ज्यादातर मलबा और सेल समुच्चय हैं, और विश्लेषण (2A चित्रा) से बाहर रखा गया है. एकल कक्षों (गेट "R1") तो छवि के तीखेपन को इंगित करता है जो ढाल आरएमएस पैरामीटर, के लिए अपने मूल्य के आधार पर विश्लेषण कर रहे हैं. गेट "R2" फोकस (चित्रा 2 बी) में अच्छी तरह से लिए गए चित्रों का चयन करने के क्रम में 50 वें प्रतिशतक से अधिक ढाल आरएमएस मूल्य के साथ युक्त कोशिकाओं बनाया जाता है. कोशिकाओं तो उनके Brightfield क्षेत्र द्वारा मापा के रूप में उनके आकार के आधार पर gated, और Ter119 फ्लोरोसेंट दाग मतलब पिक्सेल पैरामीटर द्वारा मापा एर्य्थ्रोइद मार्कर Ter119 के लिए उनकी सकारात्मकता (गेट "Ter119 सकारात्मक", चित्रा -2) कर रहे हैं. Ter119 के लिए बहुत कम या बहुत अधिक कोशिकाओं, क्रमशः गैर erythroids या शेष सेल समुच्चय, या तो कर रहे हैं, और विश्लेषण से बाहर रखा गया है. अगले चरण में, कोशिकाओं उनके DRAQ5 पहलू अनुपात तीव्रता (उनके नाभिक की प्रमुख धुरी तीव्रता बनाम नाबालिग का अनुपात) और DRAQ5 (चित्रा 2 डी) की तीव्रता के आधार पर चुने गए हैं. DRAQ5 नकारात्मक कोशिकाओं (ज्यादातर enucleated ऐसे reticulocytes और लाल रक्त कोशिकाओं के रूप में कोशिकाओं,), और एक कम DRAQ5 पहलू अनुपात (ज्यादातर दोहरी) के साथ कोशिकाओं के विश्लेषण से बाहर रखा गया है. DRAQ5 सकारात्मक कोशिकाओं (गेट "डीएनए सकारात्मक", ज्यादातर इस बात पर erythroblasts) तो इंगित करता है जो कोशिका के आकार, और उनके Ter119 मतलब पिक्सेल / क्षेत्र (Ter119 अभिव्यक्ति का घनत्व), जो इंगित करता है उनके Ter119 क्षेत्र पर आधारित विश्लेषण कर रहे हैं Ter119 धुंधला की चमक. Orthochromatic erythroblasts (गेट "OrthoE") छोटे, Ter119 हाय कोशिकाओं (चित्रा 2 ई) के रूप में पहचाने जाते हैं. अंत में, orthochro के एक subpopulationराजनयिक अत्यधिक कोशिकाओं enucleating में समृद्ध erythroblasts एम 01, और उच्च डेल्टा Centroid XY Ter119 द्वारा Brightfield चैनल में सेल छवि की मामूली धुरी / प्रमुख धुरी के अनुपात द्वारा गणना सेल बढ़ाव की एक माप है, जो कम Brightfield पहलू अनुपात, के द्वारा होती है प्रारंभिक Ter119 + reticulocyte और DRAQ5 + नाभिक (चित्रा 2 एफ में गेट "enucleating कोशिकाओं") के केंद्र के केंद्र के बीच की दूरी से परिभाषित किया गया है जो / DRAQ5,.

Ter119 खिलाफ एंटीबॉडी और डीएनए दाग DRAQ5 के साथ साथ, कोशिकाओं को भी लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण 7 के दौरान एफ actin के स्थानीयकरण का मूल्यांकन करने के लिए फ्लोरोसेंट phalloidin साथ filamentous actin (एफ actin) के लिए दाग दिया गया है. ध्यान से, स्पष्टीकरण की प्रगति एक कम पहलू अनुपात (यानी तेजी से लम्बी) के साथ कोशिकाओं के रूप में, तय कोशिकाओं में देखे जा सकते हैं और बढ़ती डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/Draq5 मनाया जाता है (चित्रure 3). एफ actin स्पष्टीकरण दौरान दरार कुंड पर ध्यान केंद्रित करने और फिर नाभिक निकाली जाती है एक बार फैलने के लिए मनाया जाता है. इसके अलावा, प्रारंभिक reticulocyte और नाभिक के बीच दरार कुंड में actin और मायोसिन की सह स्थानीयकरण cytometry pMRLC (phosphorylated मायोसिन विनियामक प्रकाश श्रृंखला) और एफ actin 7 गुम्मट erythroblasts के सह धुंधला के बाद मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह के द्वारा प्रदर्शन किया जा सकता है.

अन्य प्रोटीन और ब्याज की संरचना भी स्पष्टीकरण दौरान उनकी भूमिका की इमेजिंग अध्ययन की अनुमति देना उचित एंटीबॉडी या फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ दाग जा सकता है. फूट डालना microtubule गठन से पहले स्पष्टीकरण के लिए नहीं बल्कि colchicine (चित्रा -4 ए) के साथ इलाज erythroblasts में गुम्मट orthochromatic erythroblasts में दिख रहा है. केंद्रों के बीच पैरामीटर डेल्टा केन्द्रक XY BF/Draq5 मापने के द्वारा प्रदर्शन के रूप में colchicine द्वारा ट्यूबिलिन polymerization के निषेध, सेल ध्रुवीकरण घटता हैBrightfield चैनल और DRAQ5 (चित्रा 4 बी) के साथ हासिल की परमाणु धुंधला के केंद्र में देखा सेल शरीर के आतंकवाद.

गुम्मट या आरएसी की कमी (आनुवंशिक या pharmacologic हेरफेर के बाद) का उपयोग स्पष्टीकरण में आरएसी GTPases की भूमिका दिखाना है कि अनुमति दी इमेजिंग अध्ययन cytometry मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग प्रवाह में erythroblasts. आरएसी GTPases कम से कम हिस्से में एक actomyosin अंगूठी के गठन के साथ ही प्रारंभिक reticulocyte और pyrenocyte 7 के बीच कुंड में लिपिड rafts का संगम विनियमित.

चित्रा 1
चित्रा 1. पढ़ाई के लिए enucleating erythroblasts उत्पादन के क्रम में इस्तेमाल किया एरिथ्रोपोएसिस इन विट्रो प्रोटोकॉल के योजनाबद्ध प्रदर्शन. ए विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृति में लंबे समय तक initiatLDBM या लिन से एड -.. अत्यधिक शिराछदन द्वारा vivo में तनाव एरिथ्रोपोएसिस प्रेरण के बाद erythroblasts में समृद्ध splenocytes द्वारा शुरू की कोशिकाओं बी फास्ट स्पष्टीकरण परख इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
ब्याज की आबादी का आंकड़ा 2. डेटा कोशिकामापी इमेजिंग प्रवाह के लिए विशिष्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर के उपयोग का विश्लेषण. लगातार gating पैनलों वायुसेना में दिखाया गया है. कोष्ठक में संख्या इस प्रयोग में, इसी माता - पिता की आबादी का लगभग प्रतिशत इंगित करता है. R1 आबादी के प्रारंभिक gating सेल समुच्चय को हटाऔर सेलुलर मलबे. R1 से बाहर बी गेट R2 (R2 के बाहर). सी. Ter119 पॉजिटिव कोशिकाओं फोकस कोशिकाओं के बाहर छोड़कर स्पष्ट रूप से imaged किया गया है कि कोशिकाओं, शामिल Ter119 के लिए नकारात्मक या तो कर रहे हैं या कर रहे हैं कि कोशिकाओं को छोड़कर, चयन कर रहे हैं बहुत तीव्रता से सना हुआ क्योंकि समुच्चय में उनकी उपस्थिति की. (Ter119 पॉजिटिव कोशिकाओं के बाहर) डी. डीएनए पॉजिटिव कोशिकाओं परमाणु दाग की तीव्रता बनाम पहलू अनुपात तीव्रता के लिए साजिश रचने के बाद, चयनित हैं (यहां चैनल में पढ़ा DRAQ5 5). ई. डीएनए और Ter119 पॉजिटिव कोशिकाओं Ter119 एरिया बनाम Ter119 मतलब पिक्सेल में उनके स्थान पर आधारित है क्षाररागीय, polychromatophilic और orthochromatic erythroblasts में gated हैं (यहां चैनल में पढ़ा 3), मैक्ग्रा एट अल 5 द्वारा पहले से दिखाया गया है. एफ enucleating कोशिकाओं कम पहलू अनुपात (सेल elongat की एक माप है जो orthochromatic erythroblasts के बाहर उन कोशिकाओं रहे हैंbrightfield (बीएफ) चैनल) और उच्च डेल्टा Centroid XY Ter119/Draq5 Ter119 + reticulocyte और नाभिक के केंद्र के गठन के केंद्र के बीच (दूरी) में आयन. इस शोध मूल रूप से रक्त में प्रकाशित किया गया था: KONSTANTINIDIS महानिदेशक, Pushkaran एस, एट अल सिग्नलिंग और लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण रक्त में cytoskeletal आवश्यकताओं... 2012;. रुधिर के अमेरिकन सोसायटी द्वारा 119 (25) :6118-6127 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3. उत्तरोत्तर Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, और डी के साथ दाग डेल्टा Centroid XY Ter119/Draq5. WT माउस orthochromatic erythroblasts, बढ़ाने के साथ erythroblasts enucleating के प्रतिनिधि छवियाँraq5, उनके पहलू अनुपात और डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/Draq5 प्रति gated हैं. सेल (सही पर imaged सेल की स्थिति से पता चलता पीले फाटक के भीतर हरी क्रॉस) पहलू अनुपात कम है और डेल्टा केन्द्रक XY Ter119/Draq5 बढ़ाने के लिए मेल खाती है कि प्रगति के साथ, स्पष्टीकरण के अलग, लगातार चरणों में तय दिखाए जाते हैं. ऊपर से नीचे तक सेल छवियों में, एफ actin दरार कुंड पर ध्यान केंद्रित करने और (सेल # 4782 के रूप में दिखाया कम छवि पर) नाभिक निकाली जाती है एक बार फिर फैलने के स्पष्टीकरण के दौरान देखा जा सकता है. एक देखने के लिए यहां क्लिक करें इस आंकड़े का बड़ा संस्करण.

चित्रा 4
एक एकध्रुवीय microtubule विधानसभा और orthochroma के ध्रुवीकरण की चित्रा 4. गठनटिक erythroblasts स्पष्टीकरण पछाड़ दिया है. B-ट्यूबिलिन विस्तारपूर्वक 6 घंटे के लिए colchicine (5 माइक्रोन) के साथ incubated erythroblasts में सना हुआ है, जबकि ए Polarized microtubule गठन, (एंटी-B-ट्यूबिलिन-AlexaFluor-488 और परमाणु दाग DRAQ5 के साथ दाग) नियंत्रण गुम्मट erythroblasts में दिखाई दे रहा है तेजी से इन विट्रो स्पष्टीकरण परख में. बी मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो सेल शरीर के केंद्र के बीच की दूरी उपाय जो पैरामीटर डेल्टा Centroid XY BF/Draq5, के वितरण का विश्लेषण द्वारा सेल ध्रुवीकरण का एक मात्रात्मक मूल्यांकन की पेशकश कर सकते हैं उज्ज्वल क्षेत्र और DRAQ5 (इनसेट में योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व) के साथ हासिल की परमाणु धुंधला के केंद्र के रूप में देखा. Colchicine इलाज गुम्मट orthochromatic erythroblasts के डेल्टा Centroid BF/Draq5 मूल्यों सांख्यिकीय नियंत्रण डेल्टा Centroid BF/Draq5 मूल्यों (पी <0.001) की तुलना में काफी अलग हैं. इस शोध मूल रूप से Bloo में प्रकाशित किया गया थाडी:.. KONSTANTINIDIS महानिदेशक, Pushkaran एस, एट अल सिग्नलिंग और लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण में cytoskeletal आवश्यकताओं रक्त. 2012;. रुधिर के अमेरिकन सोसायटी द्वारा 119 (25) :6118-6127 में यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यह लाल रक्त कोशिकाओं पूर्व vivo की सफल, बड़े पैमाने पर उत्पादन प्राप्त करने के लिए कुशलता से पुन: पेश करने के लिए सबसे कठिन है कि इन विट्रो एरिथ्रोपोएसिस संस्कृतियों में कदम है, क्योंकि हाल के वर्षों में लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण का अध्ययन बढ़ती रफ्तार पकड़ ली है. हाल ही में जब तक ऊपर, लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका स्पष्टीकरण का अध्ययन मुख्य रूप से प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग किया और cytometry तरीकों प्रवाह. प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी तरीके, भाग लेने वाले अणुओं की पहचान करने में उपयोगी है, यद्यपि समय में एक खास बिंदु पर तय कोशिकाओं के सैकड़ों भीतर स्पष्टीकरण के दौर से गुजर orthochromatic erythroblasts की एक छोटी संख्या की पहचान करने के लिए सूक्ष्म अवलोकन के दिनों की आवश्यकता होती है. तरीकों प्रवाह cytometry, दूसरी ओर, एक संस्कृति में स्पष्टीकरण की दर है, साथ ही इस प्रक्रिया पर विशेष अणुओं की pharmacologic या आनुवंशिक हेरफेर के प्रभाव का मूल्यांकन करने में बहुत मददगार रहे हैं, लेकिन intracellul पर किसी भी डेटा प्रदान नहीं करते हैंइन अणुओं की गिरफ्तारी स्थानीयकरण.

यह प्रवाह cytometric और कोशिकाओं के कई हजारों पर शब्द के भागों डेटा दोनों के तेजी से अधिग्रहण की अनुमति देता है के बाद से मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो प्रवाह cytometry और immunofluorescence माइक्रोस्कोपी के लाभों को जोड़ती है. यह लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका भेदभाव के विभिन्न चरणों के बाद से (proerythroblasts, क्षाररागीय, polychromatophilic, और orthochromatic) रूपात्मक मापदंड 6 का उपयोग कर परिभाषित किया गया है, एरिथ्रोपोएसिस पढ़ाई में cytometry क्लासिक प्रवाह बनाम एक महत्वपूर्ण लाभ है. हालांकि, बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो बल्कि आबादी की संख्या में रिश्तेदार quantitation तुलना से सेलुलर संरचनाओं के दृश्य के लिए इष्टतम है. इस तरह की तुलना के लिए, intracellular संरचना immunofluorescence के लिए आवश्यक permeabilization कदम की आवश्यकता नहीं है कि दिनचर्या प्रवाह cytometry बेहतर प्रदर्शन करती है. उदाहरण के लिए BasoE के रिश्तेदार प्रतिशत: Polye: चित्रा 2 ई में OrthoE

इमेजिंग डेटा फाटकों के भीतर कुछ शब्द के भागों विशेषताओं के साथ कोशिकाओं के संग्रह की अनुमति, cytometer इमेजिंग प्रवाह के लिए विशिष्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा प्रवाह cytometry के सहयोग से कार्रवाई की जा सकती. लगभग एक सौ enucleating कोशिकाओं को और अधिक सार्थक टिप्पणियों और सांख्यिकीय मूल्यांकन की अनुमति, एक तेज और कुशल तरीके से 7 में ऊपर वर्णित विश्लेषण विधि के साथ 10,000 erythroblasts की आबादी में पहचाना जा सकता है.

इसके अलावा, इमेज प्रोसेसिंग डेल्टा Centroid XY के रूप में ऐसी विशेषताओं की मात्रात्मक विश्लेषण करने के नाभिक के रिश्तेदार की स्थिति जैसे अध्ययन करने की अनुमति cytometer इमेजिंग प्रवाह के लिए विशिष्ट विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ मदद की हैध्रुवीकरण का एक उपाय के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि कोशिका द्रव्य.

प्रोटोकॉल और समस्या निवारण के भीतर महत्वपूर्ण कदम

यह अच्छी तरह से भी कोमल pipetting reticulocyte और pyrenocyte 12 की जुदाई में परिणाम कर सकते हैं जाना जाता है. यह गंभीर रूप से imaged स्पष्टीकरण की घटनाओं की संख्या को सीमित करने की क्षमता है. संस्कृति में MS5 कोशिकाओं के लिए बाध्य erythroblasts उठाने खासकर जब नतीजतन, देखभाल, ले लिया जाना चाहिए.

Formaldehyde समाधान के साथ फिक्सेशन बाध्यकारी और / या वृद्धि की गैर विशिष्ट एंटीबॉडी बंधन में कमी आई विशिष्ट एंटीबॉडी में जिसके परिणामस्वरूप सतह मार्करों के बाह्य क्षेत्रों के लिए परिवर्तन का कारण बन सकता है. इमेजिंग प्रवाह का एक लाभ यह cytometer कि सतह धुंधला कल्पना है और इसकी गुणवत्ता इस प्रकार का मूल्यांकन किया जा सकता है. बिंदीदार, बजाय वर्दी के, ऐसे Ter119 के रूप में प्रचुर मात्रा में सतह मार्करों के लिए धुंधला overfixation इंगित करता है और कम formalde का मिश्रण के माध्यम से हल किया जाना चाहिएहाइड एकाग्रता और निर्धारण की छोटी अवधि.

निर्धारण के बाद कम से कम 15 मिनट के लिए बर्फ पर कोशिकाओं रखने की वजह से तापमान मतभेदों को permeabilization प्रक्रिया के दौरान अतिरिक्त सेल टूटना को रोकने के क्रम में महत्वपूर्ण है. एसीटोन permeabilization डिटर्जेंट की मध्यस्थता permeabilization से बेहतर नाजुक देर erythroids रखता है, 100% एसीटोन की आवश्यकता है, जहां कदम कोशिकाओं की एक ध्यान देने योग्य है, लेकिन हानिकारक नहीं, नुकसान होगा. अंत में, ठंड FACS बफर के साथ एक धोने के बाद, कोशिकाओं एंटीबॉडी ऊष्मायन चरणों के लिए कमरे के तापमान पर अनुमति दी जाती है.

इमेजिंग प्रवाह cytometer (दर बढ़ाई वृद्धि के रूप में कमी आई है) का इस्तेमाल किया लेंस के आधार पर प्रवाह की एक निर्धारित दर (कोशिकाओं / सेक) है. माप से पहले अंतिम धोने के बाद, यह सेल छर्रों नमूना के प्रसंस्करण में तेजी लाने के क्रम में, एक छोटी मात्रा (50-60 μl) में resuspended की सिफारिश की है. कि फिर से नमूनों की एक बड़ी संख्या के लिए(30 मिनट से अधिक) रन की लंबी अवधि गायकगण, नमूने बर्फ पर रखा जाना चाहिए.

लंबी अवधि के स्पष्टीकरण परख immunoblotting जैसे जैव रासायनिक मूल्यांकन के लिए स्पष्टीकरण मंच पर एकत्र और पुल चढ़ाव हो सकता है कि पर्याप्त कोशिकाओं का उत्पादन करने के क्रम में एक विस्तारित एर्य्थ्रोइद सेल उत्पादन का लाभ प्रदान करता है. एक माउस 4 दिन पहले प्रयोग करने phlebotomized होने की जरूरत है, हालांकि तेजी से स्पष्टीकरण परख, प्रदर्शन करने के लिए केवल 2 दिन की आवश्यकता के समय का लाभ देता है. हम दो तरीकों के बीच स्पष्टीकरण दक्षता में एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा है. 7 से पहले वर्णित के रूप में ध्यान से,, intracellular संरचना immunofluorescence के लिए आवश्यक permeabilization कदम की आवश्यकता नहीं है, जो मूल्यांकन प्रवाह cytometry, स्पष्टीकरण दक्षता के मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए सबसे उपयुक्त है.

तकनीक की सीमाएं

विधि यहाँ यूटीआई वर्णितlizes एर्य्थ्रोइद आबादी बढ़ाना और स्पष्टीकरण के स्तर पर उन्हें सिंक्रनाइज़ करने के क्रम में इन विट्रो में hydrocortisone युक्त मध्यम में विवो और संस्कृति में तनाव एरिथ्रोपोएसिस प्रेरित किया. इन दोनों स्थितियों के होने की संभावना तनाव में लाल रक्तकणों को जन्म देने वाली कोशिका-स्पष्टीकरण की नकल. इसके अलावा, hydrocortisone काफी एर्य्थ्रोइद उपज और अस्तित्व बढ़ जाती है. Hydrocortisone (इसलिए परहेज तुल्यकालन) के बिना स्थिर राज्य एरिथ्रोपोएसिस और सुसंस्कृत साथ जंगली प्रकार चूहों से ली गई अस्थि मज्जा की कोशिकाओं से स्पष्टीकरण की घटनाओं के समान उपज प्राप्त करने के लिए, हम कई चूहों से संस्कृति कोशिकाओं की जरूरत है और चलाने के लिए और बहु ​​के माध्यम से एक बहुत अधिक घटनाओं की प्रक्रिया होगी वर्णक्रमीय इमेजिंग फ्लो. मल्टी स्पेक्ट्रल इमेजिंग फ्लो 60x अप करने के लिए बढ़ाई लेंस का उपयोग बेहद immunofluorescence माइक्रोस्कोपी की तुलना में रूपात्मक डेटा के संग्रह accelerates हालांकि, इमेजिंग द्वारा प्राप्त टिप्पणियों की तुलना, क्लासिक, Z-ढेर के साथ प्रवाह cytometer100x और जेड ढेर छवियों उसी में cytometer इमेजिंग प्रवाह से प्राप्य नहीं है जो संरचनाओं के एक 3 आयामी छाप, देने के लिए एक माइक्रोस्कोप में ऑब्जेक्टिव लेंस बढ़ाई प्रदान कर सकते हैं के बाद से और confocal माइक्रोस्कोपी छवियों, बेहतर विस्तार से प्राप्त करने के लिए मूल्यवान है सेल. प्रयोग cytometry एक बहु - वर्णक्रमीय इमेजिंग प्रवाह में एकत्र समान कोशिकाओं के सापेक्ष उच्च संख्या, एक यादृच्छिक उन्मुखीकरण पर, आंशिक रूप से एक अलग दृष्टिकोण से टिप्पणियों की अनुमति इस सीमा क्षतिपूर्ति.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा.

Acknowledgments

लेखकों विशेषज्ञ तकनीकी सहायता के लिए Amnis निगम (ईएमडी Milllipore का हिस्सा) से सिनसिनाटी बच्चों के अस्पताल रिसर्च फाउंडेशन और रिचर्ड डिमार्को, Sherree दोस्त है, और स्कॉट मोर्दकै पर रिसर्च फ्लो कोर धन्यवाद. इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा समर्थित किया गया K08HL088126 और R01HL116352 (TAK) अनुदान और P30 DK090971 (YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM medium CellGro 15-012-CV
IMDM medium Hyclone (Thermo Scientific) SH30228.01
Stempro-34 SFM GIBCO (Life Tech) 10640
Stempro-34 nutrient supplement GIBCO (Life Tech) 10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals 512450
BIT9500 Stemcell Technologies 09500
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS) Hyclone (Thermo Scientific) SH30028.02
Penicillin/Streptomycin Hyclone (Thermo Scientific) SV30010
L-glutamine Hyclone (Thermo Scientific) SH30590.01
Isothesia (Isoflurane) Butler-Schein 029405
Histopaque 1.083 mg/ml Sigma 10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) BD Biosciences 555899
Acetone Sigma-Aldrich 534064
Formaldehyde Fisher Scientific BP 531-500
Hydrocortisone Sigma H4001
Stem Cell Factor (SCF) Peprotech 250-03
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech 213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) AMGEN available by pharmacy
CD44-FITC antibody BD Pharmingen 553133
CD71-FITC antibody BD Pharmingen 553266
Ter119-PECy7 antibody BD Pharmingen 557853
Phalloidin-AF488 Invitrogen (Life Technologies) A12379
β-tubulin-AF488 antibody Cell Signaling #3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A21428
AF594-cholera toxin B subunit Invitrogen (Life Technologies) C34777
pMRLC (Ser19) antibody Cell Signaling #3671
γ-tubulin antibody Sigma T-3559
Syto16 Invitrogen (Life Technologies) S7578
Draq5 Biostatus DR50200
Ferrous sulfate Sigma F7002
Ferric nitrate Sigma F3002
EDTA Fisher Scientific BP120500
15-ml tubes BD Falcon 352099
50-ml tubes BD Falcon 352098
6-well plates BD Falcon 353046
24-well plates BD Falcon 351147
Flow tubes BD Falcon 352008
Tuberculin syringe BD 309602
Insulin syringe BD 329461
Syringe needle 25-G 5/8 BD 305122
Capped flow tubes BD 352058
40-μm cell strainer BD Falcon 352340
Scalpel (disposable) Feather 2975#21
FACS Canto Flow Cytometer BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter Drew Scientific CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Mini Mouse Bench centrifuge Denville C0801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics