Identifikation af en murine erythroblast delpopulation beriget Enucleating Begivenheder af Multi-spektral Imaging Flowcytometri

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Den foreliggende protokol beskriver en hidtil ukendt fremgangsmåde til identificering af en population af enucleating orthochromatic erytroblaster af multi-spektral billeddannelse flowcytometri, hvilket giver en visualisering af erythroblast enucleation processen.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konstantinidis, D. G., Pushkaran, S., Giger, K., Manganaris, S., Zheng, Y., Kalfa, T. A. Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (88), e50990, doi:10.3791/50990 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Erythropoiese i pattedyr slutter med den dramatiske proces enucleation, der resulterer i reticulocyt-formation. Mekanismen af ​​enucleation er endnu ikke fuldt belyst. Et fælles problem, når man studerer lokalisering af vigtige proteiner og strukturer inden enucleating erytroblaster ved mikroskopi er vanskeligheden ved at observere et tilstrækkeligt antal celler undergår enucleation. Vi har udviklet en ny analyse protokol hjælp multiparameter højhastigheds-cell imaging i flow (Multi-Spectral Imaging Flowcytometri), en metode, der kombinerer immunofluorescent mikroskopi med flowcytometri, for at identificere effektivt et betydeligt antal enucleating begivenheder, der gør det muligt at få målinger og statistisk analyse.

Vi først beskrive her to in vitro erythropoiese dyrkningsfremgangsmåder anvendes for at synkronisere murine Erytroblaster og øge sandsynligheden for at fange enucleation på the tid for evaluering. Derefter, vi beskriver i detaljer, farvning af erytroblaster efter fiksering og permeabilisering for at studere lokalisering af intracellulære proteiner eller lipidklumper under enucleation af multi-spektral billeddannelse flowcytometri. Sammen med størrelse og DNA/Ter119 farvning, som anvendes til at identificere de orthochromatic Erytroblaster anvender vi parametrene "aspect ratio" af en celle i den lyse felt kanal, der hjælper i anerkendelsen af ​​aflange celler og "delta tyngdepunkt XY Ter119/Draq5 ", der muliggør identifikation af cellulære begivenheder, hvor centrum af TER119 farvning (spirende reticulocyt) er langt fra centrum af DRAQ5 farvning (kerne undergår ekstrudering), hvilket indikerer således en celle ved at enucleate. Den delmængde af orthochromatic erythroblast befolkning med høj delta tyngdepunkt og lav skærmformat er stærkt beriget i enucleating celler.

Introduction

Terminal differentiering i erythroid afstamning i pattedyr slutter med den dramatiske proces enucleation, hvorigennem orthochromatic erythroblastslægtskolonierne ekskluderer sin membran-indkapslet kerne (pyrenocyte) 1, genererer en reticulocyt 2. Den nøjagtige mekanisme af denne proces, som også er det hastighedsbegrænsende trin for vellykket stor skala produktion af røde blodlegemer in vitro, endnu ikke er fuldt belyst. Lokaliseringen af vigtige proteiner og strukturer inden enucleating Erytroblaster bygger på anvendelsen af fluorescerende og elektronmikroskopi 3-5. Denne kedelig proces resulterer typisk i identifikationen af ​​et begrænset antal enucleation begivenheder, og ikke altid tillader meningsfuld statistisk analyse. Udvidelse på en metode til erythroblast identifikation tidligere beskrevet af McGrath et al. 6, har vi udviklet en ny tilgang til at identificere og studere enucleation begivenheder ved Multi-Spectral ImaGing Flowcytometri (multiparameter high-speed cell imaging i flow, en metode, der kombinerer fluorescerende mikroskopi med flowcytometri) 7, som kan give et tilstrækkeligt antal observationer til at opnå målinger og statistisk analyse.

Her beskriver vi to første in vitro erytropoiese kultur metoder, der anvendes med henblik på at synkronisere erytroblaster og øge sandsynligheden for at opfange enucleation på tidspunktet for evalueringen. Så vi beskriver i detaljer farvning af erytroblaster efter fiksering og permeabilisering for at studere lokalisering af intracellulære proteiner eller lipidklumper under enucleation af multi-spektral billeddannelse flowcytometri.

Prøverne køres på en imaging flowcytometer og de ​​indsamlede celler gated hensigtsmæssigt at identificere orthochromatic erythroblaster 6. Orthochromatic erytroblaster analyseres derefter på grundlag af deres skærmformat, som målt i lysfelt imaging versus deres værdi for parameteren delta centroid XY TER119-DNA, som er defineret som afstanden mellem centrene af de områder, farvet for TER119 og DNA, hhv. Den population af celler med lav aspect ratio og høj delta tyngdepunkt XY Ter119/DNA er stærkt beriget i enucleating celler. Brug vildtype (WT) erythroblaster versus erytroblaster med MX-Cre medieret betinget sletning af Rac1 på Rac2 - / - eller kombineret Rac2 - / -; Rac3 - / - genetisk baggrund, og denne roman analyse protokol af multi-spektral billeddannelse flowcytometri, vi for nylig vist, at enucleation ligner asymmetrisk cytokinese og at dannelsen af en actomyosin ring reguleres delvist af Rac GTPaser er vigtigt for enucleation progression 7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1.. Langsigtet In vitro Erythropoiesis Kultur (Ex vivo erytroid Differentiering Culture protokol ved Giarratana et al. 8. Ændret og tilpasset til museceller)

Dette er en 3-trins langsigtede in vitro erythropoiese protokol. I det første trin (dage 0-4) 2 x 10 5 celler / ml anbringes i erythroblastslægtskolonierne vækstmedium suppleret med stamcellefaktor (SCF), interleukin-3 (IL-3) og erythropoietin (Epo). I det andet trin (dage 5-6) cellerne resuspenderet ved 2 x 10 5 celler / ml og co-dyrket på adhærente stroma-celler (MS5) i frisk erythroblastslægtskolonierne vækstmedium suppleret kun Epo. I det tredje trin (dag 7-9), celler dyrkes på et lag af MS-5-celler i frisk erythroblastslægtskolonierne vækstmedium uden cytokiner op til enucleation (figur 1A).

Alle animalske protokoller blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) afCincinnati Children Hospital Medical Center.

  1. Høst af knogler og isolering af lav massefylde knoglemarvsceller
    1. Tilsæt 2 ml steril IMDM indeholdende 2% føtalt bovint serum (FBS) i en 15 ml konisk rør og holde på is.
    2. Aflive en 2-6 måneder gammel vildtype C57/BL6 mus (sammen med eller uden genetisk målrettet mus af interesse) efter institution-godkendte protokol (fx CO 2 indånding, efterfulgt af cervikal dislokation).
    3. Isoler bækken knogler, lårben og skinneben af ​​begge ben ved hjælp af pincet og skalpel, føje dem til rør indeholdende IMDM +2% FBS og holde på is.
    4. Tilsæt 1 ml IMDM +2% FBS i en steril flow-cytometri rør og skyl knogler ved hjælp af pincet og tuberculinsprøjte med en 25-G x 5/8 "nål. Flush IMDM +2% FBS gennem knoglerne et par gange forsigtigt ( ved sugning ~ 500 pi fra cellesuspensionen og skylning igen gennem knoglen), og indsamle de knoglemarvsceller, i flow-cytometry røret. Flushing er komplet, når knoglerne ser hvide ud.
    5. Foretage celle-suspensionen gennem en 40 um cellefilter sæt på toppen af ​​en 50 ml konisk rør. Vask cellefilter med IMDM +2% FBS og ved hjælp af det samme medium justere slutvolumen cellesuspension til 5 ml.
    6. Forbered lav massefylde knoglemarvsceller (LDBM) ved densitetsgradientcentrifugering: omhyggeligt lag de 5 ml celle-suspension på 5 ml densitetsgradient celleseparation medium 1.083 g / ml i et 15 ml rør, og centrifugering ved 750 xg i 25 minutter ved stuetemperatur (RT) uden bremse / lav acceleration.
    7. Transfer supernatant (alt op til ca 2 ml-mærket af 15-ml rør for at opnå buffy coat) til et nyt 15 ml glas og udføre en mere vask med IMDM +2% FBS ved 525 xg i 5 minutter ved RT.
    8. Aspirer supernatanten og lysere eventuelle resterende røde blodlegemer (RBC) ved at suspendere pellet i 3 ml RBC-puffer i 5 minutter ved stuetemperatur. Hvis en større renhed af erytroblaster erkræves på det sidste trin (fx til biokemiske undersøgelser), rense LDBM celler videre på dette trin til Lin neg celler ved magnetisk separation.
  2. Ex vivo erythroid differentiering kultur protokol, som begynder fra LDBM eller Lin neg-celler (figur 1A)
    1. Tilføj 7 ml IMDM +2% FBS, centrifugering ved 525 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, og resuspenderes pelleterede celler i 2 ml erythroblast vækstmedium (EGM), bestående af:
      en. StemPro-34 medium, som indeholder
      b.. 2,6% StemPro-34 medium supplement,
      ca. 20% BIT-9500,
      d.. 900 ng / ml ferrosulfat,
      e. 90 ng / ml ferrinitrat,
      f. 100 enheder / ml penicillin / streptomycin, 2 mM L-glutamin
      g. 10 -6 M hydrocortison
      time. og frisk tilsat cytokiner:
      i) 100 ng / ml SCF
      ii) 5 ng / ml IL-3, og
      iii) 3 IE / ml Epo.
    2. Tæl celler under anvendelse af en automatiseret celletæller eller manuelt på et mikroskop ved hjælp af en sømocytometer.
    3. Plade i en 6-brønds cellekultur plade ved en koncentration på 5 x 10 5 celler / brønd til et slutvolumen på 2,5 ml i EGM (2 x 10 5 LDBM celler / ml) og inkuberes ved 37 ° C (dette betragtes som dag # 0 af kultur).
    4. Skift medium ved sugning 1,5 ml af supernatanten centrifugering ved 525 xg i 5 minutter ved stuetemperatur, resuspendering i 1,5 ml frisk medium indeholdende alle tre cytokiner og tilføje tilbage til brøndene hver dag på dag nr. 2, 3, 4, for at optimere proliferative fase. På dag 3, fjerne alle celler, tælle og opdelt i passende antal brønde for at opretholde såvel celle koncentrationer af ~ 2 x 10 5 celler / ml. Oprethold kultur ved 37 ° C / 5% CO2.
    5. På dag 4 plade MS5-celler (murine stromale cellelinie) til brønde i en ny cellekultur 6-brønds plade. Den MS5 cellekulturmediet er α-MEM indeholdende 20% FBS, 100 enheder / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin.
    6. På dag 5, tælle antallet afceller (nu er væsentligt beriget Erytroblaster) i hver brønd af den oprindelige kultur pladen ved hjælp af en automatiseret celletæller eller manuelt på et mikroskop under anvendelse af et hæmocytometer.
    7. Løft alle celler fra hver brønd og overførsel til 15 ml koniske rør, spin ned ved 525 x g i 5 minutter ved stuetemperatur aspireres supernatanten og opløse pellets med frisk EGM kun indeholder Epo (3 IE / ml) til en koncentration på 2 x 10 5 celler / ml.
    8. Aspirer supernatanten fra brøndene, hvor MS-5-celler udpladet den foregående dag (målrettet til 70-80% konfluens ved co-kultur) og tilføje erythroide celler i disse brønde i EGM kun indeholder Epo (dog ikke deres medium valg, MS-5-celler overlever godt i EGM flere dage).
    9. Skift medium tilføje nyt EPO på dag nr. 6.
    10. Skift medium på dag nr. 7, ved hjælp af EGM uden tilsat cytokiner. På dage, 7 til 9, prøverne, til enucleation med flowcytometri efter farvning med anti-TER119 og syto-16 dagligt og proceed farvning prøver til Multi-Spectral Imaging Flowcytometri (som beskrevet i afsnit 3).
      Bemærk:. Før plating og på dag 2, 4, 6, og 7 i kultur, overvåge dyrkede celler til erythroblast berigelse og differentiering med flowcytometri ved at vurdere overflademarkører CD44 og TER119 vs størrelse (FSC) 9. Alternativt CD71, TER119 og FSC kan også anvendes 10, 11.

2.. Hurtig Enucleation Assay, Ifølge protokollen Beskrevet af Yoshida et al. 12 med ændringer (figur 1B)

  1. Stress erytropoiesis induktion og stroma forberedelse celle til in vitro erythropoiesis kultur
    1. Bedøver en 2-6 måneder gammel vildtype C57/BL6 mus per IACUC retningslinjer (fx med isofluran opløsning). Sørg for, at musen er blevet tilstrækkeligt bedøvet ved at kontrollere for fraværet af refleksive reaktioner på en blid hind-pote knivspids ogregelmæssige respirations under proceduren. Brug dyrlæge oftalmologiske salve på øjnene for at forhindre tørhed, mens under anæstesi.
    2. Fremkalde stress erythropoiesis via hale blødning til et slutvolumen på 500 ul. Ved hjælp af en insulinsprøjte, injicere tilsvarende volumen normalt saltvand intraperitonealt for at sikre væske genoplivning af dyret (hold dyr i Trendelenburg position før injektion og injicere i underlivet, så for ikke at beskadige de indre organer).
    3. Lad ikke mus uden opsyn, indtil det har genvundet motorstyring som indikeret af dyret begynder at bevæge sig rundt i buret og være i stand til at stå og gå uden at falde. Den phlebotomized mus er placeret i et bur uden andre mus.
    4. Efter 2 dage plade MS-5-celler i brøndene i en 24-brønds cellekultur plade. Inkuber MS-5-celler ved 37 ° C / 5% CO2 i MS5 celle medium (a-MEM indeholdende 20% FBS, 100 enheder / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin) for at med målet være 70-80 % sammenflydende in brønde efter 48 timer.
  2. Høst af milt og behandling af splenocytter
    1. Fire dage (96 h) efter stress erythropoiese induktion, aflive tidligere blødte musen gennem IACUC-godkendte protokol (fx CO 2 inhalation efterfulgt af cervikal dislokation).
    2. Harvest milt og sætte det i en 15 ml konisk rør indeholdende IMDM 2% FBS og holde på is.
    3. Tilbage i laboratoriet, i vævskultur hætte under sterile forhold, vendes milt-holdige rør på en 40-um cellefilter sæt på toppen af ​​en 50-ml rør. Crush milten ved hjælp af stemplet i et 5 ml plastsprøjte.
    4. Vask cellefilter med IMDM +2% FBS og ved hjælp af det samme medium, det endelige rumfang justeres cellesuspension til 5 ml.
    5. Lag forsigtigt 5 ml splenocyt suspension på 5 ml densitetsgradient celleseparation medium 1.083 g / ml i et 15 ml rør, og centrifugering ved 750 xg i 25 minutter ved stuetemperatur uden bremse / lav acceleration.
    6. TransferSupernatanten (opløsning ned til omkring 2 ml-mærket af 15-ml rør for at opnå buffy coat) til et nyt 15 ml glas og udføre en mere vask med IMDM +2% FBS ved 525 xg i 5 minutter ved stuetemperatur .
    7. Aspirer supernatanten og lyserer røde blodlegemer ved at suspendere pellet i 3 ml RBC-puffer i 5 minutter ved stuetemperatur.
    8. Tilsættes 7 ml IMDM +2% FBS at vaske cellerne og til at fortynde og neutralisere RBC lysis buffer og centrifugering ved 525 xg i 5 minutter ved 4 ° C.
    9. Aspirer supernatanten og suspendere pelleterede celler i 2 ml erythroblastslægtskolonierne vækstmedium (EGM).
  3. Kultur af de isolerede lav densitet splenocytter, beriget med erytroblaster, på plast (første trin af hurtige in vitro erythropoiesis kultur)
    1. Tæl celler på et automatiseret celle counter eller manuelt af en hemocytometer. Sædvanlige antal celler isoleret per milt på dette stadium er ~ 15 x 10 6.
    2. Suspendere cellerne yderligere i EGM indeholder cytokiner (ved foner, koncentrationer): SCF 50 ng / ml, IL-3 5 ng / ml, og Epo 2 U / ml.
    3. Plate 1-5 x 10 6 celler i et slutvolumen på 1 ml / brønd (samme antal celler per brønd afhængigt totale antal celler), i en 24-brønds cellekultur plade og inkuber O / N ved 37 ° C / 5% CO2.
  4. Kultur erytroblaster på MS5 celler (anden fase af hurtige in vitro erythropoiesis kultur
    1. Aspirer supernatanten fra plasten godt og løfte cellerne (højt beriget i erytroblaster) ved tilsætning af 2 ml kold 10 mM EDTA i PBS i 5 minutter på is til hver brønd.
    2. Put celler i friske rør, vask en gang i EGM (uden cytokiner), og resuspenderes i det samme.
    3. Plate 5 x 10 5 -1 x 10 6 celler i en 1-2 ml volumen hver MS5 celle-belagt brønd i en 24-brønds plade. Hvis farmakologiske inhibitorer bliver brugt i forsøget, tilføje dem i passende koncentrationer nu.
    4. Inkuber i 6 til 8 time (tid styret afmikroskopisk observation af cirka 30% -40% enucleation i den ubehandlede WT prøve). Den binding af erytroblaster til MS-5-celler accelererer deres enucleation.
    5. Løft celler fra hver brønd ved tilsætning af 2 ml kold PBS + 10 mM EDTA, 5 min på is. Sammen med erythroblaster vil MS-5-celler også blive indsamlet, men disse kan senere nemt udelukkes ved flowcytometrisk analyse som FSC hi TER119 - celler.
    6. På dette stadium, kan cellerne fikseres og farves til analyse af Multi-Spectral Imaging flowcytometri.

3.. Farvning af erythroblaster til lokalisering af intracellulære proteiner eller lipidklumper Under Enucleation af Multi-spektral Imaging Flowcytometri

  1. Vask cellerne i PBS, spinde 525 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og aspirat supernatant.
  2. Lave celler ved at resuspendere cellepellets i 500 pi 3,7% formaldehyd i PBS i 15 min (fiksering kan variere afhængigt af antigen, som testes) og pipettering forsigtigt.
  3. Overførsel til 1,5 ml plastik-centrifugerør og inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur.
  4. Spin på en bænk mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og udføre en vask ved at tilsætte 500 pi PBS til hvert rør og pipettering forsigtigt.
  5. Spin på en bænk mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og holde rørene på is i mindst 15 minutter. Permeablization trin 3,6-3,9 bør ske hurtigt og effektivt, og efter spinning / aspiration ved RT bør cellepelleter straks sættes tilbage på is, for at celler til bedre bevare deres integritet.
  6. Tag acetoneopløsninger ud fra -20 ° C fryser og lagt på is. Permeabilisere celler ved at resuspendere cellepellets første i 500 pi iskold 50% acetone (1:1 med dH2O) og pipettering forsigtigt.
  7. Spin på bænken mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og resuspender cellepellets i 500 pi60, iskold 100% acetone ved pipettering forsigtigt.
  8. Spin på bænken mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og resuspender cellepelleter endnu en gang i 500 pi iskold 50% acetone ved pipettering forsigtigt.
  9. Spin på bænken mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og vaske cellerne en gang i koldt FACS buffer (PBS + 0,5% BSA) ved pipettering forsigtigt.
  10. Forbered mærkning cocktail med antistoffer eller markører for molekyler af interesse: 0,1 U/100 pi AF488-phalloidin for F-actinfarvning og 1 μl/100 pi TER119-PECy7 for erythroidcellespecifik farvning. Alternative eller supplerende farvning kan også gøres ved hjælp af AF-488-anti-β-tubulin antistof (01:50), AF-594-konjugeret kolera toksin subunit B at mærke lipidklumper (1:200), anti-pMRLC (Ser19) primære antistof til phosphorylerede myosin regulerende let kæde (01:50), efterfulgt af anti-kanin-AF-488-konjugeret sekundært antistof (1:400), og anti-γ-Tubulin primære kanin-antistof (1:100), efterfulgt af anti-kanin-AF-555-konjugeret sekundært antistof (1:300).
  11. Efter supernatanten aspiration, resuspenderes cellepellets i 100 ul af markør cocktail, pipette forsigtigt og inkuberes i 30 minutter ved stuetemperatur.
  12. Forbered FACS buffer indeholdende 2,5 uM af den nukleare pletten DRAQ5.
  13. Vask cellerne i FACS buffer, spin ned på bænken mikrocentrifuge 2.000 xg i 20 sek, aspireres supernatanten og resuspender i 60 ul FACS buffer indeholdende DRAQ5.
  14. Kør prøver på billedtromlen flowcytometer at indsamle mindst 10.000 begivenheder pr eksperiment kompensere rådatafiler som tidligere publiceret 13. og analysere resultaterne som vist i figur 2, ved hjælp af analyse software specifikt til billeddannelse flowcytometer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Først analyseres cellerne baseret på deres Brightfield Aspect Ratio (forholdet mellem længden af ​​deres ringe versus deres hovedakse), og deres Brightfield Area (betegnende for deres størrelse). Begivenheder med en Brightfield Area-værdi lavere end 20, og over 200 er for det meste snavs og celleaggregater henholdsvis og er udelukket fra analysen (figur 2A). Enkelte celler (gate "R1") er derefter analyseret på grundlag af deres værdi for Gradient RMS parameter, hvilket indikerer skarphed på billedet. Gate "R2" er skabt indeholder celler med Gradient RMS værdi mere end de 50 percentil for at vælge de billeder taget godt i fokus (figur 2B). Celler bliver derefter gated baseret på deres størrelse målt ved deres Brightfield område og deres positivitet for erythroide markør TER119 målt ved TER119 fluorescerende plet-Mean Pixel parameter (gate "TER119 positiv", figur 2C). Celler meget lave eller meget høje for TER119, er enten ikke-erythroids eller resterende celleaggregater henholdsvis og er udelukket fra analysen. I det næste trin, er cellerne udvalgt baseret på deres DRAQ5 Aspect Ratio Intensitet (forholdet mellem den mindreårige versus hovedakse intensiteten af deres kerne), og intensiteten af DRAQ5 (Figur 2D). DRAQ5 negative celler (oftest tømte celler, såsom reticulocytter og RBC), og celler med lav DRAQ5 Aspect Ratio (hovedsagelig dubletter) er udelukket fra analysen. DRAQ5 positive celler (gate "DNA positive", for det meste Erytroblaster på dette tidspunkt) analyseres derefter baseret på deres TER119 området, som angiver størrelsen af ​​cellen og deres TER119 Mean Pixel / Area (densitet TER119 udtryk), der angiver lysstyrke TER119 farvning. Orthochromatic erytroblaster (gate "OrthoE") anerkendes som små, TER119 hi celler (Figur 2E). Endelig en subpopulation af orthochromatic erytroblaster stærkt beriget i enucleating celler er karakteriseret ved lav Brightfield Aspect Ratio, som er en måling af celleforlængelse, beregnet som forholdet mellem lilleaksen / hovedakse af cellen billede i Brightfield kanal M01, og ved høj Delta Centroid XY TER119 / DRAQ5, som er defineret af afstanden mellem midten af den begyndende TER119 +-reticulocyt-og centrum af DRAQ5 +-kerne (gate "enucleating celler" i figur 2F).

Sammen med antistof mod TER119 og DNA-plet DRAQ5 er cellerne også blevet farvet for filamentøse actin (F-actin) med fluorescerende phalloidin at vurdere lokalisering af F-actin i erythroblastslægtskolonierne enucleation 7. Af note, kan en progression af enucleation visualiseres i de faste celler, som celler med en aftagende aspekt ratio (dvs. stadig aflange) og stigende delta tyngdepunkt XY Ter119/Draq5 overholdes (Figure 3). F-actin er observeret til at koncentrere sig på spaltningen fure i enucleation og derefter sprede når kernen ekstruderes. Desuden kan co-lokalisering af actin og myosin ved spaltning fure mellem begyndende reticulocyt og kerne påvises ved multi-spektral billeddannelse flowcytometri efter co-farvning af WT erythroblaster for pMRLC (phosphoryleret myosin regulerende let kæde) og F-actin 7.

Andre proteiner og strukturer af interesse kan også farves med passende antistoffer eller fluorescerende markører for at tillade billeddiagnostiske undersøgelser af deres rolle under enucleation. Polariseret mikrotubulusdannelse er synlig i WT orthochromatic Erytroblaster før enucleation men ikke i Erytroblaster behandlet med colchicin (figur 4A). Inhibering af tubulinpolymerisation af colchicin formindsker cellepolarisering, som påvises ved at måle parameteren delta centroid XY BF/Draq5 mellem center i cellen kroppen ses i Brightfield kanal og centrum af den nukleare farvning opnås med DRAQ5 (figur 4B).

Udnytte WT eller Rac-mangel (efter genetisk eller farmakologisk manipulation) erythroblaster i multi-spektral billeddannelse flowcytometri tilladte billeddiagnostiske undersøgelser, der viser betydningen af ​​Rac GTPaser i enucleation. Rac GTPaser regulere i det mindste delvis dannelsen af et actomyosin ring samt sammenløbet af lipidklumper i furen mellem begyndende reticulocyt og pyrenocyte 7.

Figur 1
Figur 1.. Skematisk demonstration af erytropoiese in vitro protokoller, der anvendes for at producere enucleating erytroblaster til undersøgelser. A. Langsigtet in vitro erythropoiesis kultur initiated fra LDBM eller Lin -.. celler B. Fast enucleation assay indledt af splenocytter højt beriget i erytroblaster efter stress erytropoiesis induktion in vivo ved tapning Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2.. Analyse af data udnytte analyse software specifikt for imaging flowcytometret. Successiv gating af bestandene af interesse er vist i paneler AF. Tallet i parentes angiver det omtrentlige procent af den tilsvarende forælder befolkning, i dette eksperiment. A. Indledende gating af R1 befolkning fjerner celleaggregaterog celleaffald. B. Gate R2 ud af R1 omfatter de celler, der er blevet afbildet tydeligt, undtagen ude af fokus celler. C. TER119-positive celler (ud af R2) er valgt, bortset fra celler, der enten er negative for TER119 eller som for intenst farvet på grund af deres tilstedeværelse i aggregater. D. DNA-positive celler (ud af TER119-positive celler) er valgt, efter at plotte til Aspect Ratio Intensitet kontra intensiteten af den nukleare pletten (her DRAQ5 læse i kanal 5). E. DNA-og TER119-positive celler gated i basofile, polychromatophilic og orthochromatic erytroblaster baseret på deres placering i TER119 Mean Pixel versus TER119 Samarbejdsområde (her læses i kanal 3), som vist tidligere af McGrath et al 5.. F. enucleating celler er de celler ud af de orthochromatic erythroblaster, som har lav Aspect Ratio (en måling af celle elongation i lysfelt (BF) kanal) og høj Delta Centroid XY Ter119/Draq5 (afstanden mellem centrum for dannelse TER119 +-reticulocyt og centrum for kerne). Denne forskning blev oprindeligt udgivet i Blod: Konstantinidis DG, Pushkaran S, et al signalering og cytoskeletal krav erythroblast enucleation Blood... 2012;. 119 (25) :6118-6127 af American Society of Hematology Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3
Figur 3.. Repræsentative billeder af enucleating erytroblaster med gradvis stigende Delta Centroid XY Ter119/Draq5. WT mus orthochromatic erytroblaster, farves med TER119-PECy7, phalloidin-AF488, og Draq5 er gated pr deres aspekt ratio og delta tyngdepunkt XY Ter119/Draq5. Er vist cellerne fikseret på forskellige successive stadier af enucleation med en progression, der svarer til faldende formatforhold og stigende delta centroid XY Ter119/Draq5 (grøn-indlæg i gul port viser positionen af ​​cellen afbildet til højre). I cellen billederne fra top til bund, kan der observeres F-actin under enucleation at koncentrere sig på kavalergang fure og derefter sprede når kernen er ekstruderet (som vist i celle # 4782 på det nederste billede). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4.. Dannelse af en unipolær mikrotubulusaggregering og polarisering af orthochromatic erytroblaster forud enucleation. A. Polarized mikrotubulusdannelse er synlig i kontrol WT erytroblaster (farvet med anti-b-tubulin-AlexaFluor-488 og den nukleare pletten DRAQ5), mens b-tubulin diffust farves i erythroblaster inkuberet med colchicin (5 uM) i 6 timer i den hurtige in vitro enucleation assay. B. multi-spektral billeddannelse flowcytometri kan tilbyde en kvantitativ vurdering af cellepolarisering ved analyse af fordelingen af parameteren Delta Centroid XY BF/Draq5, der måler afstanden mellem midten af cellen organ som det ses i lysfeltbillede og centrum af den nukleare farvning opnås med DRAQ5 (skematisk repræsentation i indsat). Delta Centroid BF/Draq5 værdier af colchicin-behandlede WT orthochromatic Erytroblaster er statistisk signifikant anderledes end kontrollen Delta Centroid BF/Draq5 værdier (p <0,001). Denne forskning blev oprindeligt udgivet i Blood:.. Konstantinidis GD, Pushkaran S, et al signalering og cytoskeletal krav erythroblast enucleation Blood. 2012;. 119 (25) :6118-6127 af American Society of Hematology Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de seneste år har studiet af erythroblast enucleation har vundet stigende fart, da det er det trin i in vitro erythropoiese kulturer, der er mest vanskelige at reproducere effektivt for at opnå en vellykket produktion af røde blodlegemer ex vivo i stor skala. Indtil for nylig undersøgelse af erythroblast enucleation udnyttes hovedsageligt fluorescensmikroskopi og flowcytometri metoder. Fluorescensmikroskopi metoder, omend nyttige i at identificere de deltagende molekyler kræve dages mikroskopisk observation til at identificere et lille antal orthochromatic erythroblaster gennemgår enucleation inden hundredvis af celler fast på et bestemt tidspunkt. Flowcytometri metoder, på den anden side, er meget hjælpsomme i at vurdere hastigheden af ​​enucleation i en kultur, såvel som virkningerne af farmakologisk eller genetisk manipulation af bestemte molekyler på denne proces, men giver ikke nogen oplysninger om intracellular lokalisering af disse molekyler.

Multi-spektral billeddannelse flowcytometri kombinerer fordelene ved flowcytometri og immunofluorescensmikroskopi, da det tillader hurtig erhvervelse af både flowcytometrisk og morfologiske data på flere tusinde celler. Dette er en betydelig fordel versus klassisk flowcytometri i erythropoiese undersøgelser, da de forskellige stadier af erythroblast differentiering (proerythroblasts, basofile, polychromatophilic og orthochromatic) er blevet defineret ved morfologiske kriterier 6.. Men multi-spektral billeddannelse flowcytometri er optimal for visualisering af cellulære strukturer snarere end relative for mængden sammenligninger i befolkningstal. For sådanne sammenligninger, rutine flow-cytometri, der ikke kræver den permeabilization nødvendige skridt for immunfluorescens af intracellulære strukturer præsterer bedre. For eksempel den relative procentdel af BasoE: Polye: OrthoE i figur 2E

De billeddata kan bearbejdes i forbindelse med flowcytometri data ved hjælp af analyse software specifikt til billeddannelse flowcytometeret tillader samling af celler med visse morfologiske karakteristika inden porte. Cirka hundrede enucleating celler kan blive identificeret inden for en befolkning på 10.000 erythroblaster med den ovenfor beskrevne på en hurtig og effektiv måde 7 analysemetode, hvilket giver mere meningsfulde observationer og statistisk vurdering.

Desuden er billedbehandling fremmet med analyse software specifikt til billeddannelse flowcytometer tillader kvantitativ analyse af sådanne egenskaber som Delta Centroid XY at studere f.eks relative position af kernen tilcytoplasmaet, der kan bruges som et mål for polarisering.

Kritiske trin i protokollen og fejlfinding

Det er velkendt, at selv forsigtig pipettering kan resultere i adskillelse af reticulocyt-og pyrenocyte 12. Dette har potentiale til alvorligt begrænse antallet af enucleation begivenheder afbildet. Som et resultat, skal man passe på, især når du løfter erytroblaster bundet til MS5 celler i kultur.

Fiksering med formaldehyd opløsning kan forårsage ændringer i ekstracellulære regioner af overflade-markører resulterer i nedsat specifik antistofbinding og / eller øget ikke-specifik antistofbinding. En fordel ved den billeddannende flowcytometeret at overfladefarvning visualiseres og kvaliteten kan således vurderes. Prikket, i stedet for uniform, farvning for rigelige overflademarkører såsom TER119 indikerer overfixation og bør løses gennem en blanding af lavere formaldehydhyde koncentration og kortere fiksering.

Efter fiksering, holder celler på is i mindst 15 minutter er afgørende for at forhindre overskydende cellebrud under permeabilization proces på grund af temperaturforskelle. Selvom acetone permeabilisering fastholder de skrøbelige sene erythroids bedre end vaskemiddel-medieret permeabilisering vil det trin, hvor 100% acetone kræves resultere i en mærkbar, men ikke skader, tab af celler. Ved slutningen, efter en vask med kold FACS-buffer, er cellerne lov ved stuetemperatur antistof inkubationstrin.

De billeddannende Flowcytometret har et sæt vandføring (celler / sek), afhængigt af det anvendte objektiv (sats er faldet som øges forstørrelsen). Efter den endelige vask før målingen, anbefales det, at cellepellets resuspenderes i et lille volumen (50-60 pi) for at fremskynde behandlingen af ​​prøven. For et stort antal prøver, der remå gøres lange varighed af løb (over 30 min), skal prøver opbevares på is.

Den langsigtede enucleation assay tilbyder fordelen ved en udvidet erythroidcellespecifik produktion for at producere nok celler, der kan indsamles på enucleation scenen for biokemisk evaluering ligesom immunoblotting og pull-downs. Den hurtige fjernelse af kernen assayet giver fordelen af ​​tid kræver kun 2 dage at udføre, selv om en mus skal phlebotomized 4 dage forud for eksperimentet. Vi har ikke observeret en signifikant forskel i enucleation effektivitet mellem de to metoder. Notatet, flowcytometri evaluering, som ikke kræver permeabilization nødvendige skridt for immunfluorescens af intracellulære strukturer, som beskrevet før 7, er mest hensigtsmæssigt for den kvantitative evaluering af enucleation effektivitet.

Begrænsninger af teknikken

Fremgangsmåden beskrevet her utilizes induceret stress erytropoiesis in vivo og kultur i medium, der indeholder hydrocortison in vitro med henblik på at forstærke erythroide befolkninger og synkronisere dem på tidspunktet for enucleation. Begge disse betingelser sandsynligvis efterligne erythroblast-enucleation under stress. Desuden hydrocortison øger erythroide udbytte og overlevelse. For at opnå ens udbytte af enucleation begivenheder fra knoglemarv celler fra vild type mus med steady-state erytropoiesis og dyrket uden hydrocortison (for at undgå synkronisering), ville vi nødt til at dyrke celler fra flere mus og køre og behandle en masse flere begivenheder gennem Multi -Spectral Imaging Flowcytometri. Selv multi-spektral billeddannelse flowcytometri accelererer indsamling af morfologiske data enormt i forhold til immunfluorescensmikroskopi hjælp forstørrelsesluppen op til 60x, sammenligning af de observationer, der ved billeddannelse flowcytometer med klassisk, Z-stack,og konfokal mikroskopi billeder er værdifuldt at opnå bedre detaljer, idet målet linse i et mikroskop kan give forstørrelse på op til 100x og Z-stack billeder giver en 3-dimensionel indtryk af de strukturer, som ikke opnås ved billeddannelse flowcytometer i samme celle. Det relativt høje antal lignende celler opsamlet i en multi-spektral billeddannelse flowcytometri eksperiment på en tilfældig orientering, delvist kompenserer denne begrænsning giver observationer fra en anden opfattelse-point.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne takker Research Flowcytometri Core på Cincinnati Children Hospital Research Foundation og Richard Demarco, Sherree Ven, og Scott Mordokaj fra Amnis Corporation (en del af EMD Milllipore) for sagkyndig teknisk support. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health tilskud K08HL088126 og R01HL116352 (TAK) og P30 DK090971 (YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM medium CellGro 15-012-CV
IMDM medium Hyclone (Thermo Scientific) SH30228.01
Stempro-34 SFM GIBCO (Life Tech) 10640
Stempro-34 nutrient supplement GIBCO (Life Tech) 10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals 512450
BIT9500 Stemcell Technologies 09500
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS) Hyclone (Thermo Scientific) SH30028.02
Penicillin/Streptomycin Hyclone (Thermo Scientific) SV30010
L-glutamine Hyclone (Thermo Scientific) SH30590.01
Isothesia (Isoflurane) Butler-Schein 029405
Histopaque 1.083 mg/ml Sigma 10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) BD Biosciences 555899
Acetone Sigma-Aldrich 534064
Formaldehyde Fisher Scientific BP 531-500
Hydrocortisone Sigma H4001
Stem Cell Factor (SCF) Peprotech 250-03
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech 213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) AMGEN available by pharmacy
CD44-FITC antibody BD Pharmingen 553133
CD71-FITC antibody BD Pharmingen 553266
Ter119-PECy7 antibody BD Pharmingen 557853
Phalloidin-AF488 Invitrogen (Life Technologies) A12379
β-tubulin-AF488 antibody Cell Signaling #3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A21428
AF594-cholera toxin B subunit Invitrogen (Life Technologies) C34777
pMRLC (Ser19) antibody Cell Signaling #3671
γ-tubulin antibody Sigma T-3559
Syto16 Invitrogen (Life Technologies) S7578
Draq5 Biostatus DR50200
Ferrous sulfate Sigma F7002
Ferric nitrate Sigma F3002
EDTA Fisher Scientific BP120500
15-ml tubes BD Falcon 352099
50-ml tubes BD Falcon 352098
6-well plates BD Falcon 353046
24-well plates BD Falcon 351147
Flow tubes BD Falcon 352008
Tuberculin syringe BD 309602
Insulin syringe BD 329461
Syringe needle 25-G 5/8 BD 305122
Capped flow tubes BD 352058
40-μm cell strainer BD Falcon 352340
Scalpel (disposable) Feather 2975#21
FACS Canto Flow Cytometer BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter Drew Scientific CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Mini Mouse Bench centrifuge Denville C0801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics