Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI'nin Zenginleştir tanımlanması

Biology

Your institution must subscribe to JoVE's Biology section to access this content.

Fill out the form below to receive a free trial or learn more about access:

Welcome!

Enter your email below to get your free 10 minute trial to JoVE!





We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.

If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.

 

Summary

Bu protokol, sitometri multi-spektral görüntüleme akışı ile ortokromatik eritroblastlarda enucleating erythroblast enükleasyonu işleminin bir görselleştirme temin edilmesi için bir popülasyonu belirlenmesi için yeni bir yöntem tarif eder.

Cite this Article

Copy Citation | Download Citations

Konstantinidis, D. G., Pushkaran, S., Giger, K., Manganaris, S., Zheng, Y., Kalfa, T. A. Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (88), e50990, doi:10.3791/50990 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Memelilerde Eritropoez retikülosit oluşumuyla sonuçlanan enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. Enükleasyonu mekanizması henüz tam olarak açıklığa kavuşturulamamıştır. Mikroskopla enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu okuyan karşılaşılan genel bir sorun enükleasyonunu geçiren hücrelerin yeterli sayıda gözlemlemek güçlüğüdür. Bu akışta çok parametreli yüksek hızlı hücre görüntüleme (Fazla Spektral Görüntüleme Flow Cytometry), verimli bir şekilde enucleating etkinlikleri önemli sayıda belirlemek amacıyla, akış sitometrisi ile immünofloresan mikroskopi bir araya getiren bir yöntemi kullanarak yeni bir analiz protokolü geliştirdik, bu sağlar: ölçümler elde ve istatistiksel analiz.

Biz buraya ilk kemirgen eritroblastlarda senkronize ve inci de enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak için kullanılan iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri tarifdeğerlendirme e saati. Daha sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar. Büyüklüğü ve ortokromatik eritroblastlarda tanımlamak için kullanılır DNA/Ter119 boyama ile birlikte, ince uzun hücreleri ve "delta ağırlık merkezi XY Ter119/Draq5 tanınmasına yardımcı olan, parlak-alan kanal bir hücrenin parametreleri" boy oranı "kullanmaktadır "Bu Ter119 boyama (olgunlaşmamış retikülosit) merkez uzak Draq5 lekeleme (çekirdek yapılan ekstrüzyon) merkezinden olduğu hücresel olaylar, bu nedenle tanımlama aydınlatmak üzere bir hücre gösteren sağlar. Yüksek delta sentroidinden ve düşük boy oranı ile ortokromatik erythroblast nüfusun alt kümesi derece hücreleri enucleating zenginleşmektedir.

Introduction

Memelilerde eritroid soy içinde terminal farklılaşma ortokromatik erythroblast bir retikülosit 2 üreten, kendi membran kaplı çekirdeği (pyrenocyte) 1 kovar hangi aracılığıyla enükleasyonu dramatik süreci ile sona eriyor. De başarılı oran-sınırlayıcı bir adımdır, bu prosesin mekanizması tam olarak, büyük ölçekli, in vitro olarak kırmızı kan hücrelerinin üretimi, henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Enucleating erythroblasts içinde önemli protein ve yapıların lokalizasyonu floresan ve elektron mikroskobu 3-5 kullanımına dayanır. Bu işlem, tipik olarak sıkıcı enükleasyonu etkinlikleri sınırlı sayıda tanımlanması ile sonuçlanır ve her zaman anlamlı istatistiksel olarak analiz edilmesine izin vermez. McGrath ve ark. 6 tarafından tarif erythroblast kimlik bir yöntem üzerinde genişletilmesi, biz Multi-Spektral Ima tarafından enükleasyonun olayları tanımlama ve okuyan yeni bir yaklaşım geliştirdilerölçümler elde ve istatistiksel analizi gerçekleştirmek için gözlemler yeterli sayıda sağlayabilir retlendirici Sitometrisi (akımında multiparameter yüksek hızlı hücre görüntüleme, akış sitometrisine floresan mikroskopi birleştiren bir yöntem) 7.

Burada, biz eritroblastlarda senkronize ve değerlendirilmesi sırasında enükleasyonunu yakalama olasılığını arttırmak amacıyla kullanılan ilk iki in vitro erythropoiesis kültür yöntemleri açıklanmaktadır. Sonra, multi-spektral görüntüleme akış sitometresi ile enükleasyonu sırasında hücre içi protein veya lipid sallar lokalizasyonunu incelemek için ayrıntılı olarak tespit ve geçirgenleştirmeden sonra eritroblast boyama açıklar.

Numuneler sitometresiyle bir görüntüleme akış üzerinde çalışan ve toplanan hücreler ortokromatik eritroblastlarda 6 tanımlamak için uygun Geçitli. Aydınlık İMA olarak ölçülen ortokromatik eritroblastlar sonra, onların boy oranına göre dağılımı incelendiğindeging sırasıyla Ter119 ve DNA için lekeli alanların merkezleri arasındaki mesafe olarak tanımlanan parametre delta ağırlık merkezi XY Ter119-DNA, için kendi değerine karşılık. Düşük en-boy oranına ve yüksek delta sentroid XY Ter119/DNA ile hücre nüfusu oldukça hücreleri enucleating zenginleşmektedir. - / - Veya kombine RAC2 - / - wild-tip (WT) kullanarak RAC2 üzerine Rac1 Mx-Cre aracılı koşullu silme ile erythroblasts karşı eritroblastlarda; RAC3 - / -, genetik geçmişi ve multi-spektral görüntüleme akışının bu yeni protokol sitometrisi analizi, son zamanlarda enükleasyonu asimetrik sitokinez ve benzer Rac GTPases kısmen düzenlenmiş bir aktomizin halkasının oluşumu enükleasyonu ilerlemesi 7 için önemli olduğunu ortaya koymuştur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Vitro Eritropoez Kültür 1. Uzun vadeli (Ex vivo eritroid Farklılaşma Kültür Protokolü Giarratana ve ark. Tarafından 8 Modifiye ve Fare Hücreler için uyarlanmıştır)

Bu vitro eritropoezi protokolünde bir 3 adım uzun bir terimdir. İlk aşamada (gün 0-4) 2 x 10 5 hücre / ml kök hücre faktörü (SCF), interlökin-3 (IL-3) ve eritropoietin (EPO) ile desteklenmiş büyüme ortamında erythroblast yerleştirilir. İkinci aşama (gün 5-6), hücreler 2 x 10 'de yeniden süspanse edilir 5 hücre / sadece Epo ile desteklenmiş taze erythroblast büyüme ortamı içinde yapışkan stroma hücreleri (MS5) hakkında ml, co-kültürlenmiştir. Üçüncü aşamada (gün 7-9) 'de, hücrelerin kadar enükleasyonuna sitokinlerin (Şekil 1A) olmadan taze erythroblast büyüme ortamı içinde MS-5 hücreleri bir tabaka üzerinde kültürlenmiştir.

Tüm hayvan protokoller Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmışCincinnati Çocuk Hastanesi Tıp Merkezi.

  1. Kemik ve düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerinin izolasyonu hasat
    1. 2 ml, 15 ml konik bir tüp içinde% 2 fetal sığır serumu (FBS) ihtiva eden steril IMDM ekleyin ve buz üzerinde tutun.
    2. (Servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) kurum onaylı protokol aşağıdaki (veya ilgi genetik hedefli fare olmadan birlikte) 2-6 aylık yabani tip C57/BL6 fare Euthanize.
    3. , Forseps ve neşter kullanılarak leğen kemikleri, femur ve her iki bacak fibula izole IMDM 2% FBS içeren tüp ekleyin ve buz üzerinde tutmak.
    4. (25-G x birkaç kez yavaşça kemikler yoluyla 5/8 "iğne. Flush IMDM +% 2 FBS ile forseps ve bir tüberkülin şırıngası kullanılarak bir steril akış sitometri tüp ve gömme kemiklerde 1 ml IMDM +% 2 FBS ekleme Hücre süspansiyonundan 500 ul ~ ve aspire) kemiği tekrar yıkama ve akış cytometr içine, kemik iliği hücreleri toplamak iley tüpü. Kemikler, beyaz göründüğünde Flushing tamamlandı.
    5. 50 ml konik tüp üstünde bir 40-um hücre filtresi grubu boyunca hücre süspansiyonu filtre. IMDM +% 2 FBS ve aynı ortam 5 ml hücre süspansiyonu son seviyesini ayarlamak kullanılarak hücre süzgeç yıkayın.
    6. Yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile, düşük yoğunluklu kemik iliği hücrelerini (ldbm) hazırlayın: dikkatlice orta 1,083 g / ml 750 x g, 15 ml'lik bir tüp ve spin 25 için yoğunluk gradyan hücre ayrımı, 5 ml on hücre süspansiyonu 5 ml katman dk hayır fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında (RT).
    7. Aktarım süpernatan (her kadar 15 ml tüp içinde 2 ml işareti ince beyaz tabakayı elde etmek için ilgili olarak), yeni bir 15 ml'lik tüpe ve 5 dk boyunca 525 x g 'de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine RT.
    8. Aspire edilen süpernatan ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse pelet olarak kalan herhangi bir kırmızı kan hücrelerini (RBC) lize edildi. Erythroblasts daha büyük bir saflık ise(Biyokimyasal çalışmalar için) örneğin, son aşamada gerekmektedir, manyetik ayırma ile Lin negatif hücrelere bu aşamada daha fazla ldbm hücrelerin saflaştırılması.
  2. Ldbm ya da Lin negatif hücrelerin başlangıç ​​Ex vivo erythroid farklılaşması kültür protokolü (Şekil 1A)
    1. Ekle 7 ml IMDM +% 2 FBS, 5 dakika oda sıcaklığında ve aşağıdakilerden oluşan, 2 mi erythroblast büyüme ortamı (EGM) 'de pelet hücreleri tekrar süspansiyon için 525 x g'de santrifüj:
      a. Ihtiva eden StemPro-34 ortamı,
      b. 2.6% StemPro-34 orta ek,
      c. % 20 BIT-9500,
      d. 900 ng / ml demir sülfat,
      e. 90 ng / ml demir nitrat,
      f. 100 ünite / ml penisilin / streptomisin, 2 mM L-glutamin
      g. 10 -6 M hidrokortizon
      h. ve taze eklenen sitokinleri:
      i) 100 ng / ml SCF,
      ii) 5 ng / ml IL-3, ve
      iii) 3 IU / ml EPO.
    2. Bir kenar ile bir otomatik hücre sayacı kullanılarak ya da el ile mikroskop de hücre sayımıocytometer.
    3. / Oyuk EGM içinde, 2.5 ml (2 x 10 5 ldbm hücre / ml) bir son hacim ve 37 ° C'de inkübe 5 x 10 5 hücre konsantrasyonunda, 6-yuvalı hücre kültürü plakasının Levha (bu kabul edilir kültürün gün # 0 gibi).
    4. , Süpernatan aspire 1.5 ml, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g, iplik 3 sitokinler ihtiva eden ve 2. gün geri çukurlara her gün taze ortam ilave 1.5 ml ortam içinde yeniden süspansiyona ile değiştirme, 3, 4, optimize çoğalma fazı. 3. günde, bütün hücrelerini kaldırmak saymak ve ~ 2 x 10 5 hücre / ml de hücre konsantrasyonları sürdürmek için kuyu uygun sayıya bölünür. 37 ° C /% 5 CO 2 kültürünü korumak.
    5. 4. günde, yeni bir hücre kültür 6-çukurlu bir levhanın çukurlarına plaka MS5 hücrelerinin (murin hücre hattı). MS5 hücre kültür ortamı,% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin, MEM-α edilir.
    6. 5. günde, sayı saymak, otomatik bir hücre sayacı ya da el ile bir hemositometre kullanılarak bir mikroskop ile kullanarak, orijinal kültür plakasının her çukuruna hücreler (şimdi önemli ölçüde eritroblastta zenginleştirilmiş).
    7. Her kuyudan tüm hücreleri kaldırın ve 15 ml konik tüplere aktarın, oda sıcaklığına, aspirat yüzer, 5 dakika boyunca 525 x g hızında aşağı spin ve 2 x 10 bir konsantrasyona kadar sadece Epo (3 IU / ml) ihtiva eden taze EGM ile granül çözülür 5 hücre / ml.
    8. MS-5 hücreleri bir önceki gün, (ko-kültür esnasında 70-80% konfluansa kadar hedefli) kaplama ve tek EPO içeren EGM bu kuyularda eritroit hücreleri eklemek takımından kuyulardan aspire süpernatan (değil orta bölgesinin her ne seçim, MS-5 hücreleri) birkaç gün EGM iyi hayatta.
    9. Gün içerisinde 6. taze EPO ekleyerek orta değiştirin.
    10. Hiçbir ekledi sitokinler ile EGM kullanarak, günlük # 7 orta değiştirin. Günlerde 7 ile 9, sitometri günlük anti-Ter119 ve Syto-16 ile boyanarak ve p sonra akışı ile enükleasyon için test örnekleriMulti-Spektral Görüntüleme Sitometrisi (3. bölümde ayrıntılı olarak) için numune boyama için roceed.
      Not:. Günde 2, 4, 6, ve kültür on 7 kaplama ve önce sitometri boyutu (FSC) vs yüzey belirteçleri CD44 ve Ter119 değerlendirerek akışı ile erythroblast zenginleştirme ve farklılaşması için kültür hücreleri izlemek 9 Alternatif CD71, Ter119 ve FSC Ayrıca, 10, 11 kullanılabilir.

2.. Hızlı Enükleasyon Assay, Yoshida ve arkadaşları tarafından tanımlanan Protokolüne göre. Değişiklikler 12 (Şekil 1B)

  1. In vitro eritropoezi kültürü Stres erythropoiesis indüksiyon ve stroma hücre hazırlama
    1. IACUC kurallarına başına 2-6 aylık bir vahşi tip C57/BL6 fareyi (örn. izofluran çözeltisi ile) anestezisi. Fare yeterince nazik bir arka-pençe tutam refleksif tepkilerin olmaması için ve kontrol ile anestezi edilmiş olduğundan emin olunİşlem sırasında normal solunum. Anestezi altında iken kuruluğunu önlemek için gözleri veteriner oftalmik merhem kullanın.
    2. 500 ul son hacim olması için kuyruk kanatması yoluyla eritrosit stres neden. Bir insülin şırınga kullanarak, periton hayvanın sıvı resüsitasyon (enjekte önce Trendelenburg pozisyonda hayvan tutun ve iç organlara zarar vermemek için alt karın enjekte) sağlamak için normal tuz eşit miktarda enjekte.
    3. Kafesin etrafında hareket etmeye başlayan ve düşmeden durmak ve yürümek mümkün olan hayvan tarafından belirtildiği gibi motor kontrol kavuşana kadar sahipsiz fareyi bırakmayın. Phlebotomized fare, diğer fareler olmayan bir kafese yerleştirilir.
    4. 2 gün sonra, 24-gözlü hücre kültür tablası çukurundaki MS-5 hücreleri plaka. MS5 hücre ortamı içinde 37 ° C /% 5 CO2 ile MS-5 hücreleri inkübe (a-MEM% 20 FBS ihtiva eden, 100 birim / ml penisilin / streptomisin ve 2 mM L-glutamin) amacı ile 70-80 olduğu % confluent i48 saat sonra n plaka kuyuları.
  2. Dalak ve splenositlerin işlenme hasat
    1. Dört gün (96 saat) stres eritropoez indüksiyon sonrası, önceden IACUC onaylı protokol (servikal dislokasyon örneğin CO 2 inhalasyon) yoluyla fare kanadı Euthanize.
    2. Hasat dalak ve IMDM% 2 FBS içeren 15 ml konik tüp içine koyun ve buz üzerinde tutmak.
    3. Geri laboratuarda, steril koşullar altında, doku kültürü kaputu, 50 ml tüp üzerine oturtulmuş bir 40-mikron hücre süzgecinden dalak içeren tüp ters. 5 ml'lik plastik şırınga pistonu kullanarak dalak ez.
    4. IMDM +% 2 FBS ile hücre süzgeç yıkayın ve aynı ortam kullanılarak, 5 ml hücre süspansiyonu son hacim ayarlayın.
    5. Dikkatle 5 ml yoğunluk gradyan hücre ayrılmasına 5 ml süspansiyon splenosit orta tabaka, fren / düşük bir ivme ile oda sıcaklığında 25 dakika boyunca 750 x g'de 15 ml tüp ve spin 1.083 g / ml.
    6. Transferyeni bir 15 ml'lik tüpe ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 525 x g 'de IMDM +% 2 FBS ile bir kez daha yıkama yerine supernatant (buffy coat elde etmek amacıyla, 15 ml tüp içinde 2 ml işaretine kadar yaklaşık çözelti) .
    7. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 3 ml RBC liziz tamponu içinde süspanse edilmesi suretiyle pelet süpernatan aspire ve kırmızı kan hücrelerinin lize.
    8. Hücreleri yıkamak için ve seyreltilmesi ve, 4 ° C'de 5 dakika boyunca 525 xg'de RBC liziz tamponu ve spin nötralize 7 ml IMDM +% 2 FBS ekleme
    9. Aspire edilen süpernatan ve erythroblast büyüme ortamında (EGM) 2 ml pelet hücrelerin süspansiyonu.
  3. Plastik eritroblastta zenginleştirilmiş izole düşük yoğunluklu splenositlerinin, (hızlı, in vitro erythropoiesis kültürünün ilk aşaması) Kültür
    1. Otomatik hücre sayıcı veya elle bir hemositometreyle hücreleri saymak. Bu aşamada, dalak başına izole edilen hücre sayısı olağan ~ 15 x 10 6'dır.
    2. F (sitokinler ihtiva eden daha başka EGM hücreleri Askıyainal konsantrasyonlar): SCF 50 ng / ml, IL-3, 5 ng / ml, ve EPO 2 U / ml.
    3. / A 24-iyi hücre kültür plakasının 1 ml / oyuk (de, toplam hücre sayısına bağlı olarak ortalama hücre aynı sayıda) bir nihai hacim içinde ve 37 ° C 'de O / N inkübe Plate 1-5 x 10 6 hücre % 5 CO 2.
  4. MS5 hücreleri üzerinde erythroblasts (hızlı in vitro erythropoiesis kültürünün ikinci aşama Kültür
    1. Aspire de plastikten süpernatan ve her bir kuyucuğa, buz üzerinde 5 dakika boyunca PBS içinde soğuk 10 mM EDTA, 2 ml eklenerek (son derece eritroblastta zenginleştirilmiş) hücreleri kaldırın.
    2. (Sitokinler) olmadan EGM kez yıkama ve aynı tekrar süspansiyon, yeni tüplere hücreleri koyun.
    3. Bir 1-2 ml hacim içinde Plaka 5 x 10 5 -1 x 10 6 hücre her MS5 hücre kaplı 24 yuvalı plakanın. Farmakolojik inhibitörleri deneyde kullanılan, şimdi uygun konsantrasyonlarda ekleyebilirsiniz.
    4. Tarafından yönlendirilen 6 ila 8 saat (zaman inkübemuamele edilmemiş WT örneğinde yaklaşık 30% -40% enükleasyonunu) mikroskopik gözlem. MS-5 hücreleri için eritroblast bağlanma kendi enükleasyonunu hızlandırır.
    5. Buz üzerinde 5 dakika boyunca, soğuk PBS + 10 mM EDTA, 2 ml ilave etmek suretiyle, her kuyudan alınan hücreler, kaldırın. Erythroblasts ile birlikte, MS-5 hücreleri de tahsil edilecektir ancak bu daha sonra kolayca FSC hi Ter119 gibi akış sitometri analizi sırasında dışlanan olabilir - hücreler.
    6. Bu aşamada hücreler, multi-spektral Görüntüleme Akım Sitometrisi ile analiz için sabit ve boyanmış olabilir.

3. Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enükleasyon sırasında hücre içi proteinlerin veya lipid sallar Lokalizasyonlarının için eritroblastlarda boyanması

  1. PBS'de hücreleri yıkayın 5 dakika oda sıcaklığında ve süpernatan aspire 525 xg dönerler.
  2. (Tespit zaman anti-bağlı olarak değişebilir, 15 dakika boyunca PBS içinde% 3.7 formaldehit 500 ul hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri saptamakgen problanmış) ve yavaşça pipetleme ediliyor.
  3. 1.5 ml'lik plastik santrifüj tüplerine aktarılır ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin.
  4. 20 saniye, aspire süpernatant ve yavaşça her tüp ve pipet 500 ul PBS ekleyerek bir yıkama gerçekleştirmek için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg Spin.
  5. 20 sn, aspire süpernatant için bir tezgah mikrosantrifuj 2.000 xg üzerinde Spin ve en az 15 dakika boyunca buz üzerinde tüpler tutmak. Permeablization 3.6-3.9 hızlı ve verimli yapılması gerektiğini, ve oda sıcaklığında iplik / aspirasyonu takiben hücre topakları hemen hücrelerin daha iyi kendi bütünlüğünü korumak için sırayla, buz üzerinde geri koymak gerekir adımları.
  6. -20 ° C dondurucu aseton çözümler alın ve buz koymak. Yavaşça 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton (2 O dH ile 1:1) pipetle ilk hücre pelletleri yeniden süspanse hücreleri geçirgenliği.
  7. Tezgah mikrosantrifiijde Spin 500 ul 20 sn, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon hücre pelet 2.000 xg60; hafifçe pipetleme buz soğukluğunda% 100 aseton.
  8. Tezgah mikrosantrfuj on Spin hafifçe pipetleme 500 ul buz soğukluğunda% 50 aseton içerisinde bir kez daha 20 saniye, aspirat supernatant ve tekrar süspansiyon hücre topakları için 2000 x g.
  9. Tezgah mikrosantrfuj Spin 2000 20 saniye boyunca xg, süpernatan aspire ve yavaşça pipetleme soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 0.5 BSA) içinde bir kere hücreleri yıkayın.
  10. Ilgi molekülleri için antikorlar veya işaretleri ile etiketleme kokteyli hazırlayın: eritroid hücre boyama F-aktin boyama ve 1 μl/100 ul Ter119-PECy7 için 0.1 U/100 ul AF488-Phalloidin. Alternatif ya da ek boyama da (01:50), AF-594-konjüge edilmiş kolera toksin alt-B lipid sallar etiketlemek için (1:200), anti-pMRLC (Ser19) AF-488-anti-β-tubulin antikoru kullanılarak yapılabilir fosforile miyosin hafif düzenleyici anti-tavşan AF-488-konjuge ikincil antikoru (1:400) ve ardından zincir (1:50), ve anti-γ-Tomar yay için birincil antikorlin primer tavşan antikoru (1:100) anti-tavşan AF-555-konjuge ikincil antikoru (1:300) eklenmiştir.
  11. Süpernatan aspirasyon sonra, yavaşça işaretleyici kokteyl, pipet, 100 ul hücre topakları tekrar süspansiyon ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edilir.
  12. Nükleer leke Draq5 2.5 mcM içeren FACS tampon hazırlayın.
  13. Tezgah mikrosantrifiijde üzerinde Draq5 içeren 60 ul FACS tamponunda 20 saniye, aspire süpernatant ve tekrar süspansiyon için 2.000 xg aşağı spin, FACS tampon hücreleri yıkayın.
  14. Görüntüleme çalıştırın örnekleri görüntüleme özgü analiz yazılımı akış sitometresi kullanılarak, deney başına en az 10.000 olay toplamak, daha önce yayınlanmış 13 gibi ham veri dosyalarını telafi etmek, ve Şekil 2'de gösterildiği gibi sonuçlarını analiz etmek akış sitometresi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

İlk olarak, hücreler aydınlık Boy Oranı (bunların büyük ekseni ile kendi küçük uzunluğunun oranı) ve aydınlık Alan (büyüklüklerine göstergesidir) göre analiz edilir. Bir aydınlık Alan Değeri 20 daha düşük ve 200 'den daha yüksek olan olaylar sırası ile enkaz ve hücre agrega, ve analizi (Şekil 2A) için hariç tutulur. Tek hücreler (gate "R1") daha sonra görüntünün keskinliğini gösterir Gradient RMS parametresi için, kendi değerine göre analiz vardır. Kapısı "R2" odak (Şekil 2B) de alınan görüntüleri seçmek için 50 persentil daha Eğim RMS değeri içeren hücreler oluşturulur. Hücreler daha sonra aydınlık Alanı ile ölçülen büyüklüklerine göre kapı ve Ter119 floresan paslanmaz ortalama piksel parametresi ile ölçülen eritroid işaretleyici Ter119 için kendi üreme (gate "Ter119 pozitif", Şekil 2C) vardır. Ter119 için çok düşük veya çok yüksek hücreler, sırasıyla olmayan erythroids veya geri kalan hücre agrega, ya vardır, ve analiz dışında tutulmuştur. Bir sonraki adımda, hücreler Draq5 En-Boy Oranı Yoğunluk (kendi çekirdeğinin ana ekseni yoğunluğuna karşı yan oranı) ve Draq5 (Şekil 2D) yoğunluğuna göre seçilir. Draq5 negatif hücreler (çoğunlukla enüklee gibi retikülosit ve RBCs gibi hücreleri), ve düşük Draq5 Aspect Ratio (çoğunlukla çiftli) ile hücreler analiz dışında tutulmuştur. Draq5 pozitif hücreler (gate "DNA pozitif", çoğunlukla bu noktada eritroblastlarda) sonra gösterir hücrenin boyutunu ve onların Ter119 Mean Pixel / Area (Ter119 ifade yoğunluğu), işaret kendi Ter119 Area dayalı analiz edilir Ter119 boyanma parlaklık. Ortokromatik eritroblastlar (gate "OrthoE") küçük, Ter119 hi hücreleri (Şekil 2E) olarak kabul edilmektedir. Son olarak, orthochro bir alt popülasyonumatic yüksek hücreleri enucleating zenginleştirilmiş erythroblasts M01 ve yüksek Delta Geometrik XY Ter119 ile aydınlık kanalda hücre resmin küçük eksen / ana eksenin oranı ile hesaplanan, hücre uzamasının bir ölçüsüdür, aydınlık olan düşük en-boy oranında ile karakterize edilir başlangıç ​​Ter119 +-retikülosit ve Draq5 +-çekirdek (Şekil 2F in kapı "enucleating hücreler") merkezinin merkezi arasındaki mesafe ile tanımlanır / Draq5.

Ter119 karşı antikor ve DNA-leke Draq5 ile birlikte, hücreler de erythroblast enükleasyonu 7 sırasında F-aktin lokalizasyonu değerlendirilmesi floresan falloidinle filamanlı aktin (F-aktin) için boyandı edilmiştir. Not, enükleasyon bir ilerleme azalan boy oranı (yani giderek uzatılmış) ile hücreleri gibi, sabit hücrelerin görüntülendi olabilir ve artan delta sentroid XY Ter119/Draq5 görülmektedir (Şekilure 3). F-aktin enükleasyon sırasında bölünme karık da yoğunlaştırır ve daha sonra çekirdek kalıptan sonra dağılımı görülmektedir. Ayrıca, başlangıç ​​retikülosit ve çekirdeği arasındaki bölünme karık da aktin ve miyozin eş-lokalizasyonu sitometri pMRLC (fosforile miyosin düzenleyici hafif zincir) ve F-aktin 7 WT eritroblast ko-boyama sonrasında multi-spektral görüntüleme akışı ile kanıtlanabilir.

Diğer proteinler ve ilgi yapılar da enükleasyon sırasında rolleri görüntüleme çalışmalarını sağlamak için uygun antikorlar veya floresan işaretleri ile boyanmış olabilir. Polarize mikrotübül oluşumunu önce enükleasyonuna değil, kolşisin (Şekil 4A) ile muamele eritroblastta WT ortokromatik erythroblasts görülebilir. CEN arasında parametre delta merkezini XY BF/Draq5 ölçülerek gösterilir olarak kolşisin ile tubulin polimerizasyon inhibisyonu, hücre polarizasyonu azaltmaktadıraydınlık kanal ve Draq5 (Şekil 4B) ile elde edilen nükleer boyama merkezinde görülen hücre vücut ter.

WT veya Rac-eksik (genetik ya da farmakolojik manipülasyon sonra) kullanılması enükleasyonu içinde Rac GTPases rolünü göstermek izin görüntüleme çalışmaları sitometri multi-spektral görüntüleme akışında eritroblastlarda. Rac GTPases en azından kısmen bir aktomizin halkasının oluşumunu hem de başlangıç ​​retikülosit ve pyrenocyte 7 arasındaki karık lipid sallarının izdiham düzenler.

Şekil 1
Şekil 1. Çalışmalar için enucleating eritroblastlarda üretmek için kullanılan erythropoiesis in vitro protokol şematik gösterimi. A. vitro eritropoezi kültür Uzun vadeli initiatldbm veya Lin ed -.. derece flebotomiden in vivo stres erythropoiesis indüksiyon sonrasında eritroblastta zenginleştirilmiş splenositlerinin tarafından başlatılan hücreler B. Hızlı enükleasyonun tahlil bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 2,
Ilgilenilen popülasyonlarının Şekil 2. Veri görüntüleme akış sitometresi özgü analiz yazılımı kullanılarak analiz. Arda yolluk panelleri AF gösterilmiştir. Parantez içindeki sayı bu deneyde, karşılık gelen ana nüfusun yaklaşık yüzde işaret eder. R1 nüfusun A. ilk geçit hücre agregatları kaldırırve hücresel enkaz. R1 üzerinden B. Kapısı R2 (R2 dışında). C. Ter119-pozitif hücrelerin odak hücre dışına hariç net görüntülü edilmiş hücreleri içeren Ter119 için negatif ya vardır ya da hücrelerden hariç, seçilir çok yoğun lekeli için agregalardaki kendi varlığının. (Ter119-pozitif hücrelerin üzerinden) D. DNA-pozitif hücreler, nükleer leke yoğunluğundaki versus-Boy Oranı: Yoğunluk için plot edilmesinden sonra, seçilir (burada kanal oku Draq5 5). E. DNA ve Ter119-pozitif hücreler Ter119 Bölgesindeki karşı Ter119 Mean Pixel onların yere göre bazofilik, polychromatophilic ve ortokromatik erythroblasts içine Geçitli (burada kanalda okumak 3), McGrath ve ark 5 ile daha önce gösterildiği gibi. F. enucleating hücreler düşük Aspect Ratio (hücre elongat bir ölçüm var ortokromatik erythroblasts, dışında olan hücrelerdiraydınlık (BF) kanal) ve yüksek Delta Geometrik XY Ter119/Draq5 Ter119 +-retikülosit ve çekirdeğinin merkezini oluşturan merkezi arasındaki (mesafe) iyon. Bu araştırma aslında Blood yayınlandı: Konstantinidis DG, Pushkaran S, ve ark Sinyalizasyonu ve erythroblast enükleasyonu Blood sitoskeletal gereksinimleri... 2012;. Amerikan Hematoloji Derneği tarafından 119 (25) :6118-6127 , bu rakam büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Şekil 3,
Şekil 3.. Kademeli Ter119-PECy7, phalloidin-AF488, ve D ile boyanmış Delta Geometrik XY Ter119/Draq5. WT fare ortokromatik eritroblastlarda, artan eritroblastlarda enucleating Temsilcisi görüntüleriraq5, onların boy oranı ve delta sentroid XY Ter119/Draq5 başına Geçitli. Hücreler (sağda görüntülü hücrenin konumunu gösteren sarı kapının içindeki yeşil-cross) boy oranı azalan ve delta sentroid XY Ter119/Draq5 artan karşılık gelen bir ilerleme ile, enükleasyonu farklı, ardışık aşamalarında sabit gösterilir. Yukarıdan aşağıya hücre görüntüleri, F-aktin bölünme karık de konsantre ve (hücre # 4782 gösterildiği gibi alt resimde) çekirdek kalıptan bir kez daha sonra dağıtmak için enükleasyon sırasında görülebilir. bir görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız Bu rakamın büyük bir versiyonu.

Şekil 4,
Bir tek kutuplu mikrotübül montaj ve orthochroma kutuplaşma Şekil 4. Formasyonutic eritroblastlar enükleasyonunu önce gelir. B-tubulin diffüz 6 saat boyunca kolşisin (5 uM) ile inkübe eritroblastta lekeli ise A. Polarize mikrotübül oluşumunu, (anti-b-tubulin-AlexaFluor-488 ve nükleer leke Draq5 ile boyanmış) kontrol WT erythroblasts görülebilir hızlı in vitro tahlilinde enükleasyonu. B. Çok spektral görüntüleme akış sitometri hücre gövdesinin merkezi arasındaki mesafeyi ölçen parametre Delta Geometrik XY BF/Draq5, dağılımının analizi ile hücre polarizasyon kantitatif bir değerlendirmesini sunmaktadır parlak saha ve Draq5 (içerlek şematik bir temsilidir) ile elde edilen nükleer boyama merkezinde görüldüğü gibi. Kolşisin tedavisi WT ortokromatik eritroblast Delta Geometrik BF/Draq5 değerleri istatistiksel kontrol Delta Geometrik BF/Draq5 değerleri (p <0.001) anlamlı derecede farklıdır. Bu araştırma aslında Bloo yayımlandıd:.. Konstantinidis DG, Pushkaran S, ve ark Sinyal ve erythroblast enükleasyonu içinde sitoskeletal gereksinimleri Kan. 2012;. Amerikan Hematoloji Derneği tarafından 119 (25) :6118-6127 , bu rakam büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Kırmızı kan hücrelerinin ex vivo başarılı bir şekilde, büyük ölçekli üretim elde etmek için etkili bir şekilde yeniden üretmek için çok zordur erythropoiesis in vitro kültürlerinde adım olduğu Son yıllarda erythroblast enükleasyonu çalışma artan ivme kazanmıştır. Son zamanlara kadar, erythroblast enükleasyonu çalışma esas floresan mikroskobu kullanılmaktadır ve sitometri yöntemleri akar. Floresan mikroskopi yöntemleri, katılımcı moleküllerinin belirlenmesi yardımcı olsa, zaman içinde belli bir noktada sabit hücrelerin yüzlerce içinde enükleasyon geçiren ortokromatik erythroblasts küçük bir sayısını belirlemek için mikroskobik gözlem gün gerektirir. Akış sitometrisi yöntemleri, diğer taraftan, bir kültürde enükleasyonu oranı, hem de bu süreç özellikle moleküllerinin farmakolojik ya da genetik manipülasyon etkilerini değerlendirmek için çok faydalıdır, ancak intracellul herhangi bir veri sağlamazBu moleküllerin ar lokalizasyonu.

Bu akış sitometrik ve hücrelerin binlerce üzerine morfolojik veri hem hızlı kazanılması mümkün beri Multi-spektral görüntüleme akım sitometri flow sitometri mikroskobi faydalarını birleştirir. Bu erythroblast farklılaşma farklı aşamalarında beri (proerythroblasts, bazofilik, polychromatophilic ve ortokromatik) morfolojik kriterlere 6 kullanılarak tanımlanmış, erythropoiesis çalışmalarda sitometri klasik akış karşı önemli bir avantajdır. Ancak, multi-spektral görüntüleme akış sitometri yerine nüfus sayıları göreli kantitasyon karşılaştırmaları daha hücresel yapıların görüntülenmesi için en uygunudur. Bu tür karşılaştırmalar için, hücre içi yapılar immünofloresans için gerekli olan permeabilization aşamasını gerektirmeyen rutin akış sitometri iyi performans gösterir. Örneğin BasoE nispi yüzdesi: PolyE Şekil 2E'de OrthoE

Görüntüleme verileri kapılar içinde bazı morfolojik özelliklere sahip hücrelerin toplanmasını sağlayan, akış sitometresi görüntüleme özgü veri analiz yazılımı kullanılarak akış sitometrisi ile birlikte işlenebilir. Yaklaşık yüz enucleating hücreler daha anlamlı gözlem ve istatistiksel değerlendirme sağlayan bir hızlı ve verimli bir şekilde 7 yukarıda tarif edilen analiz yöntemi ile 10.000 erythroblasts bir nüfus içinde tespit edilebilir.

Ayrıca, görüntü işleme Delta Geometrik XY gibi özelliklerinin kantitatif analiz için çekirdeğin göreli konumunu, örneğin çalışma izin sitometresi görüntüleme akımına özgü analiz yazılımı ile kolaylaştırılırpolarizasyon bir ölçüsü olarak kullanılabilir sitoplazma.

Protokol ve sorun giderme içinde kritik adım

Bu bile iyi yumuşak pipetleme retikülosit ve pyrenocyte 12 ayrılmasına neden olduğu bilinmektedir. Bu ciddi görüntülü enükleasyonun olayların sayısını sınırlamak için bir potansiyele sahiptir. Kültür içinde MS5 hücrelere bağlanan eritroblastlarda kaldırma özellikle bir sonucu olarak, çok dikkatli olmak gerekir.

Formaldehit çözeltisi ile sabitleme bağlanması ve / veya artan non-spesifik antikor bağlanması azalmış spesifik antikor ile sonuçlanan bir yüzey markerlerinin hücre dışı bölgelere değişikliklere neden olabilir. Görüntüleme akışının bir avantajı, bu tür bir yüzey sitometresi lekeleme görselleştirilir ve kalite böylece değerlendirilebilir. Noktalı, yerine üniforma gibi Ter119 gibi bol yüzey belirteçleri için boyama overfixation gösterir ve alt formaldehitsülfoksilatlar bir karışımı yoluyla ele alınmalıdırhyde konsantrasyon ve tespitin kısa süreli.

Fiksasyonu takiben, en az 15 dakika boyunca buz üzerinde tutarak hücreleri nedeniyle sıcaklık farkları için geçirimli hale işlemi sırasında aşırı hücre kırılmayı önlemek için çok önemlidir. Aseton permeabilizasyon deterjan aracılı nüfuziyet daha kırılgan geç erythroids korur, ancak% 100 aseton gereklidir aşaması hücrelerin gözle görülür, fakat zararlı değildir, kaybına neden olur. Sonunda, soğuk FACS tamponu ile yıkamadan sonra, hücreler, antikor İnkübasyon oda sıcaklığında izin verilir.

Görüntüleme flowsitometri (oran büyütme arttıkça azalır) kullanılan lense bağlı olarak akışı bir dizi oranı (hücre / sn) sahiptir. Ölçümden önce son yıkama sonrasında, hücre peletleri, numunenin işlenmesini hızlandırmak amacıyla, küçük bir hacme (50-60 ul) içinde tekrar süspanse edilir önerilir. Yeniden örneklerin çok sayıda için(30 dakika içinde) uzun süreli seferin forma, Numuneler buz üzerinde tutulmalıdır.

Uzun vadeli enükleasyonun tahlil imünoblotlarını gibi biyokimyasal değerlendirme için enükleasyonun aşamada toplanan ve çekme-çıkışlar olabilir hücreleri yeterince üretmek amacıyla genişletilmiş bir eritroid hücre üretiminin yararına sunuyor. Fare 4 gün önce deney phlebotomized gereken her ne kadar hızlı enükleasyonu tahlili gerçekleştirmek için, sadece 2 gün gerektiren zaman yarar sağlar. Biz iki yöntem arasındaki enükleasyonun verimlilikte önemli bir fark görülmez. 7 daha önce tarif edildiği gibi not, hücre içi yapılar immünofloresans için gerekli olan permeabilization aşamasını gerektirmeyen, değerlendirme akış sitometrisi, enükleasyonu verim nicel değerlendirilmesi için en uygundur.

Tekniğin sınırlamaları

Yöntem, burada tarif edildiği İYElizes eritroid popülasyonları yükseltmek ve enükleasyonu aşamada bunları senkronize etmek için in vitro hidrokortizon içeren ortamda in vivo ve kültür stres eritropoezi kaynaklı. Bu koşulların her ikisi de büyük olasılıkla stres altında erythroblast-enükleasyonunu taklit. Buna ek olarak, hidrokortizon ölçüde eritroid verim ve kalımı arttırmaktadır. Hidrokortizon (dolayısıyla kaçınarak senkronizasyon) olmadan kararlı durum erythropoiesis ve kültür ile yabani tip farelerden elde edilen kemik iliği hücrelerinden enükleasyonun olayların benzer verim elde etmek için, birden fazla farelerin kültür hücreleri ihtiyaç ve çalıştırın ve Multi sayesinde daha bir çok olayları işlemek istiyorum -Spektral Görüntüleme Sitometrisi. Multi-spektral görüntüleme akış sitometri 60x kadar büyütme lens kullanarak son derece immunofloresan mikroskopi ile karşılaştırıldığında morfolojik verilerin toplanmasını hızlandırır rağmen, görüntüleme ile elde edilen gözlemlerin karşılaştırılması, klasik, Z-yığını ile akış sitometresini100x ve Z-yığın görüntüler aynı sitometresiyle görüntüleme akış ile ulaşılabilir değil yapıların 3 boyutlu bir izlenim vermek üzere kadar bir mikroskop objektif lens büyütme sağlar çünkü ve konfokal mikroskopi görsel daha iyi detay elde etmek için değerlidir hücre. Deney sitometrisi, bir multi-spektral görüntüleme akış toplanan benzer hücrelerin nispeten yüksek sayıda rastgele bir doğrultuda, kısmen farklı bir görünüm açısından gözlemler sağlar, bu sınırlama dengeler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını beyan.

Acknowledgments

Yazarlar uzman teknik destek için Amnis Corporation'ın (EMD Milllipore parçası) Cincinnati Çocuk Hastanesi Araştırma Vakfı ve Richard Demarco, Sherree Arkadaşlar, ve Scott Mordecai de Araştırma Sitometrisi Core teşekkür. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenen K08HL088126 ve R01HL116352 (TAK) verir ve P30 DK090971 (YZ).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
αMEM medium CellGro 15-012-CV
IMDM medium Hyclone (Thermo Scientific) SH30228.01
Stempro-34 SFM GIBCO (Life Tech) 10640
Stempro-34 nutrient supplement GIBCO (Life Tech) 10641-025
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Biologicals 512450
BIT9500 Stemcell Technologies 09500
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP-1600-100
Phosphate buffered saline (PBS) Hyclone (Thermo Scientific) SH30028.02
Penicillin/Streptomycin Hyclone (Thermo Scientific) SV30010
L-glutamine Hyclone (Thermo Scientific) SH30590.01
Isothesia (Isoflurane) Butler-Schein 029405
Histopaque 1.083 mg/ml Sigma 10831
BD Pharmlyse (RBC lysis buffer) BD Biosciences 555899
Acetone Sigma-Aldrich 534064
Formaldehyde Fisher Scientific BP 531-500
Hydrocortisone Sigma H4001
Stem Cell Factor (SCF) Peprotech 250-03
Interleukin-3 (IL-3) Peprotech 213-13
EPOGEN Epoetin Alfa (Erythropoietin, EPO) AMGEN available by pharmacy
CD44-FITC antibody BD Pharmingen 553133
CD71-FITC antibody BD Pharmingen 553266
Ter119-PECy7 antibody BD Pharmingen 557853
Phalloidin-AF488 Invitrogen (Life Technologies) A12379
β-tubulin-AF488 antibody Cell Signaling #3623
anti-rabbit AF488-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A11008
anti-rabbit AF555-secondary antibody Invitrogen (Life Technologies) A21428
AF594-cholera toxin B subunit Invitrogen (Life Technologies) C34777
pMRLC (Ser19) antibody Cell Signaling #3671
γ-tubulin antibody Sigma T-3559
Syto16 Invitrogen (Life Technologies) S7578
Draq5 Biostatus DR50200
Ferrous sulfate Sigma F7002
Ferric nitrate Sigma F3002
EDTA Fisher Scientific BP120500
15-ml tubes BD Falcon 352099
50-ml tubes BD Falcon 352098
6-well plates BD Falcon 353046
24-well plates BD Falcon 351147
Flow tubes BD Falcon 352008
Tuberculin syringe BD 309602
Insulin syringe BD 329461
Syringe needle 25-G 5/8 BD 305122
Capped flow tubes BD 352058
40-μm cell strainer BD Falcon 352340
Scalpel (disposable) Feather 2975#21
FACS Canto Flow Cytometer BD
ImagestreamX Mark II Imaging Flow Cytometer AMNIS (EMD Millipore)
Image Data Exploration and Analysis Software (IDEAS) version 4.0 and up. AMNIS (EMD Millipore)
Hemavet 950 Cell Counter Drew Scientific CDC-9950-002
NAPCO series 8000WJ Incubator Thermo scientific
Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter 392932
Mini Mouse Bench centrifuge Denville C0801

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. McGrath, K. E., Kingsley, P. D., Koniski, A. D., Porter, R. L., Bushnell, T. P., Palis, J. Enucleation of primitive erythroid cells generates a transient population of "pyrenocytes" in the mammalian fetus. Blood. 111, 2409-2417 (2008).
  2. Chasis, J. A., Mohandas, N. Erythroblastic islands: niches for erythropoiesis. Blood. 112, 470-478 (2008).
  3. Koury, S. T., Koury, M. J., Bondurant, M. C. Cytoskeletal distribution and function during the maturation and enucleation of mammalian erythroblasts. J Cell Biol. 109, 3005-3013 (1989).
  4. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nat Cell Biol. 10, 314-321 (2008).
  5. Keerthivasan, G., Small, S., Liu, H., Wickrema, A., Crispino, J. D. Vesicle trafficking plays a novel role in erythroblast enucleation. Blood. 116, 3331-3340 (2010).
  6. McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology. J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).
  7. Konstantinidis, D. G., et al. Signaling and cytoskeletal requirements in erythroblast enucleation. Blood. 119, 6118-6127 (2012).
  8. Giarratana, M. C., et al. Ex vivo generation of fully mature human red blood cells from hematopoietic stem cells. Nat Biotechnol. 23, 69-74 (2005).
  9. Chen, K., Liu, J., Heck, S., Chasis, J. A., An, X., Mohandas, N. Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis. Proc Natl Acad Sci U S A. (2009).
  10. Kalfa, T. A., et al. Rac1 and Rac2 GTPases are necessary for early erythropoietic expansion in the bone marrow but not in the spleen. Haematologica. 95, 27-35 (2010).
  11. Koulnis, M., Pop, R., Porpiglia, E., Shearstone, J. R., Hidalgo, D., Socolovsky, M. Identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the CD71/TER119 flow-cytometric assay. J Vis Exp. (2011).
  12. Yoshida, H., Kawane, K., Koike, M., Mori, Y., Uchiyama, Y., Nagata, S. Phosphatidylserine-dependent engulfment by macrophages of nuclei from erythroid precursor cells. Nature. 437, 754-758 (2005).
  13. Ortyn, W. E., et al. Sensitivity measurement and compensation in spectral imaging. Cytometry A. 69, 852-862 (2006).

Comments

0 Comments


    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Usage Statistics