Dissection de
1Institut Curie, Centre Universitaire, 2Université Paris Sud, Centre Universitaire, 3CNRS UMR 3347, Centre Universitaire, 4INSERM U1021, Centre Universitaire

Published 3/04/2014
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Biology

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Summary

Ce protocole décrit comment disséquer la crête neurale crânienne prémigratoire (NC) de Xenopus laevis neurulas. Ces explants peuvent être étalées sur la fibronectine et cultivées in vitro, ou greffés retour dans des embryons hôtes. Cette technique permet d'étudier les mécanismes de la NC transition épithélium-à-mésenchyme, la migration et la différenciation.

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Milet, C., Monsoro-Burq, A. H. Dissection of Xenopus laevis Neural Crest for in vitro Explant Culture or in vivo Transplantation. J. Vis. Exp. (85), e51118, doi:10.3791/51118 (2014).

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Abstract

La crête neurale (NC) est une population de cellules du tube neural dorsal transitoire qui subit une transition épithélium-à-mésenchyme (EMT) à la fin de la neurulation, migre beaucoup vers divers organes, et se différencie en de nombreux types de produits dérivés (neurones, cellules gliales, cartilage et l'os, les cellules pigmentées et endocriniens). Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer la prémigratoire crânienne NC de Xenopus laevis embryons, afin d'étudier le développement NC in vivo et in vitro. Le modèle de grenouille offre de nombreux avantages pour étudier le développement précoce; lots abondantes sont disponibles, les embryons se développent rapidement, le gain in vivo et la perte de stratégies de fonctions permettent la manipulation de l'expression des gènes avant NC dissection chez le donneur et / ou embryons hôtes. Les explants CN peuvent être plaqués sur la fibronectine et utilisés pour des études in vitro. Elles peuvent être mises en culture pendant plusieurs jours dans un milieu défini sans sérum. Nous décrivons également comment greffer NC explants de retourdans des embryons d'accueil pour l'étude de la migration et la différenciation NC in vivo.

Introduction

La crête neurale (NC) est une population de cellules embryonnaires transitoires qui se dégage du tube neural à la fin de la neurulation dans des embryons de vertébrés. Les événements de signalisation et génétiques qui contrôlent la spécification NC commencent dès la gastrulation Le NC est spécifié à la frontière entre le neural et ectoderme non-neural par des signaux provenant de tissus dorsaux environnantes. A la fin de la neurulation, les cellules subissent une transition NC épithélium-mésenchyme à-(EMT) et migrent en détail dans la suite de l'embryon routes stéréotypés en répondant à des signaux de guidage entourant. Une fois qu'ils ont atteint leur destination finale, ils se différencient en une vaste gamme de produits dérivés, par exemple les neurones, les cellules gliales, les os, le cartilage et les cellules pigmentées 1-5. En raison de leur contribution à de nombreux types de cellules et de tissus embryonnaires, les défauts à toute étape du développement des cellules NC, de l'induction de la différenciation finale, peut provoquer des syndromes congénitaux nommés neurocristopathies 6. Emanipulation Xperimental de la NC en développement à différents stades - Spécification, EMT, de migration et de différenciation - permettra d'améliorer notre compréhension de neurocristopathies et permettre la conception de stratégies thérapeutiques potentielles.

L'embryon de Xenopus laevis est un modèle de choix pour étudier le développement NC. Un grand nombre d'embryons sont faciles à obtenir, et la fécondation externe donne accès aux toutes premières étapes du développement. De nombreux outils sont disponibles pour manipuler expérimentalement X. laevis développement embryonnaire. Gain de fonction et knockdown gène sont faciles à effectuer par micro-injection de cellules individuelles de début blastulas. Tissus embryonnaires peuvent être coupés pour réassociation in vitro 7-11 ou tests de back-greffes 12,13.

Dans ce protocole, nous décrivons comment disséquer prémigratoire crânienne NC dans X. laevis neurulas fin, avant la migration. Ces explants peuvent être cultivées sur fibronectine coateplaques d pour étudier la migration et la différenciation en contrôlées in vitro conditions expérimentales. NC explants peuvent également être greffés sur des embryons normaux de l'hôte ou manipulées pour étudier leur migration et la différenciation in vivo.

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Protocol

Les expériences sont conformes à la réglementation nationale et européenne sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques et aux principes établis à l'échelle internationale de remplacement, de réduction et de raffinement.

Une. Préparation de plats fibronectine 14

  1. Introduire à la pipette 500 ml de 10 mg / ml de fibronectine culture primaire dilué dans 1 x tampon phosphate salin (PBS) dans une boîte de Petri en plastique standard (Ø 40 x 11 mm). Incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Remarque: si vous utilisez des plats en verre ou des lamelles de verre pour l'imagerie ultérieure, utiliser un / ml solution fibronectine de 100 mg.
  2. Rincer trois fois avec PBS 1x.
  3. Remplacer PBS avec 500 ml de 1 x PBS contenant 0,1% albumine de sérum bovin (BSA). Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
  4. Rincer trois fois avec PBS 1x.
  5. Remplissez avec PBS 1x et conserve à 4 ° C jusqu'à utilisation (généralement pendant 24-48 h).

2. Dissection des explants NC

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  • Préparer 3/4 normale amphibie moyen (NAM) (110 mM NaCl, 2 mM de KCl, 1 mM de Ca (NO 3) 2, 1 mM MgSO4, 0,1 mM d'EDTA, 1 mM de NaHCO 3, 0,2 x PBS, 50 mg / ml gentamycine 10,15). Ne gardez pas plus de 1 semaine pour la dissection, conserver à 4 ° C. NAM plus ancien peut être utilisé pour la préparation de plats de dissection agarose revêtu (ci-dessous).
  • Préparer 60 mm boîtes de Pétri pour la dissection, revêtues avec 10 ml d'agarose à 2% dans 3/4 NAM.
  • Récupérer des outils de dissection: pipettes Pasteur en plastique, une broche plus beaux insectes monté sur support de broche (voir le tableau des matériaux pour la référence), un "couteau de sourcil" (en poils de sourcils inclus dans la paraffine à l'extrémité d'une pipette Pasteur en verre 16), deux beaux pinces à dissection, P1000 pipette et des conseils, un stéréoscope binoculaire avec un grossissement 8-40X à 50, une source de lumière brillante avec des guides de fibres optiques. Tous les outils de dissection doivent être maintenus propres, après chaque expérience, les rincer deux fois avec de l'eau distillée, une fois with 100% d'éthanol et laisser sécher. Conserver à l'abri de la poussière.
  • Remplissez le plat de dissection avec NAM frais presque au sommet.
  • Obtenir X. laevis embryons selon les procédures standard 10 et les vieillir jusqu'à ce qu'ils atteignent neurula étape 16 (selon Nieuwkoop et Faber tableau de développement 17).
  • Placez étape 16 embryons dans le plat de dissection à l'aide de la pipette Pasteur en plastique.
  • Effectuer toutes les étapes ultérieures dans le cadre du champ binoculaire. Retirer la membrane vitelline avec deux paires de pinces. Veillez à ne pas endommager la partie dorsale de l'embryon.
  • Attendez jusqu'à ce que les embryons ont atteint le stade 17 pour commencer la dissection. Etape 17 est approprié depuis la crête neurale est clairement mis à part le tube neural, contrairement aux étapes précédentes. Après l'étape 17, NC commence la migration et se mêlant à la mésenchyme environnant.
  • Creusez un petit trou dans l'agarose avec des pinces pour faire un créneau pour les embryons afin de maintenireux au cours de la dissection. Placez un embryon dorsale vers le haut. Remarque: la pâte à modeler peut être utilisé pour maintenir les embryons de creuser un trou à la place dans l'agarose.
  • Faire une incision dans la partie latérale du pli neural antérieur avec le couteau à sourcils et l'axe d'insecte. Veillez à ne pas aller trop loin dans l'embryon: viser à couper à travers 2-3 couches de cellules (jamais atteindre le plus profond que le archenteron!). Pendant tout le processus de dissection, ne laissez jamais les tissus disséqués pour entrer en contact avec l'interface air-liquide depuis X. tissus embryonnaires laevis sont lysées par la tension superficielle.
  • Faire un deuxième incision parallèle dans la partie la plus dorsale du pli de neurones en utilisant les mêmes instruments.
  • Si nécessaire, tourner le plat autour de 90 °. Faire une troisième incision avec le couteau perpendiculaire à sourcils et l'axe d'insecte, à la face postérieure des deux premières incisions. Le NC est une masse épaisse de cellules sous la couche externe pigmentée de l'ectoderme, latéraldans le tube neural.
  • Utilisez la pointe du couteau de sourcil de détacher la couche pigmentée de l'ectoderme NC sous-jacent, à partir du troisième bord de l'incision.
  • Utiliser le côté du couteau de sourcil pour détacher le tissu NC partir de la troisième incision. Le tissu NC est plutôt grisâtre, tandis que le mésoderme céphalique sous-jacente est blanc. Séparez délicatement le NC du mésoderme.
  • Détachez le tissu NC antérieure de la vésicule optique, et couper à ce niveau pour libérer l'expiant. Comme un contrôle de premières expériences, contrôle l'expression de snail2 (un marqueur NC canonique) dans certains explants par hybridation in situ est recommandée.
  • 3. Les explants de placage sur la fibronectine

    1. Remplissez le plat de fibronectine avec modification Danilchick moyen (MDM, NaCl 53 mM, Na2CO 3 5 mM, K gluconate de 4,5 mM, Na gluconate de 32 mM, MgSO 4 1 mM, CaCl2 1 mM, BSA 0,1%, ajuster le pH à 8,3 avec 1 M Bicine
    2. Transférer les explants dans le plat de la fibronectine revêtu à l'aide d'une pipette P1000. Ne laissez jamais les explants de toucher l'interface air-liquide. Tout d'abord, la pipette du liquide dans la pointe, puis les explants, puis certains nouveau liquide. Ne pas permettre à l'air dans la pointe tout en transférant les explants dans le plat de fibronectine. Une fois la pointe est à l'intérieur du liquide de la boîte de fibronectine, laisser les explants vont lentement par gravité, ou pousser très doucement. Évitez d'éjecter les explants trop vite.
    3. Placez 10-30 explants dans le plat à l'aide du couteau de sourcil. Éviter les parois de la capsule, qui ne sont pas adéquats pour l'imagerie ultérieure.
    4. Essayez de ne pas déplacer l'antenne jusqu'à ce que les explants ont attaché sur la fibronectine (cela prend environ 15-30 min). Si nécessaire, déplacez le plat très attentivement.
    5. Placer le plat dans un incubateur réfrigéré (entre 15-20 ° C, pour le graphique de température voir 17). Lorsqu'il est placé à 15 ° C, les cellules are la migration en général de manière efficace et de diffusion après 6 heures d'incubation (ce calendrier peut varier entre les expériences).

    4. Greffage explants dans des embryons d'accueil

    1. Coupez une lamelle de verre bien en très petits morceaux à l'aide de pinces grossières. La taille des pièces doit être d'environ 1,5 mm 2. Plongez les morceaux dans une boîte de Pétri contenant 3/4 NAM ou PBS en utilisant une pince.
    2. Préparation de l'embryon hôte: disséquer l'hôte NC à 3/4 NAM comme décrit dans 3) avec un soin particulier à ne pas endommager l'embryon hôte tout en enlevant la membrane vitelline et la dissection du NC. La tension du tissu tend à augmenter la taille de l'ablation: laisser l'embryon hôte soigne partiellement tout en disséquant le donneur d'embryon.
    3. Dans un autre plat d'agarose revêtues ou dans une autre partie du même plat, disséquer l'expiant NC de l'embryon donneur tel que décrit dans le protocole 3. Transférer la greffe NC dans le plat contenant l'hôte avec soin, comme décrit dansProtocole 3.
    4. Placer immédiatement l'expiant NC sur la zone d'ablation hôte en utilisant une pince. L'explantation devrait fixer partiellement. Placer un morceau de lamelle de verre sur l'embryon greffé à maintenir la greffe en place. Choisir un morceau de verre plus grand que l'embryon pour éviter de l'endommager. L'embryon sera un peu aplatie.
    5. Attendez au moins 15-20 minutes, puis retirez délicatement la lamelle. Que l'embryon récupérer pendant 10 min et la pipette avec précaution dans un plat propre rempli de 3/4 NAM, en utilisant la pipette Pasteur en plastique.

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    Representative Results

    Lorsque plaqué sur la fibronectine, les explants de la crête neurale attachent rapidement (15-30 min) et l'expiant propage à plat dans 2 heures (figure 1A). Après 3-6 cellules h commencent à se disperser. À 24 heures à 15 ° C, de nombreuses cellules ont commencé à migrer loin de l'explant (Figures 1B et 1C). Jaune rend les cellules très lumineux sous contraste de phase (figure 1B). protubérances cellulaires (filopodes et lamellipodes) sont clairement visibles après coloration phalloidin du cytosquelette d'actine (figure 1C).

    Pour l'expérience de greffe orthotopique, les embryons donneurs ont été injectés avec l'ARNm de GFP pour suivre les cellules greffées dans l'embryon hôte non marqué. Le crânienne OR a été soumis à une ablation sur un côté de l'hôte; 30-60 min après la chirurgie de la greffe est guérie, le remplacement de l'hôte ayant subi une ablation crânienne NC (figure 1D, 2 heures après la greffe). Quelques heures plus tard, les cellules GFP-positives ont migréà partir de l'explant et suivi les voies de migration stéréotypés de cellules NC vers des endroits cranio-faciales ventrale (figure 1E). En têtards, structures cranio-faciales NC dérivés ont développé (figure 1G). Lorsque crânienne NC a été soumis à une ablation, ces structures étaient absents, ce qui entraîne un visage raccourci avec l'oeil à côté de la glande de ciment (figure 1H, flèches rouges). En têtards greffés, les donateurs cellules NC ont contribué aux structures cranio-faciales, résultant en une morphologie de visage normale (figures 1F et 1I, flèches vertes).

    Figure 1
    Figure 1. In vitro et le comportement in vivo des explants NC crânienne. AC)   Prémigratoire NC a été disséquéà partir d'une neurula embryon étape 17 et plaqué sur un plat de fibronectine. A) 2 h après l'étalement, l'expiant a attaché et la propagation. B) 24 heures après l'étalement, les cellules ont efficacement migré sur la fibronectine. C) lamellipodes et filopodes sont clairement visibles dans la migration des cellules NC marqués avec phalloidin (vert) étape DI) Neurula 17 GFP + étiqueté prémigratoire NC a été prise à partir d'un embryon de GFP-injecté et back-greffé dans un embryon hôte, à partir de laquelle crânienne NC a été soumis à une ablation à l'étape 17. - 18. D) Deux heures après la greffe, l'explant a guéri. cellules EF) greffé NC ont activement migré hors et peuplé le flux mandibulaire comme indiqué au stade de têtard 31 et 41. étape G) contrôle 41 des têtards. H) l'ablation de la NC a abouti à un échec dramatique du visage et du développement de l'œil (H: noter que le gland de cimentd se développe à côté de l'oeil, du fait de l'absence de cellules NC peuplant les zones de la mâchoire, les flèches rouges. . Comparer à contrôler têtard dans G) F, I) En revanche, les cellules CN greffés ont restauré oeil et le développement des structures cranio-faciale (F, I, flèches vertes) AC, Les barres d'échelle = 100 mm;. DI, barre d'échelle = 1 mm . D, vue dorsale. l'assurance-emploi, des vues de côté. Ce chiffre a été modifié depuis Milet et al. 12 S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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    Discussion

    Ce protocole décrit une technique facile à explantation prémigratoire crânienne NC dans X. laevis embryons. Les embryons utilisés pour de telles expériences doivent être robustes et bien guérir. Jetez un lot d'embryons malsaines. En outre, les embryons se développer à des températures différentes (de 12 à 18 à 20 ° C), afin d'exciser la crête neurale, à l'étape 17 et pas plus tard. Après l'étape 17, la crête neurale peut être mélangé avec du mésoderme céphalique et ne peut pas être complètement éliminé. Tissus Xenopus guérissent rapidement et perdent leur adhérence à d'autres tissus. Il est important de travailler rapidement et mettre les explants de la crête neurale dans l'hôte dès qu'il est excisé du donneur.

    En ce qui concerne les expériences in vitro, des boîtes de culture de la fibronectine peuvent obtenir contaminés par des bactéries ou des champignons après une couple de jours. Utiliser du matériel et des solutions antibiotiques et propre ou stérile comme souvent que possible.

    Cette procédure est optimisé fou la crête neurale crânienne. En effet, cette population cellulaire est bien définie et localisée à l'étape 17 des embryons de Xenopus. Malheureusement, ce modèle n'est pas approprié pour effectuer ces expériences sur le tronc NC. embryons d'oiseaux sont plus appropriés pour ceux qui sont intéressés dans la manipulation de tels tronc NC population de cellules.

    Les explants décrites dans ce protocole peuvent être utilisées pour étudier les différents aspects de la NC comportement, à la fois in vivo et in vitro. Le programme de développement moléculaire NC est largement conservée chez les vertébrés 19. Le développement des grenouilles est un modèle puissant pour étudier vertébré NC EMT, la migration et la différenciation. X. cellules embryonnaires laevis contiennent assez jaune pour permettre leur survie in vitro pendant plusieurs jours sans ajout de nutriments externe. Ainsi, des études in vitro peuvent tester les effets de différents facteurs de croissance ou des composés chimiques, dans un milieu de culture simple et entièrement contrôlée. De telles expériences ont étéconçu pour analyser EMT et migration, y compris l'étude des effets de la chimio-attractifs ou répulsifs chimio-, d'activer ou de bloquer les voies de signalisation, etc 14,20-24 Cette approche peut également être utilisé pour concevoir l'amélioration des protocoles de différenciation NC dirigés. Dans le cadre de l'élaboration de protocoles pour la médecine régénérative, l'obtention types de cellules NC-divers dérivés in vitro pourraient être utilisés dans le dépistage des drogues pour comprendre et traiter neurocristopathies 25,26.

    Développement NC est orchestré par une interaction complexe entre les règlements et les cellules signaux autonomes des tissus environnants. Les manipulations expérimentales de l'expression des gènes, soit chez le donneur NC ou dans l'embryon hôte, permettent cellule discrimination autonome des aspects autonomes noncell de développement NC. Combinant gain de fonction et knock-down approches de ce protocole pour la culture in vitro et in vivo greffage a été utiliser avec succèsd 14,21,23,27-36.

    Cette technique peut être adaptée pour greffer d'autres tissus dans des embryons d'accueil et tester leur potentiel de migration et de différenciation. Par exemple, nous avons utilisé l'ectoderme du toit blastocèle pluripotentes (le «chapeau animal") pour trouver un interrupteur transcriptionnel minimal pour le développement NC. Nous avons étudié l'effet de deux facteurs de transcription, pax3 et ZIC1, sur NC engagement et le développement ultérieur. bouchons des animaux avec pax3 et ZIC1 gain de fonction ont été étalées sur la fibronectine in vitro ou backgrafted dans des embryons hôtes. Nous avons constaté que les cellules migrent et se différencient Pax3/Zic1-induced comme véritables cellules NC à la fois in vitro et dans des embryons d'accueil 12.

    De nombreux mécanismes moléculaires qui régissent NC EMT et la migration sont également impliqués dans la dissémination métastatique dans le cancer 37. Ce protocole vise à fournir un simple, pas cher et efficioutil de ent pour les biologistes du développement et d'autres chercheurs à explorer les mécanismes fondamentaux de ces comportements clés des cellules.

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    Disclosures

    Les auteurs n'ont rien à révéler.

    Acknowledgements

    Les auteurs remercient Adeline Dolly pour les photos de expiant sur la fibronectine, Eric Theveneau pour des discussions utiles et dans les animaleries de l'Institut Curie. CM est un stage postdoctoral de la Région Ile de France (Domaine d'Intérêt Majeur souches Pole), Université Paris Sud (Attaché Temporaire d'Enseignement et de Recherche), et l'Agence Nationale de la Recherche. Ce travail a été financé par l'Université Paris Sud (Attractivité 2011), le Centre National de la Recherche Scientifique (Programme d'Action Thématique et Incitative), Association pour la Recherche contre le cancer Grant SFI20101201882, Ligue contre le cancer, et l'Agence Nationale de la Recherche (Agence Nationale de la Recherche Programme Blanc).

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    Fibronectin from bovine plasma Sigma F4759-1MG
    Bovine Serum Albumin, Fraction V Euromedex 04-100-811-C Lower quality grade may  be suitable for this application
    Stainless Steel Insect Pins, Size 000 FST 26001
    Dumont #5 forceps 0.05 mm x 0.02 mm FST 11252-20

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

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