성인 마우스 앞니의 치아 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

Biology

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Summary

지속적으로 성장 마우스 앞니는 치아 상피 줄기 세포 (DESCs)에서 치아 조직의 재생을 연구하기위한 모델을 제공합니다. 일관되고 안정적으로 앞니에서 이러한 세포를 획득하고 체외에서 그 확장을위한 강력한 시스템은 여기에보고됩니다.

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Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

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Abstract

치아 재생 및 갱신 기초가되는 세포 및 분자 메커니즘을 이해하는 것은 큰 관심을 1-4의 화제가되고, 마우스의 앞니는 이러한 프로세스에 대한 모델을 제공하고있다. 이 놀라운 기관은 동물의 삶 전반에 걸쳐 지속적으로 성장하고 (혀 쪽) (입술 쪽)으로 아랫 입술과 언어 자궁 루프 (CL) 지역에 자리 성체 줄기 세포의 활성 풀에서 필요한 모든 종류의 세포를 생성합니다. 순측 CL로부터 남은 치과 줄기 세포 순측 표면에 에나멜, 치아의 외피를 생성 ameloblasts로 야기. 이 비대칭 에나멜 형성 절치 팁에서 마모를 허용하고, 근위 앞니의 원종 줄기 세포는 치아 조직이 지속적으로 보충되도록. 체외에서이 전구 또는 줄기 세포를 분리하고 성장하는 능력은 자신의 확장을 허용하고 시간과 같은 생체 내에서 달성 할 수없는 수많은 실험에 문을 엽니 다잠재적 인 줄기 세포 규제 요인 고등학교의 처리량 테스트. 여기, 우리는 설명하고 마우스 앞니의 입술 CL에서 문화 세포에 안정적이고 일관성있는 방법을 보여줍니다.

Introduction

척추 동물의 독특한 특징 중 하나는 치아의 진화이다. 분자 경로와이 기관과 관련된 형태의 전문 분야가 발달하고 진화 생물 학자 (5)에 의해를 포함하여, 여러 가지 관점에서 조사 된 바와 같이 치아는, 연구의 많은 분야에 대한 중요한 모델 시스템이되고있다. 최근 재생 의학의 필드는 모델로서 치아를 사용하여 귀중한 통찰력을 얻기 위해 시작했다. 특히, 치과 상피 줄기 세포의 발견은 중요 미리 6-13왔다.

모든 설치류는 성체 줄기 세포의 조절을 연구하기 위해 이러한 치아에게 접근 모델 시스템을 만들고, 그 성장 줄기 세포에 의해 연료가 공급되어 지속적으로 성장 앞니를 가지고있다. 유전 적 혈통 추적 실험 8,9,12,14 다음에 1970 년대, 11의 레이블 실험, DESCs은 앞니의 인접 지역에 거주하는 것을 증명하고있다. 줄기세포 입술 자궁 루프 (CL)로 알려진 추정 틈새 시장 중 입술 측면 이동 상피 구획의 자손, 그리고 대중 교통 증폭 (TA) 세포 (그림 1)라는 세포의 인구에 기여한다. 특히, DESCs는 외부 에나멜 상피 (OEE) 및 성상 세망 (SR) 8,9,14에 상주하고, 내부 에나멜 상피 (IEE)의 다음 움직임을 세포 횟수에 제한을 통해 진행 TA 세포에 상승을 제공하고 원심 앞니의 길이 (그림 1)을 따라. 마우스 앞니의 차별화 ameloblasts는 하루 (15, 16)에 약 350 ㎛의 놀라운 속도로 앞니를 따라 원심 이동을 계속합니다. 그들이 움직일 때, 세포는 성숙한 ameloblasts 및 지층 매개물 (SI) 세포로 분화. 에나멜 매트릭스의 전체 두께를 증착 한 후, ameloblasts 많은 아폽토시스를 받아야하고, 나머지 셀의 크기가 축소 및 에나멜 성숙 조절 <> 17 일 저녁을 먹다. 이러한 SR 등 순측 CL,에 다른 세포 유형의 계보는 덜 선명하고 간엽 18 및 설측 CL의 줄기 세포에 관한 데이터 만 등장하기 시작하고있다.

절치 마우스 모델을 사용하여, 그룹의 개수는 유전 경로 및 천연 줄기 세포 기반 장기 내구성에 관련된 세포 생물학적 과정을 명료하게하기 위해 노력했다. 그러나, 입술 CL은 약 5,000 일차 전지는 도전 작업을하게 마우스 앞니, 당 것으로 추정 세포의 상대적으로 적은 수를 포함합니다. 따라서, 노력은 문화에 만들어 생체 내에서 달성 할 수없는 실험적인 접근 방식에 새로운 문을 열기 위해 체외 6,16,19,20에서 이러한 세포를 확장하고 있습니다. 가장 최근의 연구는이 세포가 자기 갱신 때 배양 13 세포를 발현하는 유전자 성별 감식로 분화 할 수있는 것을 모두 보여 주었다. 여기, 우리는 일하기위한 방법을 설명하고 보여마우스 입술 CL에서 세포의 전자 신뢰할 수 있고 일관성있는 문화.

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Protocol

성인 마우스 1. 해부 낮은 헤미 - 턱

  1. 이전에이 프로토콜을 수행하기에 필요한 기관의 승인을 받아야하고 모든 동물 보호 지침을 준수해야합니다. 표준 IACUC이 절차를 승인하여 동물을 안락사. 이 작품에 대한 CO 2 질식 자궁 전위 다음에 사용되었다.
    1. OPTIONAL : 면도날을 사용하여 신체의 나머지 부분으로부터 분리 된 헤드.
  2. 목 둘레에 아랫 입술로부터 피부를 제거합니다.
  3. 메스를 사용하여, 느슨하게 연결되어있는 두 개의 낮은 앞니 사이에 절개를합니다. 압력을 적용하면, 하악은 두 부분으로 분할됩니다.
  4. 턱을 분리 턱의 관절 돌기 및 시간 하악 관절과 턱 근육과 함께 컷 사이의 메스 웨지.
  5. 단지 뼈가 남을 때까지 모든 근육, 힘줄 및 인대를 제거합니다.

2. 앞니를 분리

  1. # 15 메스를 사용하여조심스럽게 막 지역의 기단에 말단부에서 45 ° 각도로 뼈를 깎아. 가장자리에 뼈 조각 등의 남은 뼈를 멀리 선택하는 메스의 팁을 사용합니다. 천천히 단지 3 차 몰 이하로 시작, 하악의 설측 피질골 판에서 떨어져 선택하기 시작합니다.
  2. 앞니가 CL을 포함하는 지역을 향해 조심스럽게 작업, 깨끗해질 때까지 계속합니다.
  3. 하치 신경 다발을 제거합니다.
  4. 먼저 CL에 인접한 뼈와 조직을 제거하는 깨끗한 상처를 확인합니다.
  5. 대략 2 차 몰 아래의 메스와 원심 두 번째 컷을 확인합니다. 근위 앞니 영역은 다음 뼈와 인접 앞니의 안쪽 표면 사이의 메스를 삽입에 의해 해부된다. 조직을 찢어하지 않도록이 신중하게 수행해야합니다. 절개 운동은 근위-말단이다.
    대안 STEP :
    나는 위의 지역에 따라 가능한 한 많은 뼈를 제거ncisor. 지역이 해제되면, 조심스럽게 에나멜 부분에게 CL 지역에 가장 가까운을 처리하기 위해 크기에게 5 개의 집게를 사용하여 전체 앞니를 제거합니다.
  6. 낮은 부착 판에 4 ° C에서 3 ~ 4 시간 동안 1X PBS의 2 % 콜라게나 제의 해부 조직 (대체 단계 2.5에서와 같이 그림 3E와 같이 고립 된 CL, 또는 전체 앞니 중 하나)을 놓습니다. 1-10 앞니를 들어, 12 - 웰 플레이트에 웰 당 100 μl를 사용합니다. 보다 큰 10 앞니의 경우, 6 자 낮은 부착 플레이트에 웰 당 500 μl를 사용합니다.

3. Microdissect 순음 자궁 루프

  1. 차가운 DMEM/F12 미디어의 콜라게나과 장소에서 CL 영역을 제거합니다.
  2. 크기 5 겸자 또는 인슐린 주사기 (1 CC, 28 G ½) 중 하나를 사용 CL의 하단부에 부드럽게 당겨; 상피 세포는 그대로 유지하면서 중간 엽 떨어져 떨어질 것이다. "날개 같은"구조로 옆으로 확장 CL과 인접한 상피 볼 수 있습니다.
  3. 제거양쪽에 V 모양의 절개를하고, 즉시 얼음에 차가운 DMEM/F12에 배치하여 인접한 상피 세포의 꼭대기의 꽃 봉오리.
  4. 1.5 ML의 미세 원심 분리 튜브에 수집, 모든 CL에서 반복합니다.
  5. , 검체의 미세 튜브를 스핀 다운 매체를 제거, 100 ㎕의 세포 분리 솔루션으로 교체합니다.
  6. 37 ℃에서 30 분 동안 세포 분리 솔루션의 조직을 품어
  7. 부드럽게 피펫 팅 상하 1000 μL 저 밀착성 피펫 팁을 사용하여 단일 세포 현탁액을 생성하는 조직을 해리. 세포는 또한 분리를 달성하기 위해 멸균 셀 스트레이너를 통해 배치 될 수있다.
  8. 조직 배양 플라스틱 또는 기타 원하는 재료에 혈구, 접시에 세포를 계산합니다.

DESCs 4. 차 문화

  1. 6 - 웰 플레이트에 플레이트 세포 1-6에서 X 10 ~ 20 N의 농도로 마우스 EGF 재조합 단백질로 보충 된 DMEM/F12 구성 DESC 미디어에서 4 세포 / ㎖,㎍ / ㎖, 25 겨 / ㎖의 농도, 1X B27 보충, 1 % 항생제 용액 (페니실린, 100 U / ㎖, 스트렙토 마이신, 50 ㎍ / ㎖)에서 FGF 재조합 단백질.
  2. 5 % CO 2 DESC 미디어 1 ㎖에 37 ° C에서 6 잘 접시에 도금 세포를 성장. 세포 부착 및 콜로니 형성 할 수 있도록 도금 후 5 일의 초기 문화를 방해하지 않습니다.
  3. 첫 번째 미디어의 변화를 위해, 새로운 미디어의 절반 볼륨 (500 μL) 오래 된 용지의 양 (500 μL)의 절반을 교체합니다. 미디어를 변경할 때 현미경으로 식민지를 확인합니다.
  4. 첫 번째 미디어를 변경 한 후 2 일마다 미디어 (1-2 ㎖) 변화하고 있습니다. 미디어를 변경할 때 현미경으로 식민지를 확인합니다.

5. 통로 DESCs

  1. 기음 미디어와 세포를 세척은 미리 예열 PBS로 3 배.
  2. 생리 식염수에 미리 예열 0.25 % 트립신 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가 파견 할 DESCs 10 ~ 15 분 동안 37 ° C에서 알을 품다.
  3. 트립신을 중화하는 DESC 미디어를 추가, 부드럽게 15 ML 원뿔 튜브에 세포 및 장소를 수집하는 조직 문화 판을 따라 피펫.
  4. 2 분 800 XG에서 세포를 스핀 다운.

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Representative Results

마우스 헤미 - 하악 하나에게 연속적 성장 앞니와 삼 뿌리 어금니 (도 1a)를 포함한다. 모든 치아는 상아질과 에나멜, 치아 크라운의 두 광물 구성 요소 (그림 1A1A ')로 구성되어 있습니다. 앞니의 집은 두 개의 줄기 세포 틈새는 입술 CL 및 언어를 구사하는 CL이라고 에나멜은 입술 쪽 (그림 1A ')에 독점적으로 형성되어있다. DESCs는 앞니의 법랑질 형성에 대한 책임과 입술 CL, 특히 OEE 및 SR (그림 1A '') 8,9에 보관되어 있습니다. 입술 CL은 IEE, TA 세포 및 SI (그림 1A를 '')가 포함되어 있습니다. 우리의 기술은 입술 CL (그림 1A '')의 DESCs의 해부 및 절연에 초점을 맞추고 있습니다. Krt14-액틴 GFP는 헤미 - 하악 (그림 1B)의 모든 상피 유래 세포를 표시하고 입술 CL 명확하게 볼 수 있습니다 죽우 하악 (그림 1B ', 흰색 화살표). 그것은 모든 세포 유형은 (보기도 1A와 비교 '및 B '') 높은 배율 하에서 확인 될 수 있음을 주목해야한다.

순측 CL로부터 DESCs의 절연을위한 절차는도 2에 요약 하였다. 간단히, 헤미 - 하악이 제 동물로부터 제거되고, 하악골가 순측 CL을 노출하도록 제거되고, 그 후에 순측 CL은에 콜라게나로 처리 주위의 중간 엽에서 상피 세포를 분리. CL은 microdissected 세포 분리 버퍼로 처리하고, 조직 배양 접시에 도금되어있다. 기본 턱 뼈의 아랫 입술 CL의 분리 (그림 3)와 미디어의 적절한 볼륨의 추가는 각각 고립과 식민지의 성장을 위해 필수적이다. 이 기술을 사용하여 형성 작은 꽉 상피 식민지, 7 일 (그림 4A)로 볼 수 있습니다이러한는 2-3 주가 (그림 4B)에서 큰 식민지로 성장.

그림 1
그림 1. 성인 마우스 앞니의 삽화입니다. (A) 성인 마우스 헤미 - 하악 광물 구성 요소, 에나멜과 상아질, 치아, 어금니와 앞니의 두 가지 유형을 표시합니다. DESCs이 보관되어 근위 앞니 영역이 강조 표시됩니다 '. (A') 2 줄기 세포 틈새 시장을 나타내는 근위 앞니의 화살보기, 입술 및 언어 자궁 루프 (된 lacI 및 LiCl을), 에나멜을 생성 ameloblasts하고, 상아질 형성 아세포. 독점적 ameloblast 조상 세포를 생성하고, 궁극적으로 된 lacI는 외부 에나멜 상피을 표시합니다. (A '') '' 절치 에나멜에 강조 형성 된 lacI, (OEE), 성상 세망 (SR), 내부 에나멜 상피 (IEE), 대중 교통 증폭 (TA) 지역과 계층의 매개물 (SI). SR은 서로 다른 밀도를 가진 모집단을 반영하기 위해 파란색과 진한 분홍색으로 표시됩니다. 형광 기자 마우스, KRT14-EGFP/Actb를 사용하여 자궁 경부 루프 (B) 시각화. 뼈는 비교적 autofluorescent이며 뼈의 제거는 자궁 루프 (B ')하고 쉽게 절제 할 수 상피의 나머지 부분을 노출. (B '') OEE, IEE, TA를 포함한 자궁 루프의 전체 구조 및 SI 간단 리포터 유전자로 시각화 할 수있다. 스케일 바의 B ', B "= 2mm, B"= 50 ㎛. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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마우스 전치 절차. 도식 표현의 CL의 해부 및 격리의 그림 2. 개요. CL은 하악 전치의 기단부에 있습니다. 첫 번째 단계는 그대로 CL와 앞니를 노출하는 주변 턱뼈를 제거하는 것이다. 다음으로, 치아 기관은 중간 엽에서 별도의 상피 세포에 고립 된 2 % 콜라게나 제에 배치됩니다. 4 시간 배양 한 후, CL은 수동으로, 절제되고 단일 세포로 해리, 표준 조직 배양 접시 꼭대기 배양 하였다.

그림 3
기본 CL 영역을 노출하는 마우스 하악의 그림 3. 뼈 제거. 해부 프로세스의 뼈 제거를위한 시각 체크 포인트가 표시됩니다. (A)는 헤미 - 하악을 보여줍니다따고 단계 1.5, 근육, 힘줄과 인대가 뼈에서 제거하면. (B)은 CL을 포함하는 영역으로 근접하게 이동, 단지 제 3의 어금니 아래에서 시작, 뼈를 제거하기 시작하는 영역을 나타냅니다. 단계 2.4에서 언급 한 바와 같이 다음, CL 모든 골 근위은, (C)를 ​​제거한다. 단계 2.5에 명시된 바와 같이 뼈의 나머지 부분을 제거하기 위해 다음의 절개 (D)에 도시되어있다. 마지막으로, CL이 단계 2.6 (E)에 명시된대로 나머지 뼈에서 제거되고, 확대보기 (삽입).

그림 4
그림 4. 체외에서 성공적인 식민지 형성의 대표 결과.을 7 일 동안 문화 도금 후 DESCs의 A. 위상차 현미경,. 단단한 콜로니 형성이 성공적 상피 isolatio를 나타냅니다N없이 중간 엽 오염과. 스케일 바 = 400 μm의. B. 배양 10 일 후, 식민지의 크기가 큰 세포는 일반적인 상피 조약돌 형태가있다. = 100 μm의 스케일 바는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

상피 세포 40 년 전 21 ~ 24에 걸쳐 성공적으로 첫 번째 배양, 그리고 더 최근의, 상피 줄기 세포 25 ~ 27의 성공적인 분리 상피 생물학에 대한 우리의 지식을 전진했다. 우리는 성인 마우스 전치 DESCs 치과 생물학 및 에나멜 형성에 중요한 통찰력을 얻을 수있는 잠재력을 가지고 줄기 세포의 상대적 understudied 아르 집단을 분리하기위한 프로토콜을보고한다. 이 프로토콜은 처음에 모낭 28에서 상피 줄기 세포의 분리 이전의 보고서를 기반으로했다. 많은 프로토콜이 상피 줄기 세포를 유지하기 위해 세포층과 혈청을 사용하는 반면, 우리의 방법은 공급 무료, 혈청 시스템입니다. 그러나, 우리의 성장 매체는 EGF, FGF2와 B27 보충제의 칵테일의 사용을 요구한다. EGF는 긴 미분화 세포 29을 유지하는 데 사용되었습니다. B27와 함께 EGF와 FGF2의 칵테일은 문화 모낭 줄기 세포 (27) 이전에 사용되었다 B27 널리 배양 30, 31에서 신경 줄기 세포를 유지하기 위해 사용된다. 우리는 또한 이전에 조직 배양 플라스틱 꼭대기와 ECM의 다양한 기판에 DESCs의 생존과 성장 속도 특성을 측정하고, 어떤 차이가 확산 19의 비율로 검출되지 않았다. 세포는 최대 10 개의 시리얼 통로 19 일 동안 유지 될 수있다.

때문에 우리는 위 앞니에 비해 제거의 용이성이 절차에 대한 낮은 앞니를 사용합니다. 격리하는 동안 우리의 프로토콜 내에서 가장 중요한 단계는 콜라와 CL의 깨끗한 미세 절제에 배치하기 전에 하악골의 CL 영역의 완전한 제거이다. 근위 앞니는 매우 섬세하기 때문에 입술 CL의 손실이 발생할 수있는, 해부하는 동안 손상하지 않는 것이 중요합니다. 불완전한 제거는 labialCL의 잔해와 DESCs의 낮은 수율로 이어질 것입니다. 또, 비 C의 오염을 방지하는 것이 중요L 상피 세포. 상피 세포가 중간 엽에서 분리 된 후 따라서, 깨끗한 V-모양의 절개는 이웃 상피에서 입술 CL을 제거해야한다. 마지막으로, 10 밀리리터 당 4 x 1 이상의 세포의 농도로 이들 세포를 플레이트 및 제 미디어 변화 가동 매체의 절반을 남길 필수적이다.

치과 연구에이 프로토콜의 주요 장점은 효율적인 생산과 체외에서 DESCs 조작 할 수 있다는 것입니다. 마우스 앞니가 생체 내 모델 7-9,12,32-34, 생체 시스템의 개발로 설립되어 있지만 생체 내에서 수행하기 어려운 실험에 문을 열어 치과 연구 분야를 진행한다. 이 시스템의 장점은 쉽게 다양한 배양 조건, 단일 또는 복수의 신호 전달 경로를 쉽게 타겟팅에있는 세포를 조작 할 수있는 능력, 그리고 TA의 억제 또는 활성화 포함siRNA의 또는 성장 인자를 사용 rgeted 분자. 이 시험 관내 시스템의 하류 어플리케이션은 특히 단일 세포 수준에서, 기능적 및 / 또는 기계적인 연구를 수행하기 위해 상기 기재된 기술 등 최첨단 기술을 사용하여 포함한다.

전반적으로, 체외 배양 DESC에서 수집 된 정보는 줄기 세포를 기반으로 치아 갱신의 복잡성을 해명하는 데 도움이 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 관심의 충돌이 없습니다.

Acknowledgments

저자는 DESC 문화와 초기 도움을 수수 핑 왕 감사합니다. 저자는 (OH에 MGC, K08-DE022377-02 AHJ, K12-GM081266에 K99-DE022059 및 만듭니다에 R01-DE021420) 건강의 국립 연구소에서 장학금과 보조금에 의해 부분적으로 투자됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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