Isolamento e Cultura della Dental epiteliali cellule staminali del topo adulto Incisor

Biology

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Summary

Il mouse in continua crescita incisivo fornisce un modello per lo studio rinnovamento dei tessuti dentali da cellule staminali epiteliali dentali (desc). Un sistema robusto per modo coerente e affidabile l'ottenimento di tali cellule dal incisivo e in espansione in vitro è riportato qui.

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Chavez, M. G., Hu, J., Seidel, K., Li, C., Jheon, A., Naveau, A., Horst, O., Klein, O. D. Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor. J. Vis. Exp. (87), e51266, doi:10.3791/51266 (2014).

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Abstract

La comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che sono alla base di rigenerazione del dente e di rinnovamento è diventato un argomento di grande interesse 1-4, e l'incisivo del mouse fornisce un modello per questi processi. Questo notevole organo cresce continuamente per tutta la vita dell'animale e genera tutti i tipi di cellule necessarie dal pool attivi di cellule staminali adulte ospitate nella labiale (verso il labbro) e linguale (verso la lingua) ciclo cervicale (CL) le regioni. Solo le cellule staminali dentarie dal labiale CL danno luogo a ameloblasts che generano smalto, il rivestimento esterno dei denti, sulla superficie labiale. Questa formazione smalto asimmetrico permette all'abrasione sulla punta degli incisivi, e progenitori e cellule staminali nel incisivo prossimale garantire che i tessuti dentali sono costantemente rifornite. La capacità di isolare e coltivare cellule progenitrici o staminali in vitro permette loro espansione e apre porte a numerosi esperimenti non realizzabili in vivo, come high velocità sperimentazione delle potenzialità delle cellule staminali fattori regolatori. Qui, descriviamo e dimostrare un metodo affidabile e coerente per le cellule di coltura dalla CL labiale dell'incisivo mouse.

Introduction

Una delle caratteristiche uniche di vertebrati è l'evoluzione dei denti. Il dente è diventato un importante sistema modello per molte aree di ricerca, come le vie molecolari e specializzazioni morfologiche relativi a questo organo sono stati indagati da diverse prospettive, anche biologi dello sviluppo ed evolutivi 5. Più recentemente, il campo della medicina rigenerativa ha iniziato a ottenere preziose informazioni utilizzando il dente come modello. In particolare, la scoperta delle cellule staminali epiteliali Dental è un importante progresso 6-13.

Tutti i roditori possiedono incisivi in ​​continua crescita la cui crescita è alimentata dalle cellule staminali, rendendo questi denti di un sistema modello accessibile a studiare regolamento sulle cellule staminali adulte. Esperimenti di etichettatura nel 1970 10,11, seguita da lignaggio genetico esperimenti di tracciamento 8,9,12,14, hanno dimostrato che desc risiedono nella regione prossimale del incisivo. Lo steloprogenie di cellule nel compartimento epiteliale sul lato labiale mossa dalla nicchia putativo, noto come il ciclo cervicale labiale (CL), e contribuire ad una popolazione di cellule chiamate transito amplificando (TA) cellule (Figura 1). In particolare, desc risiedono nell'epitelio esterno dello smalto (OEE) e stellate reticolo (SR) 8,9,14, e lo smalto epitelio interno (IEE) dà origine alle cellule TA che il progresso attraverso un numero limitato di cicli cellulari e poi mossa distalmente lungo la lunghezza della incisivo (Figura 1). Le ameloblasts differenziazione nel incisivo topo continuano a muoversi distalmente lungo l'incisivo ad un tasso notevole di circa 350 micron in un solo giorno 15,16. Come si muovono, le cellule si differenziano in ameloblasts maturi e strato e transizione (SI) cellule. Dopo aver depositato l'intero spessore della matrice dello smalto, molti dei ameloblasts subiscono apoptosi, e le cellule rimanenti ridursi in dimensione e regolare smalto maturazione <sup> 17. La stirpe degli altri tipi di cellule del labiale CL, come la SR, è meno chiaro, e dati relativi alle cellule staminali nel mesenchima 18 e nella linguale CL stanno solo iniziando a emergere.

Utilizzando il modello incisivo del mouse, un certo numero di gruppi hanno lavorato per chiarire i percorsi genetici e cellulari processi biologici coinvolti nella naturale a base di cellule staminali rinnovo dell'organo. Tuttavia, il labiale CL contiene un numero relativamente piccolo di cellule, stimato in circa 5.000 a incisivo mouse, che rende il lavoro con cellule primarie impegnativo. Pertanto, gli sforzi sono stati fatti per la cultura ed espandere queste cellule in vitro 6,16,19,20 per aprire nuove porte per approcci sperimentali che non sono realizzabili in vivo. Lo studio più recente ha dimostrato che queste cellule possono sia auto-rinnovarsi e di differenziarsi in cellule che esprimono amelogenin quando coltivate 13. Qui, descriviamo e dimostrare un metodo per ªe cultura affidabile e coerente delle cellule dal labiale del mouse CL.

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Protocol

1. Sezionare inferiori Hemi-mandibole di topo adulto

  1. Prima di eseguire questo protocollo, avere necessaria l'approvazione istituzionale ed essere sicuri di rispettare tutte le linee guida per la cura degli animali. Euthanize animale utilizzando lo standard IACUC procedure approvate. Per questo lavoro CO 2 asfissia stato usato seguita da dislocazione cervicale.
    1. OPTIONAL: testa separata dal resto del corpo utilizzando una lama di rasoio.
  2. Togliere la pelle dal labbro inferiore per la scollatura.
  3. Usando un bisturi, fare un'incisione tra i due incisivi inferiori, che sono vagamente collegati. Dopo l'applicazione di pressione, la mandibola sarà diviso in due metà.
  4. Incuneare il bisturi tra il condilo della mandibola e dell'articolazione mandibolare temporale e tagliare lungo il massetere per staccare la mascella.
  5. Rimuovere tutti i muscoli, tendini e legamenti fino a che solo l'osso rimane.

2. Isolare la Incisor

  1. Usando un bisturi # 15, Radere accuratamente l'osso con un angolo di 45 ° dall'estremità distale all'estremità prossimale della regione membranosa. Utilizzare la punta del bisturi per raccogliere via qualsiasi osso residuo compresi i frammenti ossei sul bordo. Lentamente inizia a raccogliere via alla piastra corticale linguale della mandibola, partendo appena sotto il 3 ° molare.
  2. Continuare fino a quando l'incisivo è pulito, lavorando con attenzione verso la zona contenente la CL.
  3. Rimuovere inferiore fascio nervo alveolare.
  4. Fare un taglio netto prima rimuovere l'osso e tessuti prossimale al CL.
  5. Fare un secondo taglio distale con il bisturi, più o meno sotto il molare 2 °. La regione degli incisivi prossimale è poi sezionato inserendo il bisturi tra l'osso e la superficie mediale dell'incisivo prossimale. Questo deve essere fatto con attenzione, in modo da non strappare il tessuto. Il movimento incisione è prossimale-distale.
    PASSO ALTERNATIVA:
    Rimuovere il più possibile osso lungo la zona sopra il incisor. Una zona è azzerato, rimuovere con attenzione tutta la incisivo utilizzando una dimensione di 5 pinze per gestire la porzione di smalto più vicino alla regione CL.
  6. Posizionare il tessuto sezionato (sia CL isolato come in Figura 3E, o intero incisivo della Fase alternativa 2.5) in 2% di collagenasi in 1X PBS per 3-4 ore a 4 ° C in una piastra bassa aderenza. Per 1-10 incisivi, utilizzare 100 microlitri per pozzetto in una piastra 12 pozzetti. Per maggiore di 10 incisivi, utilizzare 500 microlitri per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti bassa aderenza.

3. Microdissect il Labial cervicale Loop

  1. Rimuovere regione CL dal collagenasi e il luogo in mezzi DMEM/F12 freddo.
  2. Tirare leggermente all'estremità inferiore del CL utilizzando dimensioni 5 pinze o una siringa da insulina (1 cc, 28 G ½); mesenchima cadrà a pezzi, mentre l'epitelio rimane intatto. Il CL e l'epitelio adiacente che si estende lateralmente come una struttura "ad ala" saranno visibili.
  3. Rimuoveregemma apicale dall'epitelio adiacente facendo un'incisione a V su entrambi i lati, e collocare immediatamente in DMEM/F12 freddo su ghiaccio.
  4. Ripetere per tutti i CL, raccogliere in 1,5 ml provetta per microcentrifuga.
  5. Spin down provetta per microcentrifuga con campioni, rimuovere i supporti, sostituirli con 100 microlitri soluzione distacco delle cellule.
  6. Incubare tessuti in soluzione distacco delle cellule per 30 min a 37 ° C.
  7. Dissociare i tessuti a produrre una sospensione singola cella pipettando gentilmente su e giù con un 1.000 ml a bassa aderenza punta della pipetta. Le cellule possono anche essere immessi attraverso un colino cellula sterile per ottenere dissociazione.
  8. Contare le cellule con emocitometro, sulla piastra di coltura tissutale di plastica o altro materiale desiderato.

4. Cultura primaria di desc

  1. Cellule piastra in una piastra da 6 pozzetti a 1-6 x 10 4 cellule / ml in mezzi desc, che consiste DMEM/F12 addizionato con il mouse EGF proteina ricombinante ad una concentrazione di 20 ng / ml, FGF proteina ricombinante ad una concentrazione di 25 ng / ml, 1X B27 supplemento, e la soluzione 1% di antibiotici (penicillina, 100 U / ml, streptomicina, 50 pg / ml).
  2. Crescere cellule piastrate su una piastra da 6 pozzetti a 37 ° C in 5% CO 2 in 1 ml di DECR media. Non disturbare culture iniziali per 5 giorni dopo placcatura per consentire l'adesione cellulare e la formazione di colonie.
  3. Per la prima modifica di supporto, sostituire la metà del volume (500 ml) di vecchi media con metà del volume (500 ml) di nuovi media. Controllare colonie sotto il microscopio quando si cambia supporto.
  4. Dopo il primo cambio media, continuerà a cambiare media (1-2 ml) ogni 2 giorni. Controllare colonie sotto il microscopio quando si cambia supporto.

5. Desc Passage

  1. Aspirare il terreno e lavare le cellule 3x con pre-riscaldato PBS.
  2. Aggiungere preriscaldata 0,25% tripsina-EDTA in soluzione salina e incubare a 37 ° C per 10-15 min per le desc da staccare.
  3. Aggiungi mezzi DESC per neutralizzare la tripsina, pipettare delicatamente lungo il tessuto piastra di coltura per raccogliere le cellule, e posto in una provetta da 15 ml.
  4. Spin le cellule a 800 xg per 2 minuti.

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Representative Results

Il mouse emi-mandibola comprendere una continua crescita incisivo e tre molari radicate (Figura 1A). Tutti i denti sono costituiti da smalto e dentina, i due componenti mineralizzate della corona del dente (Figure 1A e 1A '). Le case incisivi due nicchie staminali chiamato il labiale e linguale CL CL, e smalto è formato esclusivamente sul lato labiale (Figura 1A '). Desc sono responsabili della formazione incisivo smalto e sono alloggiati nella labiale CL, in particolare l'OEE e SR (Figura 1A'') 8,9. Il labiale CL contiene anche la IEE, le cellule TA, e il SI (Figura 1A''). La nostra tecnica è focalizzata sulla dissezione e isolamento desc del labiale CL (Figura 1A''). Krt14-actina GFP segna tutte le cellule epiteliali derivate della emi-mandibola (Figura 1B), e il labiale CL può essere visto chiaramente through mandibola (Figura 1B ', freccia bianca). Va notato che tutti i tipi di cellule possono essere identificate sotto alto ingrandimento (confronta figure 1A '' e B'').

La procedura per l'isolamento di desc dal labiale CL è riassunto in Figura 2. Brevemente, l'emi-mandibola viene prima rimosso dall'animale, osso mandibolare viene rimossa per esporre il labiale CL, e poi il labiale CL viene trattato con collagenasi di separare l'epitelio dal mesenchima circostante. Il CL è in paraffina, trattata con tampone di dissociazione cellulare, e placcato in piastre di coltura dei tessuti. Separazione del labiale CL dalla mascella osso sottostante (Figura 3) e l'aggiunta di una quantità corretta di supporto sono essenziali per l'isolamento e la crescita delle colonie, rispettivamente. Piccole colonie epiteliali, stretti formati usando questa tecnica sono visibili per 7 giorni (Figura 4A),e questi crescono in grandi colonie entro 2-3 settimane (Figura 4B).

Figura 1
Figura 1. Illustrazioni di dell'incisivo topo adulto. (A) Il topo adulto emi-mandibola che mostra i componenti mineralizzate, smalto e dentina, ei due tipi di denti, molari e incisivi. La regione degli incisivi prossimale, dove sono alloggiati i desc viene evidenziata in A '. (A'), vista sagittale dell'incisivo prossimale che mostra le due nicchie staminali, il ciclo cervicale labiale e linguale (LACL e LiCl), ameloblasts che generano smalto, e odontoblasti che formano dentina. Il LACL, che genera esclusivamente cellule progenitrici ameloblast e, infine, formano incisivo smalto è evidenziata in A''. (A'') Il LACL mostrando lo smalto epitelio esterno (OEE), reticolo stellato (SR), smalto interno epitelio (IEE), transit-amplificazione (TA) regione, e il intermedium falda (SI). La SR è rappresentato in rosa e blu scuro per riflettere le sottopopolazioni con quote differenziate. (B) Visualizzazione del ciclo cervicale utilizzando un mouse reporter fluorescente, KRT14-EGFP/Actb. Bone è relativamente autofluorescente, e rimozione dell'osso espone il ciclo cervicale (B ') e il resto dell'epitelio, che possono poi essere facilmente asportato. (B'') Tutte le strutture del ciclo cervicale compreso il OEE, IEE, TA e SI può essere facilmente visualizzato con il gene reporter. Bar Scala B ', B "= 2 mm B" = 50 micron. cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Figura 2. Sommario della dissezione e isolamento del CL dell'incisivo mouse. Rappresentazione schematica della procedura. Il CL è situato in corrispondenza dell'estremità prossimale della incisivo mandibolare. Il primo passo è quello di rimuovere circostante mascella per esporre l'incisivo con CL intatta. Successivamente, l'organo dente è isolato e posto in 2% di collagenasi epitelio separato dal mesenchima. Dopo 4 ore di incubazione, la CL è asportato manualmente, dissociato in singole cellule, e colto in cima piastre di coltura tissutale standard.

Figura 3
Figura 3. Rimozione ossea della mandibola mouse per esporre la regione CL sottostante. Punti di controllo visivo per la rimozione ossea del processo di dissezione sono mostrate. (A) mostra l'emi-mandibola unopo Fase 1.5, una volta che il muscolo, tendini e legamenti vengono rimossi dall'osso. (B) indica l'area per iniziare a rimuovere osso, a partire da appena sotto il molare 3 rd, muovendo prossimalmente verso la regione contenente il CL. Successivamente, tutti prossimale dell'osso al CL viene rimossa (C), come indicato nel passaggio 2.4. La successiva incisione per rimuovere il resto dell'osso come indicato nel passo 2.5 è mostrato in (D). Infine, il CL viene rimosso dal midollo rimanente come indicato nella Fase 2.6 (E), vista ingrandita (riquadro).

Figura 4
Figura 4. Risultati rappresentativi di formazione di colonie successo in vitro. A. Fase microscopio a contrasto di desc, dopo la placcatura in coltura per 7 giorni. Formazione di colonie stretto indica successo isolatio epitelialen senza contaminazione mesenchimali. Scale bar = 400 micron. B. Dopo 10 giorni di incubazione, le colonie sono di dimensioni maggiori e le cellule hanno un tipico acciottolato morfologia epiteliale. Barra della scala = 100 micron. Cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Le cellule epiteliali erano di prima con successo coltivate oltre 40 anni fa 21-24 e, più recentemente, di successo isolamento di cellule staminali epiteliali 25-27 ha avanzato la nostra conoscenza della biologia epiteliale. Riportiamo un protocollo per isolare la desc dell'incisivo topo adulto, una popolazione relativamente poco studiato delle cellule staminali che ha il potenziale per produrre importanti intuizioni in biologia dentale e la formazione dello smalto. Questo protocollo è stato inizialmente basata su precedenti rapporti di isolamento delle cellule staminali epiteliali del follicolo pilifero 28. Considerando che molti protocolli usano strati feeder e siero per mantenere le cellule staminali epiteliali, il nostro metodo è un sistema privo di siero di alimentazione gratuito. Tuttavia, il mezzo di crescita richiede l'uso di un cocktail di EGF, FGF2 e B27 supplemento. FEG è stato a lungo utilizzato per mantenere le cellule indifferenziate 29. Un cocktail di EGF e FGF2 con B27 è stata utilizzata in precedenza per capelli coltura le cellule staminali del follicolo 27, e B27 è ampiamente utilizzato per mantenere le cellule staminali neurali in coltura 30,31. Abbiamo anche misurato in precedenza le caratteristiche di vitalità e tasso di crescita della desc cima tessuto della cultura plastica e su una varietà di substrati ECM, e non sono state rilevate differenze nei tassi di proliferazione 19. Le cellule possono essere mantenute fino a 10 passaggi seriali 19.

Usiamo incisivi inferiori per questa procedura a causa della facilità di rimozione rispetto agli incisivi superiori. Le fasi più importanti all'interno del nostro protocollo durante l'isolamento sono la rimozione completa della zona CL dall'osso mandibolare prima dell'immissione in collagenasi e una microdissezione pulita del CL. Poiché l'incisivo prossimale è molto delicato, è importante non danneggiarlo durante la dissezione, che potrebbe provocare la perdita del labiale CL. Rimozione incompleta porterà resti della labialCL e una resa inferiore di desc. Inoltre, è importante evitare la contaminazione con non-CCellule epiteliali L. Così, dopo l'epitelio è stato separato dal mesenchima, un'incisione a V pulita dovrebbe essere fatto per rimuovere il labiale CL dall'epitelio vicina. Infine, è essenziale alla piastra queste cellule ad una concentrazione superiore a 1 x 10 4 cellule per ml e lasciare metà terreni condizionati per la prima modifica di supporto.

Il vantaggio principale di questo protocollo di ricerca dentale è che permette la produzione e manipolazione di desc in vitro efficiente. Sebbene l'incisivo mouse viene stabilito come un modello in vivo 7-9,12,32-34, lo sviluppo di un sistema in vitro avanza il campo di ricerca dentale aprendo le porte a esperimenti che sono difficili da eseguire in vivo. I vantaggi di questo sistema comprendono la capacità di manipolare facilmente le cellule in diverse condizioni di coltura, facile orientamento dei percorsi di segnalazione singole o anche più, e l'inibizione o l'attivazione di tamolecole rgeted con siRNA o fattori di crescita. Applicazioni a valle di questo sistema in vitro includono utilizzando le tecniche sopra elencate, nonché altre tecniche all'avanguardia per condurre studi funzionali e / o meccanicistici, in particolare a livello di singola cellula.

Nel complesso, le informazioni raccolte da DESC coltura in vitro può aiutare a svelare le complessità di rinnovamento dente basata sulle cellule staminali.

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Disclosures

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Acknowledgments

Gli autori ringraziano Xiu-Ping Wang aiuto iniziale con culture DESC. Gli autori sono finanziati in parte da borse di studio e sovvenzioni dal National Institutes of Health (K99-DE022059 a AHJ, K12-GM081266 a MGC, K08-DE022377-02 a OH e R01-DE021420 a ODK).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Forceps, size 5 Fine Science Tools 11251-30 FST by Dumont, Dumoxel
Forceps straight, fine, 3.5 Roboz RS5070
Razorblades Electron Microscopy Services #71960
Scalpel Handle No. 3 VWR
Feather Blade No. 15 Electron Microscopy Services #72044-15 Surgical Stainless Steel
Collagenase Type-1 filtered Worthington Biochemical Corporation #4214
Insulin syringe BD #329424
Accumax EMD Millipore #SCR006
DMEM/F12 Gibco 11320-033
EGF R&D 2028-EG-200
FGF2 R&D 233-FB-025
B27 Supplement Gibco 10889-038

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