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 JoVE Bioengineering

内皮増殖、バリアー機能、運動性の定量のための電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング

1, 1, 2

1Department of Pulmonary Diseases, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, 2Department of Physiology, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center

Article
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    Summary

    このプロトコルは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング、細胞の付着、増殖、運動性、および薬理学的および毒性刺激に対する細胞応答の定量化のための接着細胞のインピーダンススペクトルを記録し、分析する方法を検討します。内皮透過性および細胞 - 細胞および細胞 - 基質接点の評価の検出が強調される。

    Date Published: 3/28/2014, Issue 85; doi: 10.3791/51300

    Cite this Article

    Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

    Abstract

    電気細胞-基質インピーダンスセンシング(ECIS)は、接着細胞層内の細胞の挙動を定量化するためのインビトロインピーダンス測定システムである。この目的のために、細胞を、対向する円形金電極の上に特殊な培養室で増殖させる。一定の小さな交流電流は、電極および潜在的な両端で測定されている間に適用される。細胞膜の絶縁性は、電極間の電位増加をもたらす電流の流れに対する耐性を作成する。このようにして細胞のインピーダンスを測定することは、細胞の付着、増殖、形態、機能、運動性の自動化された研究を可能にする。留学生センターの測定自体は単純で習得が容易であるが、基本的な理論は複雑であり、正しい設定で正しい分析とデータの解釈の選択は自明ではありません。しかし、明確なプロトコルが実験から、個々のステップを説明準備、実現し、実験の分析にデザインができません。この記事の基本的な測定原理並びに可能な用途では、実験的な検討事項、利点およびECISシステムの制限が記載されている。ガイドは、拡散および増殖、細胞接着の研究のために提供され、バリア機能、細胞運動、細胞 - 細胞および細胞 - 基質接着の品質に関して融合層における細胞の挙動の定量化、および創傷治癒の定量および血管作動性刺激に対する細胞応答。代表的な結果は、ヒト微小血管(MVEC)およびヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)に基づいて説明したが、すべての付着増殖している細胞に適用可能である。

    Introduction

    ΩΩΩHere我々は留学生センター、文化1における接着細胞のインピーダンススペクトルを測定し、分析するための具体的な方法として知られている電気細胞-基質インピーダンスセンシングを提示。このプロトコルの目的は、インピーダンスベースの細胞アッセイこの特定のタイプの使用のために一般的に適用ガイドを提供し、アプリケーションの絶えず成長している番号からの重要な機能のいくつかのためのプロトコルを提供することです。焦点は、細胞増殖、バリア機能、細胞間結合および細胞運動性の研究になります。

    留学生センターと生物学的に関連するパラメータでインピーダンス分光データを変換し、その関連するモデルは1991年2イェーヴァーとKeeseで科学界に現在の形で導入されて以来、多くの場合(トランスTEERの測定のためのシステムと呼ばれている正確ではない上皮電気抵抗)、。違いは、最初はわずかなようだが、データ解釈のために重要である。古典的なTEERの測定では、細胞は、上皮タイトジャンクションまたは内皮接着結合3によって支配されて傍細胞輸送機構を特徴づけるために透過性のフィルター上で増殖させる。一般に、フィルタの上下に位置する2つの電極は、直流(DC)電圧降下測定するために4細胞層と他の2つの電極の上を流れに適用するために使用される。電気抵抗は細胞バリアの品質の数値的記述を可能にオームの法則を用いて計算される。

    留学生センターでは、この基本原理に従っており、それを拡張しています。 ECISシステムにおいては、細胞は、特殊な細胞培養皿の底に埋め込まれている対向する、円形の金電極上に成長させる。培養ウェルあたりの電極の数は、アプリケーションに依存する変数であり、電極が250μmの標準的な直径を有し、いくつかの場合において、より大きな対向電極回路を完成するために使用される。留学生センターではなく直流電流の与えられた周波数で1μAの一定の交流電流(AC)を使用しています。インピーダンスは、電極間(mV単位)の電圧の対応する変化から計算される。留学生センターでは、TEERに比べていくつかの利点があり、この記事で詳細に説明される周波数依存性細胞の性質を研究するために周波数範囲にわたってインピーダンスを測定する可能性を提供しています。まず、複素インピーダンスを測定する細胞バリア抵抗とセル容量に全体のインピーダンスを分離することができる。また、複数の周波数でデータを取得し、数学的モデルを適用することによって、人は同様に、細胞 - 基質相互作用(基礎となるマトリックスに基底細胞膜の距離)によって引き起こされる接合部インピーダンス(細胞 - 細胞接触の気密性)とインピーダンスとを区別することができ細胞膜キャパシタンスの寄与。第二に、細胞増殖および運動性は、細胞ので、評価することができるSは、電極と直接接触している。第三に、基板と電極は、明視野および位相差顕微鏡法を可能にするのに十分に薄い。

    インピーダンス測定の基礎:複素インピーダンス

    生物学的なオブジェクト( 例えば細胞)の電気インピーダンスの測定のための基礎は、オームの法則、抵抗(R)との関係を記述する基本的な電気技術原理、電流(I)及び電気回路の電圧(U)である所与の時間(t)における。
    DC回路に適用可能で:R(t)はU(トン)/ I(t)は

    ACシステムで作業する場合、電流と電圧は、その振幅が異なり、またそれらの位相(φ)だけでなく。今、抵抗は、もはやこれらの関係を記述するのに十分ではありません。代わりに、複素インピーダンス(Z)又はインピーダンスのほとんどの場合、大きさ(| Z |)再前述のオーム抵抗プラスリアクタンス(X)を含む、使用されているACからsultsは、電圧と電流5との間の位相シフトを駆動するコンデンサとインダクタを通って流れる。
    交流回路において適用:| Z(F)| =√(R 2 + X(F)2)
    φ=アークタンジェント(X / R)

    それらの膜の特性により、無傷の細胞上のインピーダンス測定を行う際に、細胞は抵抗とコンデンサとの並列接続として作用する。静電容量(C)はセルの分極を引き起こす、細胞膜の絶縁性二層における電気キャリアの分離を記述し、一方、ここで、抵抗は、電流の流れに反対を表す。これにより、Xは、細胞膜の容量特性によって支配される。
    X(F)≈(2 *パイ* * C セル F)-1

    Xは、周波数に依存するので、測定周波数の変化は、細胞の異なる機能的および構造的性質の研究を可能にする。 ECISデバイスを測定RおよびX、許可計算の両方の| Z |、C、φ。

    電気的等価回路:インピーダンス分光法で全体の細胞層を定量する。

    前述したように、セルが電界に持ち込まれたとき、それは受動電子部品の特性を示す。今、代わりに単一セルの電極の上に成長し、細胞培養培地を補充した全体の細胞層が検討されている場合には、抵抗とコンデンサの簡単なモデルは、全体の電気回路網に拡張する必要がある。このいわゆる等価回路では、電極/電解質の相互作用を特徴付ける培地(R メッド )ならびにキャパシタンス(C 電動式 )と抵抗(R 電動式 )の抵抗3,6を考慮する必要がある。

    付着し成長している細胞層のためのそのような等価回路を簡略化し、一般的な例を図1に記載されています。このような数学的Aの利点生体系を説明するpproachは、これらの回路は、 随意に洗練および細胞内小器官によって引き起こされるか、または細胞-細胞の影響(R 接合部 )および細胞-基質接着を区別するためにインピーダンスを考慮して、例えば、特定の実験の質問に調整され得ることである全体的なインピーダンス7,8 ON(R SUB)。それにもかかわらず、モデリングの目的は、常に意味のある相関関係を可能にするために測定されたインピーダンススペクトルのすべての機能を記述した要素の最小数を使用するようにする必要があります。

    図1
    図1。付着性に増殖している細胞層のための留学生センターシステムと代表的な等価回路の概略留学生センター文化の。A)クロスセクションよく。細胞が感知し、対向電極と、Aの上に成長している再培養培地で覆った。電極は、ロックイン増幅器に接続され、AC信号が定電流源を作成するために1MΩ抵抗を介して印加される。刺激は、任意の時点で培地に直接添加することができる。B)ECISは、インピーダンスへのすべての個々の寄与の合計を測定する。抵抗器(R 電動式 )とコンデンサ(C 電動式 )、また、電気的特性の並列結合として提示簡単にするためのものである、電極/電解質界面に起因する培養培地(R メッド )ならびにインピーダンスの抵抗並列抵抗の接続(R セル )とキャパシタンス(C 磁器 )によって記載され、細胞膜、の全てを考慮する必要がある。それは現在に向かって細胞透過性に依存するのでR 細胞は 、可変である。等価回路は、 随意に拡張し、改良することができる。例の接合部(R 接合部 )と同じくらいだけでなく、内皮下(R サブ )抵抗を回路に追加されたこと。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

    インピーダンスパラメータとその生物学的意義

    インピーダンス測定に由来する2つの最も直接的なパラメータは、セルの抵抗およびキャパシタンスである。抵抗は細胞障壁の品質と機能を表し、したがって、考慮パラ - およびトランス - 携帯電流の流れに対する耐性をとります。静電容量は、電極の適用範囲の全体的な尺度を提供する。留学生センターの特徴は、この記事の後半で説明します細胞 - 細胞および細胞 - 基質癒着、など、より多くの細胞の特性、についての洞察を提供する等価回路の助けを借りて、これらのグローバルパラメータをモデル化することである。

    実験consideを:開始する前に食料

    測定セットアップ -セットアップでいくつかの別々のコンポーネントで構成されています測定電子と留学生センター装置と、 - ;留学生センター·アレイと、選択した細胞培養、データ取得のためのPCまたは96ウェルシステム8用のアレイホルダ。アレイホルダをインキュベーターに入れて培養器外の留学生センターデバイスに接続する必要があります。 PCは、ECISソフトウェア(1.2.123.0 2013年2月14日)を備え、ECIS装置に接続する必要がある。

    アレイ選択 -複数のアプリケーション用に設計された留学生センターアレイを継続的に成長している様々ながある。標準配列は、それぞれ、(Eで示される)1又は10の測定電極を含む(Wで示される)8培養ウェルから構成され8W1Eと8W10Eアレイである。大対極は、回路を完了しますが、そのインピーダンスは実測6において、基本的に無視することができる。標準の8ウェルアレイホルダは、ホストすることができます2rrays、16培養ウェルの合計数になる。金電極は、50nm、厚い絶縁膜を線引きし、光学的に透明なレキサンポリカーボネート基板又はプリント回路基板(PCB)のいずれかを上に実装されている。 PCBのアレイは、より堅牢でコスト効率的です。透明スライドは光と免疫蛍光顕微鏡を可能にします。どのような考慮しなければならないこと1Eアレイは細胞の動きによって生じる抵抗信号の変動を高め、創傷治癒研究のために必要とされることである。さらに、単一の電極は、電気信号​​と光信号との相関を可能にする。マルチ電極アレイでは、信号は増加による測定領域に凹凸接種し、細胞の増殖によるデータの偏りを制限し、セルへの信号のボケ低減、測定における複数の細胞を含む、いくつかの電極にわたって平均され動き。したがって、マルチ電極アレイは、細胞増殖および障壁形成を研究するのに有用である。隣標準配列の特別な10走化性研究するための剪断応力9のアプリケーションで使用可能な配列、細胞遊走、および増殖ならびにハイスループットスクリーニングのために96ウェルプレートがある。結論として使用される配列には、科学的な質問や細胞の種類に強く依存しており、厳選してテストする必要があります。

    測定周波数 - Rbのモデリングとアルファ(データ分析を参照のこと)、マルチ周波数測定(MFT)が必要です。そうでない場合、インピーダンスは、データがより高い時間分解能で収集することができるという利点と、一つの細胞型、特定の周波数(SFT)で経時的に測定することができる。特定の細胞型のための最も感度の高い測定周波数は、周波数スキャンによって発見することができる。無細胞と細胞で覆われた電極が一番大きい違いは、細胞がTをブロック周波数である両対数グラフ周波数対周波数をそれぞれの抵抗をインピーダンスをプロットすると彼の現在最も効果的。内皮細胞(EC)の場合、この周波数は、約4 kHzである。

    播種密度 -密度播種すべての定期的なセルベースの実験とは、科学的な問題に依存します。接着および拡散又は障壁形成を研究するときに、内皮細胞を48時間後にコンフルエントな、安定したバリア性を保証するために/ cm 2で40,000〜60,000細胞の高い密度で播種されるべきである。実験の焦点は、増殖にある場合、内皮細胞は、約2,000〜10,000細胞/ cm 2の低密度で播種されるべきである。

    Protocol

    1。測定システムの作製

    1. 凝縮を防止するために、実験を開始する前に37℃インキュベーター中にアレイホルダを予熱し。
    2. 井戸の乾燥を避けるために、蒸留水で培養器の水棺を埋める。
    3. 無菌条件下で層流キャビネット内のセルおよびアレイ上のすべての操作を実行します。

    2。セルのアレイおよび接種の準備

    NOTE:ECISアレイは、ウェル間の再現性および信号対雑音比を改善するために、電極のドリフトを防止するために、実験前に洗浄し、安定化する必要がある。このため2つのオプションが用意されています。L-システインとB)留学生センターの安定化機能を備えた電極のA)の前処理。

    オプションA:L-システインは、最も一貫性のある前処理として推奨されますが、いくつかの特別な場合にタンパク質coatinと相互作用する可能性がある電極上のGS。提示されたボリュームは、標準の8ウェルアレイのために使用される。

    1. 200μl/ウェルの10mMのL-システインを追加します。システインは、高い再現性と電極容量を提供する電極表面をきれいにし、修正する。
    2. 室温(RT)で15分間インキュベートする。
    3. 超純水(タイプ1)で2回500μL/ウェルの洗浄。いくつかのタンパク質の吸着を妨害する可能性がリン酸緩衝液を使用しないでください。金表面を接触させる第一の巨大分子を吸着するので、また、コーティングの前に血清を含む溶液を避ける。
    4. 200μl/ウェル暖かい1%ゼラチンでコーティング。
    5. 37℃で30分間インキュベート
    6. ゼラチンを削除するが、表面の乾燥をさせてください。これは、電極が損傷することがあります。
    7. 超純水(タイプ1)で1回洗浄する。
    8. (血清、抗生物質及び全ての成長因子を含有)400μlの/ウェルの完全な細胞培養培地を加える。
    9. アレイホルダのANに配列をスライドさせてDアレイは9ゴールド平方パッドが正しくバネ仕掛けポゴピンから連絡し、タイトな調整ネジの手を固定されるように配置されていることを確認してください。透明の配列には注意して、金の層が簡単に損傷することがあります。
    10. 測定ソフトウェアと、個々のウェルの迅速なインピーダンス測定を実行するための「データの収集」にチェックが続く記者セットアップを開きます。得られた測定値は、ベースラインで、自動的に「コメント」に格納される。
    11. よくチェックが自動的に使用留学生センター·アレイのタイプを決定します。 "まあ設定」で選択された配列を確認してください。
    12. 配列図は、空または不正な接続井戸用に、正しく接続されている井戸の緑と赤に点灯。それでも、常に配列をホルダに正しく置かれたことを確認してください。
      注:クリーニングとコーティングが成功した場合は8W1E ECISアレイは、ACを持っている約5 nFの、それぞれ約2,000および200Ωの基準抵抗になる50 NF、の8W10Eアレイのapacitance。
    13. ホルダーから配列を取り出します。
    14. を400μl/ウェルの完全な細胞培養培地中の単一細胞懸濁液として種子細胞。

    オプションB:ECISの安定化機能は、L-システイン処理により、電極ドリフトまたはウェル間の抵抗の差が大きいと、容量の問題が発生した場合は、代替として、または組み合わせて使用することができる。

    1. タンパク質(オプション)とシステイン処理(オプション)とプレコート電極を行う。
    2. 各ウェルに完全培地200μl/ウェルを追加し、アレイホルダ内の配列に配置します。
    3. オープンな測定ソフトウェアと配列が正しく接続されているかを確認するために、最初のZ、R、およびCを測定するためのチェックが続き、プレスのセットアップ
    4. を押して、電極を安定させる約 3ミリアンペア)、高頻度(64 kHz)のパルスを印加します。
    5. もう一度電極を確認してください 。容量を大きくする必要があり、抵抗値が同程度の範囲であるべきである。
    6. 容量と抵抗値がまだ満足できるものではない場合は、安定化を繰り返します。
    7. ホルダーから配列を削除し、細胞を接種する。

    3。測定ソフトウェアとデータ収集の設定

    1. 前述したようにアレイホルダで配列を配置します。
    2. オープンな測定ソフトウェアと留学生センターの機器にECISソフトを接続し、別のよくチェックを実行する「データの収集」セクション [ 設定 ] ボタンを押してください。
    3. "まあ設定」で選択された配列を確認してください。
    4. 「まあコンフィギュレータにおいて測定されるウェルを選択イオン」を参照してください。
    5. 「データの収集」オプションから測定モードを選択します。
      1. 固定周波数での時系列に対して、 単一周波数を選択します。 /時間(SFT)と、ドロップダウンメニューから、測定周波数を選択します。
      2. 電極カバーとRbとAlphaのモデル化の測定には、 複数の周波数を選択します。 /時刻(MFT)。留学生センターデバイスは、利用可能なすべての周波数で自動的に測定します。
      3. 微動のための(データ分析を参照のこと) 迅速な時間を選択すると、(RTC)を収集し、測定周波数とサンプリング周波数を調整します。ここでは、標準的な時間分解能は秒(1 Hz)のごとに1つのサンプルですが、サンプリング周波数も(Zシータのための)25ヘルツまでのインピーダンスの急速な変化を追跡するために増加させることができる。重要な注意:RTCモードでのみ単一ウェルが測定される。
        注:微動、その後、いくつかのウェルで測定する必要がある場合は、>表示の専門家のツールバー/メニュー項目を助けるために行く>な回数だけuire>マルチウェルRTC。収集データセクションに時間制限(時間)を指定します。留学生センターは現在、番号順に選択されたウェルを測定します。測定を開始した後にソフトウェアがサイクル数を指定することが要求されます。測定を繰り返す必要があるどのくらいの頻度の値を入力します。
    6. SFTとMFTの場合は、測定値または間の時間間隔(秒)を選択し、データを可能な限り高速にチェックしない場合は、このオプションを残して取得する必要がある場合。
      注:留学生センターデバイスは最小SFT取得0.25秒の速度やMFT 7.5秒とうまく一方から他方へ切り替えるマルチプレクサを使用してデータを取得する。間隔を意味すると、選択したウェルと周波数の数に依存している。遅い増殖細胞の測定や時間に対する抵抗を単純に記録するため、600秒以上の間隔を使用しています。
    7. を押してスタート 、ファイルに名前を付けてデータを保存する場所を選択します。
      注:ファイルサイズはPRであってはならないoblem、留学生センターのデータはあっても、すべての測定周波数と選択したウェルの数百MBを超えることはありません*。ABPと呼ばれるプレーンテキスト形式の一種で保存されているからである。
    8. [完了]を押して実行を停止します。

    4。培地交換し、細胞操作

    1. を押して一時停止 、これはデータ収集を停止したが、実験的なクロックを実行していきます。
    2. ホルダーから配列を取り出して、層流ベンチ( すなわち変化媒体)の下でそれを操作。
    3. バックホルダーに配列を配置し、どちらの接続を確認するか、データ収集を継続するために実験を再開します。測定ソフトウェアは、データセット内のタイムマークを配置する。

    5。データ収集中に急性刺激

    NOTE:第二のオプションは、即時の変化に追従するために、データ取得中に細胞を操作することである。のみ可能です;試料は、実験の過程においてさらに、無菌である必要がないとき。

    1. ウェルに直接刺激を追加し、200μlのピペットで慎重に混合することを確認してください。
    2. マーク時刻マークを押して手動でポイントして、コメントを追加します。

    6。電気創傷は

    注:使用する細胞の種類に合った設定を見つけることは、電気的な創傷のための鍵となります。負傷は創傷が長すぎる、および/または粗いと、これは(特に透明アレイ上)の電極に損傷を与えることができ、一方、これは、細胞の除去が不十分になることが短すぎる。そのため、いくつかの短い創傷パルスが推奨されます。 HUVECの培養に2 10月20日秒長いそれぞれがECIS 1600Rを使用して、最適な発見されている60 kHzで、5Vのパルスを負傷。一般的には、セル全体に均一高磁場を維持するために、電極への損傷を避けるために> 20 kHzの高い周波数を使用することをお勧めします。

    1. DURが負傷行うアクティブECIS測定をING。
    2. 傷/エレクトロポレーションの設定を有効にし、 傷をクリックして、時間(秒)を記入し、創傷の電圧(1600 R用V)または電流(ZおよびZ-シータのためμA)と周波数(Hz)。表示されたデフォルト値がアレイとECISデバイスのタイプに基づいている。
    3. "まあ設定」に巻かするウェルを選択。のみチェックし、ウェルを負傷されます。
    4. 時間までの遅れを有効にして、遅延創傷機能をアクティブにするために、遅延時間を入力します。この機能は、 停止キー押すか、手動で創傷を適用することによって、いつでも停止することができる。一つだけdelayコマンドは、一度にアクティブにできる。
    5. を押してアクティブにし、負傷を開始するには、ポップアップウィンドウで[OK]をクリックします。
    6. 抵抗信号が負傷を繰り返し、それ以外の場合は負傷後のオフセットインピーダンスに低下していることを確認してください。

    7。データ解析

  • データ表現とエクスポート。
    1. >開く-ファイルを介して設定された仕上 ​​がり測定やデータをロードします
    2. "まあ構成」ウィンドウから表示されるようにウェルを選択。平均を提示するグループ個々のウェル。
    3. 上部のツールバー(Z、RまたはC)から、表示すべきパラメータを選択した。
    4. 上側のツールバー(T =時間、F =周波数、3D =滝ブロット)から選択し、グラフの種類。
    5. グラフウィンドウ下のスライダーで、グラフのオフセット範囲を定義したり、隣接するコントロール内の正確な値を入力します。
    6. データの平均や正規化を実行し、標準偏差を実行するための「分析」の項で、基本的な「時系列のオプション」から選択しました。
    7. Nyuistプロットと、フーリエ変換など、より高度な操作のための[ヘルプ ]メニューの専門家のツールバーをアクティブにします。
    8. RAを定義するために「分析」セクションの「表示オプション」を使用するx軸とy軸との輸出グラフのNGE。
    9. エクセル(選択)にし>て、必要に応じて詳細な分析、統計、表現のための選択のサードパーティ製のソフトウェアを使用する- >データのエクスポート-エクスポートはファイル使用してExcelファイルにデータを選択した。
  • Rbおよびアルファのモデル化。
    注:これをモデル化するための基準として十分満たされた無細胞培地を使用することをお勧めします。
    1. 仕上げMFT測定や負荷のMFTデータセット。
    2. 無細胞参照している場合も利用押すと、自動的に「分析」セクションの「周波数スキャン·モデリング」から手動で無細胞時点を選択するために基準値を設定を選択することが見つけるのいずれかです。
    3. まだ無細胞参照が存在しない場合、別のデータセットから基準値を読み込む。設定された基準データを開きます(同じ配列および培地を使用したことを確認してください)、Find 使用するか、基準値を選択するように設定 。そして、測定データとプレスGETに移動します。
    4. 利用可能な使用して、工場出荷時に設定されていない無細胞参照データがない場合。
    5. 計算を開始するプレスモデル 。モデリングは、データセットのサイズに依存して数分かかることがあります。
  • 微動の計算。
    注:この計算は、測定ソフトウェアの一部ではなく、任意の信号処理ソフトウェアを用いて実施することができる。
    1. RTCの測定を終了するか、RTCデータセットをロードします。
    2. 全期間の平均した抵抗によって設定されたデータを正規化します。
    3. 256データポイントの長さのセグメントに設定されているデータを破壊し、ハニング窓により各セグメントを清掃してください。
    4. ランダムノイズを最小限に抑えるため、片面129ポイントのパワースペクトルに256ポイントのフーリエ変換と平均得られた周波数スペクトルを実行し、生体信号を増強した。
    5. 振幅に対してプロット周波数対数グラフと適用最小二乗線形フィット。
    6. 線形フィットの傾きは、全体的な信号のノイズと細胞のそれにより微動の尺度である。
  • Representative Results

    実験のセットアップは非常に簡単で、測定自体は、完全に自動化されたが、多くの場合そうであるように、正確な分析とデータの解釈は非常に重要である。代表的なデータセクションにガイドはECISとのインピーダンス分光法によって提供される最も重要なパラメータの解釈のために設けられている。これは、留学生センターの測定が有用であることができ、どのパラメータが記録されるべき科学的な問題のようなもののために決定されると参考になります。

    典型的な実験の読み出しは、通常、細胞接種し、細胞がコンフルエントに達するプラトーフェーズの後の成長フェーズに分けることができます。これらのフェーズは、それぞれ異なる細胞特性に関する情報を得られます。代表的な測定は、 図2に示すA)、細胞接着を分析するために4つのサブフェーズに分割し、拡散および増殖され、成熟EC障壁のB)形成、C)細胞遊走電気を生成した後ら傷、およびD)、血管作用薬トロンビンでの刺激に対する細胞応答。位相コントラストおよび免疫蛍光画像は、電極被覆、細胞状態、および記録されたインピーダンス信号の間のリンクを説明するために、異なるサブフェーズの間、測定電極から直接取得した。

    接着、拡散および増殖

    すべての細胞型は、細胞外マトリックスタンパク質または他の刺激によるコーティング、播種密度を変えることによって操作することができる特徴的な接着および増殖曲線を有する。これらのプロセスを研究するための主要な困難の一つは、拡散および増殖、接着性を区別することである。ウェゲナー 11は、これらのパラメータを区別するための抵抗と容量の組み合わせの使用のための詳細な記述を与え、 図3に、抵抗と静電容量が互いに補完できるかが明らかになる。それがために重要である接着およびここに電界がセルの周囲に排他的に流れるように電流を強制的にサスペンション8中の細胞の細胞膜の分極を引き起こすため、測定周波数の影響を理解するために、拡散の研究。細胞は、それらが電極(小数部分)に開口面積の割合で直線的に電極と静電容量が減少する上で拡散することにより、電流の流れを制限し始めるときに取り付ける。容量の低下は、電極被覆に比例する直接的では40kHz( 図3B)、より高い周波数での容量を記録する際従って、接着、拡散および増殖は、最良定量することができる。あるいは、その最も敏感な測定周波数における抵抗がコンフルエント関門( 図3A)への細胞の分化および成熟のための直接的な尺度である。部分的な区域に加えて、ウェゲナーらは、他の二つを導入t 1/2は電極の50%が細胞( 図3B、挿入)で覆われるまでの時間である(最大値の半分の容量)と、静電容量曲線(複数ではなく、勾配:接着および電極のカバレッジを定量化するパラメータ細胞拡散および増殖の速度など)を示す。

    バリア品質の尺度としての抵抗

    抵抗は、膜、電極および媒体から容量成分を無視しているため、バリアの品質と最高の機能を説明し、インピーダンスの一部です。透過性は、定義ごとに細胞 - 細胞接触にのみ依存するので、ここで用語バリア品質ではなく、透過性は、使用される。しかし、抵抗は、電流の流れを遮断する細胞およびそれらの細胞 - 細胞および細胞 - マトリックス相互作用の能力によって決定される。従って、異なる細胞型(クローンおよび継代)は、それらの固有抵抗値( 図4A)を有する。抵抗はあまりクレアを与えるが細胞障壁に関するRERのアイデアは、インピーダンス信号を常に考慮しなければならない。

    Rbおよびアルファのモデル化

    ECISソフトウェアは、特定の特徴、細胞-細胞および細胞-マトリックス接着( 図4Bおよび4 C)を区別つのパラメータをモデル化する能力を保有する。 Rbは(CM オームで)、電流の流れ、それによって古典透過性の逆指標に細胞間接触の抵抗である。高Rbは、電流の流れに向けて、低透過性を示唆している。アルファ(中センチメートル×0.5オーム)、細胞-電極接合に起因するインピーダンスの貢献のための尺度である。細胞-細胞および細胞-マトリックス接触を定量化するモデルがイェーヴァーとKeeseによって1991年に導入し、細胞を、絶縁膜を有する円形のディスク状のオブジェクトであるという仮定に基づいて、電極の上に置いて、電解質2導電で満たされている。ザ·高い測定周波数が使用される場合にのみ可能性(細胞 - 細胞接触の間にb)は、a)の腹側細胞の表面と電極との間、及びc)細胞を介して:細胞膜電流のための唯一の3つの経路を残すの絶縁性)。より詳細な導出は、説明をロー 3,12の論文に記載されています。

    微動

    なお、抵抗値信号( 図4A)の小さな変動がコンフルエントな細胞層の微妙な、ランダムな細胞の動きに起因するだけでなく、細胞が培養スパース2の電極オンオフ移動することが示されている。ローとオップによって記載留学生センターの経時的データのこの側面。13,14見落とされがちと1Eアレイとし、パラおよび細胞内の電流の経路を説明するために最も敏感な周波数で測定する場合に最もよく見られます。このセルの計算は、ノイズ(微動)が目の一部ではない原因とE標準測定ソフトウェア、最新のバージョンでは、高速フーリエ変換(FFT)が統合されていますが。 4 kHzで1時間、1 [Hz]のサンプリング周波数でRTCデータを記録するEC微動の計算のための十分な解像度を提供する。この計算は、単一の値を提供し、直接統計分析のために使用することができる。微動の周波数分析の使用の拡張の議論は他の場所で15見つけることができます。代替的に、他のFFT解析戦略がインクリメントの分散と同様に、使用することができる。分散が微動の小さな変化に対してより敏感であるが、このために、感度の個々の実験の比較が困難になる。パワースペクトルの傾きが微動のよりロバストな測定( 図4D)である。ここで、曲線下面積は、細胞が作成微動やノイズ量と見なすことができる。したがって、急峻なパワースペクトルの傾きの曲線下面積より小さいと微動小さい。

    電気創傷治癒アッセイ

    細胞の移動を研究するために、通常は機械的な傷は、ピペットチップ、細胞スクレーパーまたは特定のスタンプを培養プレートから細胞を傷つけ、顕微鏡で16彼らの再マイグレーションに従うことで適用されます。この方法は、傷の大きさが変化し、通常、創傷治癒過程に細胞増殖の影響を無視するには大きすぎる明らかな欠点を有する。留学生センターの創傷機能は、無細胞電極を得るために、高電圧、高周波パルスを使用し、その後、死細胞( 図5A)を交換する隣接セルの再マイグレーションをたどる。標準、労働集約的なスクラッチアッセイより、この自動化された方法の利点は、留学生センターが純粋な移行を研究するために、数時間以内に閉じ250μmの正確な直径を有する再現性の高い傷を生成することである。さらに、電気的なパルスがやるESタンパク質コーティングされ、分泌細胞外マトリックスを削除しない。細胞はすべての側面から電極上に再移行すると仮定して、移動速度を容易に創傷閉鎖17するのに要する時間によって巻き半径で割ることにより算出することができる。電気的な創傷の代替として、最近、いわゆる電気柵方法が導入された(図示せず)。ここでは、高電流パルスが接種後電極上の細胞の接着や移動を防ぐ。細胞は、測定電極の周囲に成長し、内向きにするとすぐに電気パルスがオフになっているように移行を開始します。電動創傷上に電気柵の利点は、電極表面が細胞増殖または細胞遊走に対する異なるコーティングの影響を測定することが重要である細胞を除去することによって変更されていないことである。

    細胞刺激

    細胞移動の研究に加えて、インピーダンス分光法は、完全に適している薬や細胞への毒素の影響を測定します。 図5Bは、トロンビンは抵抗の一過性の低下として現れる細胞の収縮とギャップ形成によりコンフルエントのEC障壁のHyper-透過性を誘導するために使用された古典的な刺激/阻害実験を提示。 Rhoキナーゼ阻害剤Y-27632とのプレインキュベーションによりトロンビン応答の大部分が、基底細胞張力18を下げ、ストレスファイバー形成19を遮断することによって減少する。次いで、RhoキナーゼブロッカーEC障壁の即時および総回収率につながる、トロンビン添加後の異なる時点で使用した。ここでは、急性細胞応答を研究するための連続的なインピーダンス測定システムの利点は明らかとなる。正規のエンドポイントアッセイ( 例えば免疫蛍光染色または高分子通路)で、使用ブロッカーこの急性反応を検出および定量化することは非常に困難不可能ではないだろう。注意することが重要であることで、私mpedance測定は、イオンに対して透過性は、巨大分子の方に説明されていません。留学生センターの測定および高分子通路実験との間の優れた比較が提供されアマン 20を参照されたい。

    図2
    図2。代表的な測定。MVEC 5,000細胞/ cm 2とMFT記録を10日間にわたって実施した低播種密度でゼラチン被覆された8W1Eアレイ上で増殖させた。測定は、留学生センターの実験の異なる読み出しアウトを示しています。A)の接着、拡散および増殖を、B)形成とコンフルエント細胞障壁の成熟と、c)創傷治癒の電気傷を適用した後、血管作動性を持つD)刺激エージェントのトロンビン。 2矢印は、メディアを示している 4日の間隔で行われ、機械的刺激、温度やpHの変化に向けた測定の感度についてのアイデアを与えるた軽食、。トップパネルの画像は、測定に対応し、測定電極から直接取得した。左側の位相差画像は、電極を覆うように出発して、接種24時間後、内皮細胞を示す。センター内およびトロンビ​​ン(1単位/ ml)で刺激前後のコンフルエント内皮層の右現在、F-アクチン染色に免疫蛍光写真。トロンビンは、ベースラインへの抵抗の低下による留学生センター信号で認識、いわゆるストレスファイバーとインター内皮ギャップ(矢印や画像の挿入)の過渡開口部を形成することにより、内皮細胞の収縮を引き起こす。ここでは、測定の感度が明らかになり、どのように細胞層の変化はインピーダンス信号と相関する。s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "ターゲット=" _blank ">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

    図3
    図3。細胞付着および成長。MVECは、同じドナーからゼラチンコート8W10Eアレイおよび細胞増殖が60時間のために複数の周波数で記録された3つの異なる密度で播種した。A)が4kHzのそれらの最適域の3つの条件に対する抵抗値を測定することバリア形成。すべての3つの播種密度は、CAの集密障壁を設置しました。測定終了時1200Ωはいるが、増殖率(曲線の傾き)が大きく異なるB)の静電容量の測定を64 kHzでは、密着性および拡散についての洞察を提供しています。接着は中です(2-8時間の間)の容量曲線のitialプラトー相。電極カバレージに対して線形関係にある、拡散、曲線の傾きによって表され、播種密度に依存して10〜30時間後に完了する。時刻t 1/2(半最大カバレッジ)は、統計解析のために使用することができます。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

    図4
    図4。異なる継代数でコンフルエントバリアの特徴付け。つMVECドナー(継代3および6)ゼラチンコート8W1Eアレイ上に播種し、MFT測定はEC障壁を特徴付けるために、30時間撹拌を行った。A)抵抗測定は、若いドナー1は、約高い抵抗を有することを明らかにした。 カリフォルニア州と比較して11,000Ω。古いドナー2の7,500Ω。BC)留学生センターのモデリング機能は、低抵抗化のための原因を見つけるために使用されている。モデリングは、同等の細胞-細胞相互作用Rbが明らかになったと考えられる原因として弱められた細胞-マトリックス相互作用アルファを示した。D)RTCは、曲線下面積は、微動に比例するフーリエ変換によってコンフルエント細胞層、内微動を定量するために実施した。スペクトルの分析は、それ以上の年齢のドナー2の少ない微動を示し、それによって、すでに抵抗信号(少ない分散)から想定することができるものをサポートしています。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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    図5。細胞移動は、電気創傷およびトロンビン刺激の効果の後に。インピーダンス記録が最大時間分解能で4 kHzで行われた。A)MVECドナー1が通路3とゼラチンコート8W1Eアレイ上の通路6におけるドナー2で使用し、コンフルエンスまで増殖した。その後、電気的な傷は、20秒ごとの持続時間が60 kHzで2 5 Vのパルスを印加することで作成されました。若いドナー1は、HUVECをゼラチンコート8W10Eアレイ上で成長させた古いドナー2。 のBと比較してより高速な創傷閉鎖(マイグレーション、曲線の傾き)に基づいて機能を回復、より良い傷や創傷後に高い抵抗性を示した。コンフルエンス時に細胞が血清基礎培地+1%ヒト血清アルブミン(HSA)を含む完全培地を交換して1.5時間飢餓状態にされている。私達血清成分は​​トロンビン応答をブロックするので、HSAと平野媒体の年齢は、重要なステップです。とすぐに安定した抵抗プラトーが検出されたように、トロンビンをウェルに直接添加し、そして200μlのピペットで注意深く混合した。最大トロンビン効果は、ベースラインとCAへの抵抗の一過性の低下によって特徴付けられる、30分後に表示されている。回復後の30から50までパーセント低い抵抗。細胞はどちらか30分以上遮断のためのRhoキナーゼ阻害薬Y-27632でプレインキュベートした20、30、またはすぐにトロンビン効果が減少トロンビンを添加した後40分を加えた。 この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。 。

    Discussion

    留学生センターは、細胞の性質や行動のスクリーニングのためだけでなく、既知および未知の物質の影響の定量化のための優れたツールです。それによって細胞は、標準的な培養条件下に保持され、インピーダンスが連続的​​に高い時間分解能でモニターし、光信号に相関させることができる。その方法は、細胞操作のための最適な時点は、形態学的および機能的な細胞状態に基づいて選択することができる。残念ながら、この高い測定分解能は、温度、pHまたは細胞の機械的刺激(培地交換)の小さな変化がすぐにインピーダンス信号に影響を与えるであろうことを価格が付属しています。

    細胞に小さな測定電流の印加は、留学生センターの測定は、非侵襲的、非破壊、およびラベルフリーになりますが、結果としてパッシブ生体電気特性は、(何活動電位)を測定することができます。重要な特徴は、パラメータの数がファンデ得ることである透過性や創傷治癒アッセイのようないくつかの古典的アッセイからの情報を組み合わせて、単一の測定からived。ここでは特に興味深い点は、数学的にモデル化されたデータは、抵抗および静電容量の変化を探索し、異なる細胞構造( 例えば 、細胞に接触または細胞膜)にそれらを参照するために使用することができることである。注意することが重要なのは、インピーダンス分光法は、常に単一細胞の研究を可能にし、また、数学的モデルが融合性細胞層にのみ有効ではありませんセンシング電極、上のすべてのセルからの平均化された信号を提供することである。したがって、内皮細胞は、成熟する前に、細胞癒着および静止細胞を確実にするために、モデリングのために使用される少なくとも1つ日間コンフルエント状態に保持されるべきである。同様に、電気的な創傷は、創傷最適な効率を達成し、電極の損傷を防止するために、高い周波数を有する複数の短い創傷パルスを用いた細胞層がコンフルエントに適用されるべきである。

    jove_content ">すべてのアッセイにおいて、そのような個々の細胞の型のアレイ基板、コーティングおよび播種密度の組合せのようないくつかのパラメータは、実験前にテストし、最適化する必要があるように、ECIS測定からの情報の最大量を取得する。

    留学生センターの主な制限は、測定は、分子レベルでの直接的な情報を提供しないということです。従ってECIS測定は、細胞構造または性質を有する科学的問題を関連付ける助け、検証可能な仮説を生成するための重要な入力を提供するために、一連の実験の開始時に、通常、最も有益である。そのため留学生センターのモジュール設計は、テイラーメイドの配列のための可能性のあるアプリケーションの広いスペクトルを提供する。最新のアレイの開発は、細胞増殖や電気創傷のためのハイスループットインピーダンス上映将来焦点とin vivoでのシミュレーションのための特別なフローアレイの進行を示している

    さらに文学
    また、アプリケーション·ノート、ウェブセミナー全体ECISスペクトルをカバーする出版物の詳細なリストについては、応用生物物理のウェブページ(www.biophysics.com)をご参照ください。

    Disclosures

    構造や記事の内容は執筆者の全責任をままであった応用生物物理学社は、オープンアクセス料をカバーした。

    Acknowledgements

    著者は、彼らのアドバイス博士チャールズKeese、博士は、キリスト教Renken、クリスチャンDehnert(応用生物物理社)博士ウルフラトラー(ibidi GmbH)を感謝したいと役立つとこの原稿の準備中に実りある議論になる。さらに、我々は彼の優れた技術サポートを受けるにはヤン·ファン·Bezuに感謝したいと思います。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ECIS Zθ Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E Lexan Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W10E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    L-Cystein Merck Millipore 102838
    Gelatin Merck Millipore 104070
    Bovine Thrombin Merck Millipore 604980
    Albuman (Human Serum Albumin) Sanquin
    Y-27632 Tocris Biosciences 1254
    EGM-2 BulletKit  Lonza CC-3162
    Pen/Strep Lonza 17-602E

    References

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    The video is not working before procedure discription.
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    Posted by: Atiya S.August 31, 2015, 2:16 PM

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