Elektrik Hücre-substrat Empedans endotel Yayılmasının, Bariyer Fonksiyonu Nicelik için Algılama ve Motilite

1Department of Pulmonary Diseases, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center, 2Department of Physiology, Institute for Cardiovascular Research, VU University Medical Center
Published 3/28/2014
1 Comment
  CITE THIS  SHARE 
Bioengineering
 

Summary

Bu protokol Electric Cell-substrat Empedans Algılama, hücre eki, çoğalması, hareketliliği ve farmakolojik ve toksik uyaranlara hücresel yanıtların ölçümü için yapışık hücrelerin empedans spektrumu kaydetmek ve analiz etmek için bir yöntemi incelemektedir. Endotelial geçirgenliğin ve hücre-hücre ve hücre-yüzey kontaktların değerlendirilmesi tespiti vurgulanmıştır.

Cite this Article

Copy Citation

Szulcek, R., Bogaard, H. J., van Nieuw Amerongen, G. P. Electric Cell-substrate Impedance Sensing for the Quantification of Endothelial Proliferation, Barrier Function, and Motility. J. Vis. Exp. (85), e51300, doi:10.3791/51300 (2014).

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the english version. For other languages click here.

Abstract

Elektrik Hücre alt-tabaka Empedans Algılama (ECIS) yapışık hücre tabakaları içinde hücre davranışını ölçmek için in vitro bir empedans ölçüm sistemidir. Bu amaçla hücreler karşıt dairesel altın elektrotlar üzerinde özel kültür odalarına yetiştirilmektedir. Sabit bir küçük dalgalı akım için elektrotlar ile potansiyeli üzerinde ölçülür arasına tatbik edilir. Hücre membran yalıtım özellikleri, elektrotlar arasında bir elektriksel gerilim artışı ile sonuçlanan elektrik akımı akışına karşı bir direnç oluşturur. Bu şekilde hücre empedansı Ölçüm hücresi eki, büyüme, morfoloji, fonksiyon ve motilite otomatik çalışma sağlar. ECIS ölçüm kendisi basit ve öğrenmesi kolay olsa da, altta yatan teori karmaşık ve doğru ayarları ve doğru analizi ve verilerin yorumlanması seçimi apaçık değildir. Henüz net bir protokol deneysel gelen bireysel adımlar açıklayanHazırlık, gerçekleştirilmesi, ve deney analizine tasarım kullanılamaz. Bu yazıda temel ölçüm prensibi yanı sıra, olası uygulamalar, deneysel düşünceler, avantajları ve ECIS sisteminin sınırlamaları tartışılmıştır. Bir rehber yayılma ve proliferasyonu, hücre eklenme çalışma için sağlanır; bariyer fonksiyonu, hücre hareketi, hücre-hücre ve hücre-yüzey yapışıklıklar kalitesi ile ilgili bir birleşik tabaka, hücre davranış ölçümü ve yara iyileşmesinin ve ölçümü vazoaktif uyarıcılara hücresel tepkileri. Örnek sonuçlar, insan mikrovasküler (MVEC) ve insan göbek damarı endotel hücrelerinin (HUVEC) göre ele, ama yapışık büyüyen hücreler için geçerlidir vardır.

Introduction

ΩΩΩHere biz ECIS, kültürü 1 yapışık hücre empedans spektrumu ölçmek ve analiz etmek için özel bir yöntemi olarak bilinen Elektrik Hücre-substrat Empedans Algılama sunmak. Bu protokolün amacı, empedans tabanlı hücresel tahlillerde bu özel türü kullanımı için genel olarak uygulanabilir rehber sunmak ve uygulamaları sürekli artan sayıda anahtar bazı fonksiyonları için protokolleri sağlamaktır. Odak hücre proliferasyonu, bariyer fonksiyonu, hücre birleşme ve hücre motilite çalışma olacaktır.

ECIS ve biyolojik ilgili parametreleri empedans spektroskopisi verileri dönüştürmek için ilişkili modeli 1991 2 Giaever ve Keese tarafından bilimsel topluluk mevcut haliyle tanıtıldı yana, genellikle (trans TEER ölçümü için bir sistem olarak anılır olmuştur doğru değildir-epitelial elektriksel direnç). Farklar ilk bakışta marjinal görünüyor, amaveri yorumlama için önemlidir. Klasik TEER ölçümler için, hücreler epitel sıkı kavşaklar veya endotel adherens kavşaklar 3 hakimdir paraselüler taşıma mekanizmaları, karakterize etmek için geçirgen filtreler yetiştirilir. Genellikle, filtrenin altında ve üstünde yer alan iki elektrot bir doğru akım (DC) elde edilen voltaj düşüşü 4 ölçmek için hücre tabakası ve diğer iki elektrot üzerinde akım uygulamak için kullanılır. Elektrik direnci hücre bariyer kalitesi sayısal bir açıklama sağlar: Ohm kanunu kullanılarak hesaplanır.

ECIS bu temel prensibi izler ve onu genişletir. ECIS sisteminde, özel hücreler, hücre kültür kapları içinde altına gömülü karşı, yuvarlak altın elektrotlar üzerinde yetiştirilir. Kültür başına Elektrotların sayısı iyi değişkeni, uygulamaya bağlıdır ve elektrotlar 250 um standart bir çapa sahip olup, bazı durumlarda daha büyük bir karşı elektrotDevreyi tamamlamak için kullanılır. ECIS yerine doğrudan bir akımın belirli bir frekans ile 1 uA sabit bir alternatif akım (AC) kullanır. Empedans elektrotlar arasında (mV cinsinden) gerilimi karşılık gelen değişiklikler hesaplanmıştır. ECIS TEER göre bazı avantajları vardır ve bu yazıda ayrıntılı olarak açıklanacaktır frekansa bağımlı hücresel özellikleri, çalışma için bir frekans aralığı üzerinde empedansı ölçmek için imkanı sunar. Birincisi, kompleks empedans ölçüm hücresi bariyer direnci ve hücre kapasitans içine genel empedansını ayıran sağlar. Buna ek olarak, çok sayıda frekansta veri alma ve bir matematiksel model uygulanarak, bir hücre-substrat etkileşimleri (temel matrise bazal hücre zarı mesafe) yanı sıra neden junctional empedans (hücre-hücre kontakların sıkılık) ve direnç arasında ayrım Hücre membran kapasitans katkısı. İkinci olarak, hücre çoğalması ve hücre hareketliliği, çünkü değerlendirilebilirs, elektrotlar ile doğrudan temas içindedir. Üçüncü olarak, alt-tabaka ve elektrodlar parlak alan ve faz kontrast mikroskopisi imkan vermek için yeterince incedir.

Empedans ölçümleri Esasları: kompleks empedans

Biyolojik nesneler (örneğin hücreler) elektrik empedansının ölçümü için temel Ohm yasası, direnç (R) arasındaki ilişkiyi açıklayan temel bir elektro-teknik prensibi, akım (I) ve bir elektrik devresinde gerilim (U) , belirli bir süre (t).
DC devresi geçerlidir: R (t) = U (t) / I (t)

AC sistemine çalışırken, akım ve gerilim genliği farklı, ama aynı zamanda faz (φ) değil sadece. Şimdi, direnç artık bu ilişkileri açıklamak için yeterlidir. Bunun yerine, kompleks empedansı (Z) ya da empedansın çoğu durumda büyüklüğü (| Z |) tekrar önce tarif edilen omik direnç artı reaktans (X) içeren, kullanılanAC sults kondansatör ve gerilim ve akım 5 arasındaki faz kaymasının tahrik endüktans akar.
AC devresinde Uygulanabilir: | Z (f) | = √ (R 2 + X (f) 2)
φ = arctan (X / R)

Bunların membran özelliğinden dolayı, sağlam hücreler üzerinde empedans ölçümleri gerçekleştirirken, hücreler, direnç ve kondansatör paralel bir bağlantı olarak hareket ederler. Kapasitans (C) hücrenin polarizasyonu neden olan hücre zarının yalıtım iki katmanında elektrik taşıyıcıların ayrılmasını tarif eder, oysa burada direnç, akım akışına karşı temsil eder. Bu şekilde X, hücre zarının kapasitif özellikleri hakimdir.
X (f) ≈ (2 * Pi * f * C Hücre) -1

X frekansa bağımlı olduğu için, ölçüm frekansının varyasyon hücrenin farklı fonksiyonel ve yapısal özelliklerinin bir çalışma sağlar. ECIS cihaz ölçer R ve X, izin hesaplama hemof | Z |, C ve φ.

Elektriksel eşdeğer devresi: empedans spektroskopisi ile tüm hücre katmanları ölçülmesidir.

Bir hücre, bir elektrik alanı dahil edildiğinde, daha önce açıklandığı gibi, pasif elektronik bileşenler özelliklerini göstermektedir. Şimdi, bunun yerine tek bir hücrenin, elektrotlar üzerinde büyütülmüş ve hücre kültürü ortamı ile takviye edilmiş bütün bir hücre tabakası incelenmiştir durumunda, direnç ve kondansatörün basit bir model bütün bir elektrik şebekesine sağlanması gerekmektedir. Bu sözde eşdeğer devre olarak, elektrot / elektrolit etkileşimini ayırt etmek kültür ortamında (R Med) yanı sıra, kapasitans (C elektrikli) ve direnci (R elektrikli) direnci 3,6 dikkate alınması gerekir.

Bir yapışkan artan hücre katmanı için bu tür bir eşdeğer devre basitleştirilmiş genel örnek, Şekil 1 'de bulunabilir. Böyle bir matematiksel a avantajıbiyolojik bir sistemi tanımlamak için söz konusu devrelerin pproach ad libitum olarak rafine ve hücre içi organellere neden olduğu ya da hücre-hücre etkileri (R Junc) ve hücre-yüzey adezyon ayırmak için empedans dikkate alarak, örneğin spesifik deneysel sorulara ayarlanabilir olmasıdır genel empedans 7,8 üzerinde (R Sub). Yine modelleme için amaç her zaman anlamlı korelasyon izin ölçülen empedans yelpazenin tüm özelliklerini açıklayan unsurların küçük numarayı kullanmak olmalıdır.

Şekil 1
Şekil 1. Yapışık olarak büyüyen hücreler katmanı. A) Çapraz bir ECIS kültür bölümünde de için ECIS sistem ve temsili eşdeğer devresinin şematik. Hücreler, algılama ve karşı elektrot ve a'nın üstünde büyüyentekrar kültür ortamı ile kaplanmıştır. Elektrotlar bir kilit-amplifikatör bağlı ve bir AC sinyal sabit bir akım kaynağı oluşturmak için 1 M direnç üzerinden uygulanır. Uyarılar zaman içinde herhangi bir noktada. B) ECIS önlemler empedansına tüm bireysel katkıların toplam kültür ortamına doğrudan ilave edilebilir. Bir rezistör (R elektrikli) ve bir kapasitör (C elektrikli) ve aynı zamanda elektriksel özelliklerinin bir paralel kombinasyonu olarak sunulan basitlik için, elektrot / elektrolit arayüzü neden kültür ortamı (R Med) hem de direnç empedansının Paralel direnç bağlantısı (R Cell) ve kondansatör (C Mem) tarafından tarif edilen hücre zarı arasında, her dikkat edilmesi gerekmektedir. Bu akım, hücre geçirgenliği doğru bağımlı olduğu R Cell, değişkendir. Eşdeğer devre genişletilmiş ve libitum rafine edilebilir. Bir örnek junctional (R Junc) halinde desıra subendotelyal (R Sub) direnç devresine ilave edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Empedans parametreleri ve biyolojik anlamı

Empedans ölçümlerinden elde edilen iki çok doğrudan parametre direnci ve hücre kapasitans bulunmaktadır. Direnç kalite ve hücre bariyer fonksiyonunu temsil eder ve bu nedenle dikkate para-ve trans-hücre akım akışına karşı direnci alır. Kapasitans elektrot içerisinde genel bir ölçümünü sağlar. ECIS ayırt edici özelliği, eşdeğer devreleri yardımıyla ve modelleme ile bu küresel parametreler, bu makalenin sonraki bölümlerinde ele alınacak hücre-hücre ve hücre-substrat yapışıklıklar da dahil olmak üzere daha birçok hücresel özellikleri, üzerinde anlayış sağlamaktır.

Deneysel conside: başlamadan önceerzak

Ölçüm kurulum - kurulum birkaç ayrı bileşenden oluşur: ölçüm elektroniği ile ECIS cihazı, -, ECIS diziler ve seçim hücre kültürü, veri toplama için PC veya 96-kuyu sistemi 8 için dizi tutucu. Dizi tutucu bir kuluçka makinesine yerleştirilmiş ve inkübatör dışında ECIS cihaza bağlı olması gerekir. PC ECIS yazılımı (1.2.123.0 14 Şubat 2013) ile donatılmış ve ECIS cihaza bağlı olması gerekir.

Array seçimi - çoklu uygulamalar için tasarlanmış ECIS diziler, sürekli artan bir çeşitlilik var. Standart dizileri, sırasıyla, (E ile gösterilir) 1 ya da 10 ölçüm elektrotlar içeren (W ile gösterilir) 8 kültür kuyularının oluşan 8W1E ve 8W10E diziler vardır. Büyük bir karşı elektrot devreyi tamamlar, ancak empedans gerçek ölçüm 6 esas ihmal edilebilir düzeydedir. Standart 8-iyi dizi tutucu barındırabilir iki arrays, 16 kültür kuyularının toplam sayısı ile sonuçlanır. Altın elektrotlar 50 nm, kalın bir yalıtıcı film ile tarif ve optik bakımdan saydam bir LEXAN polikarbonat alt-tabaka ya da bir baskılı devre kartı (PCB) üzerine monte edilmiş ya da bulunmaktadır. PCB diziler daha sağlam ve verimli maliyet. Şeffaf slaytlar ışık mikroskobi için izin verir. Ne düşünülmelidir 1E dizi hücre hareketleri neden direnç sinyal dalgalanmalara artırır ve yara iyileşmesi çalışmaları için gerekli olmasıdır. Ayrıca, tek elektrotlar elektrikli ve optik sinyallerin bir ilişki sağlar. Çok elektrot dizileri, sinyal nedeniyle artan ölçme alanına eşit olmayan aşılama ve hücre büyümesi ile verilerin önyargı kısıtlar nedeniyle hücreye sinyal bulanıklık azalır, ölçüm daha fazla hücre içeren, çok sayıda elektrot ortalama olarak hareketler. Bu nedenle, çok elektrot dizileri, hücre çoğalmasını ve oluşumunu engelleyici incelemek için yararlıdır. SonrakiStandart dizileri özel kemotaksis 10 çalışma için kesme stresi 9 uygulama için uygun diziler, hücre göçü ve proliferasyon hem de yüksek kapasiteli gösterimleri boyunca 96 oyuklu levhalar vardır. Sonuç olarak, kullanılacak olan dizi bilimsel soru ve hücre tipi arasında sıkı bir bağlantı ve seçilebilir ve dikkatli bir şekilde kontrol edilmelidir.

Ölçüm sıklığı - Rb ve alfa modelleme (veri analizi bakın) çoklu frekans ölçümleri (MFT) gerektirir. Aksi takdirde empedans verileri daha yüksek bir zamansal çözünürlüğe sahip toplanabilir avantajı ile, bir hücre tipi özel frekans (SFT) zaman içinde ölçülebilir. Belirli bir hücre tipi için en hassas ölçüm frekans frekans taramaları bulunabilir. Hücresiz ve hücre-kaplı elektrot arasındaki en büyük fark, hücrelerin t bloke frekansıdır bir log-log grafiği sıklığında frekansın fonksiyonu olarak sırasıyla bir direnç empedans çizilirkeno mevcut en etkili. Endotel hücreleri (EC) halinde, bu frekans, yaklaşık 4 kHz yer almaktadır.

Ekim yoğunluğu - her düzenli hücre tabanlı deney ekim yoğunluğu gibi bilimsel probleme bağlıdır. Yapışma okuyan ve yayılan ya da bariyer oluşumu olduğunda, endotel hücreleri, bir konfluent garanti etmek / cm 2 40.000-60.000 hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip, 48 saat sonra kararlı bir bariyer tohumlandı olmalıdır. Deneyin odak çoğalması üzerinde ise, endotel hücre / cm 2 ila yaklaşık 2,000-10,000 hücre düşük yoğunlukta tohumlandı olmalıdır.

Protocol

1.. Ölçüm Sisteminin Hazırlanması

  1. Yoğunlaşmayı önlemek için deneye başlamadan önce 37 ° C bir kuluçka dizi tutucu Prewarm.
  2. Kuyu kurumasını önlemek için damıtılmış su ile kuluçka su tabut doldurun.
  3. , Steril koşullar altında, bir düzgün akış kabininde hücreleri ve diziler tüm manipülasyonlar yapın.

2. Hücre dizileri ve aşı hazırlanması

Not: ECIS dizileri iyi-kuyu tekrarlanabilirlik ve sinyal-gürültü oranını artırmak için, elektrot kaymasının engellenmesi için bir deney daha önce temizlenir ve stabil olması gerekir. Bu nedenle iki seçenek vardır: L-sistein ve B) ECIS stabilizasyon fonksiyonu ile elektrot A) ön-muamele.

Seçenek A: L-sistein, en uygun ön-muamele olarak tavsiye edilmektedir, fakat bazı özel durumlarda protein coatin etkileşim olabilirelektrotlar üzerinde gs. Sunulan miktarlar standart 8, diziler için kullanılır.

  1. 200 ul / gözenek 10 mM L-sistein ekleyin. Sistein temizler ve yüksek ve yeniden üretilebilir bir elektrot kapasitansı vermek elektrot yüzeyi değiştirir.
  2. Oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin.
  3. Ultra-saf su (tip 1) ile iki kez 500 ul / oyuk yıkayın. Bazı proteinlerin adsorpsiyonu engelleyebilir fosfat tamponlar kullanmayın. Altın yüzey temas getirdi ilk makromoleküller yapışır beri Ayrıca, kaplama öncesi serum içeren çözümler önlemek.
  4. 200 ul / göz, sıcak% 1 jelatin ile kaplayın.
  5. 37 ° C'de 30 dakika inkübe
  6. Jelatin kaldırmak, ancak yüzey kuru izin vermeyin. Bu, elektrotları zarar verebilir.
  7. Ultra-saf su (tip 1) ile bir kez yıkanır.
  8. (Serumu, antibiyotikler ve büyüme faktörlerini ihtiva eden) 400 ul / yuva tam hücre kültür ortamı ekleyin.
  9. Dizi tutucu bir halinde slayt dizid dizi dokuz altın kare yastıkları düzgün yaylı zıp pimleri ve düzeltme ayar vidası elle sıkı temas eder şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun. Şeffaf diziler ile dikkatli olun, altın tabaka kolayca zarar görebilir.
  10. Her kuyunun hızlı bir empedans ölçüm gerçekleştirmek için "Veri Toplama" bölümünde Giriş izledi ölçüm yazılımı ve Ayarlar düğmesine basın açın. Elde edilen değerler, ölçüm temel ve buna uygun olarak "Yorum" saklanacaktır.
  11. Iyi kontrol otomatik olarak kullanılır ECIS diziler tipini belirleyecektir. "İyi Yapılandırma" bölümünde seçilen diziler doğrulayın.
  12. Dizi diyagram boş veya hatalı bağlı Kuyular için düzgün bir şekilde bağlı Kuyular için yeşil ve kırmızı yanar. Yine de, her zaman diziler tutucuya doğru yerleştirildi emin olun.
    NOT: Temizleme ve kaplama başarılı olsaydı 8W1E ECIS diziler acyaklaşık 5 nF ve sırasıyla yaklaşık 2.000 ve 200 Ω bir temel dayanıklılık ile sonuçlanan 50 nF, en 8W10E dizilerin apacitance.
  13. Tutucudan dizisini kaldırmak.
  14. 400 | il / göz tam hücre kültür ortamı içinde tek bir hücre süspansiyonu olarak tohum hücreleri.

Seçenek B: elektrot sürüklenme veya iyi-to-iyi direnç ve kapasitans büyük farklar ile ilgili sorunlar oluşursa ECIS ve sabitleme fonksiyonu L-sistein tedavisi alternatif veya kombine olarak kullanılabilir ve olabilir.

  1. Protein (opsiyonel) ile sistein tedavisi (isteğe bağlı) ve önkaplama elektrotlar gerçekleştirin.
  2. Her kuyucuğa tam ortam içinde 200 ul / yuva ekleyin ve dizi tutucuya dizi yerleştirin.
  3. Dizi tespit Giriş izledi açık ölçüm yazılımı ve Ayarlar düğmesine basın C'yi doğru bağlanmış ve ilk Z, R ölçmek için, ve
  4. Basarak elektrotları Dengelenmesinde (ca. 3 mA), yüksek frekans (64 kHz) darbe uygulanır.
  5. Tekrar elektrotları kontrol edin. Kapasitans arttırılmalı ve direnç değerleri karşılaştırılabilir bir aralığı içinde olması gerekmektedir.
  6. Kapasitans ve direnç değerleri hala tatmin edici değilse, istikrar tekrarlayın.
  7. Tutucudan dizisini kaldırmak ve hücreleri aşılamak.

3. Ölçüm Yazılım ve Veri Toplama ayarlama

  1. Daha önce tarif edildiği gibi bir dizi tutucu dizi yerleştirin.
  2. Açık ölçüm yazılımı ve ECIS enstrümana ECIS yazılım bağlamak ve iyi kontrol başka çalıştırmak için "Veri Toplama" bölümündeki Ayarlar düğmesine basın.
  3. "İyi Yapılandırma" bölümünde seçilen diziler doğrulayın.
  4. "Eh YAPILANDIR ölçülecek kuyuları seçiniyon "bölümü.
  5. "Veri toplamak" seçeneklerinden ölçüm modunu seçin:
    1. Sabit bir frekansta bir zaman serisi için, Tek Frek seçin. / Saat (SFT) ve açılır menüden gelen ölçüm sıklığını seçin.
    2. Elektrot kapsamı ve Rb ve Alpha modelleme ölçümü için, Çoklu Frek seçin. / Saat (MFT). ECIS cihaz mevcut tüm frekanslarda otomatik olarak ölçer.
    3. Mikro-için (veri analizi bakınız) Hızlı Saati (RTC) toplayın seçmek ve ölçüm sıklığını ve örnekleme sıklığını ayarlayın. Burada standart zamansal çözünürlükte saniyede (1 Hz) başına bir örnek, ama örnekleme sıklığı da (Z-Teta için) 25 Hz kadar empedans hızlı değişiklikleri izlemek için artırılabilir. Önemli not: RTC modunda sadece tek bir iyi ölçülür.
      NOT: Mikrohareket sonradan birkaç kuyularda ölçülen gerekiyorsa, Yardım gidin> Show uzman araç çubuğu / menü öğeleri> Ediuire> Çok Şey RTC. Topla Veri bölümündeki Zaman sınırı (saat) belirtin; ECIS şimdi sayısal sırayla seçilen kuyu ölçecek. Ölçüm başladıktan sonra yazılım döngüleri numaralarını belirtmek isteyecektir. Ölçüm tekrarlanması gerekir ne sıklıkta için değerini girin.
  6. SFT ve MFT için, ölçümler arasında veya zaman aralığı (sn) Seçtiğiniz veri mümkün olduğunca hızlı bu seçeneği işaretlemeyin satın gerekiyorsa.
    NOT: ECIS cihaz minimum SFT edinme 0.25 sn oranı ve MFT için 7.5 sn ile de birinden diğerine geçmek için bir çoklayıcıyı kullandığı veri elde etmek. Aralık anlamı seçilmiş kuyucuklara ve frekansların sayısına bağlıdır. Yavaş çoğalan hücreleri üzerinde ölçümleri veya zamana karşı direncinin basit bir kayıt için, 600 saniye ya da daha fazla aralıklarla kullanın.
  7. Başlat tuşuna basın, dosyayı adlandırın ve veri depolamak için bir konum seçin.
    NOT: Dosya boyutu bir pr olmamalıoblem, ECIS veri bile tüm ölçüm frekansları ve seçilen kuyu sayısının birkaç yüz MB aşıyor asla *. abp denilen düz metin biçiminde, bir tür kaydedilir beri.
  8. Finish tuşuna basarak çalıştırın durdurun.

4. Orta Değişim ve Hücre Manipülasyon

  1. Basın Pause, bu veri toplama durdurmak, ancak deneysel saati çalışmaya devam edecektir.
  2. Tutucudan dizi çıkarın ve laminer akış tezgahı (yani değişim orta) altında işlemek.
  3. Geri tutucu dizi yerleştirin ve bağlantı kontrol edin veya veri toplama devam etmek Experiment Devam tıklayın ya. Ölçüm yazılımı veri setinde bir zaman işareti koyacaktır.

5. Data Acquisition sırasında akut Uyarım

NOT: İkinci bir seçenek acil değişiklikleri takip etmek, veri toplama sırasında hücreleri manipüle etmektir. Bu mümkündür, Numuneleri denemenin daha sonraki gelişme sırasında steril olması gerekir olmadığında.

  1. Doğrudan kuyuya uyaran ekleyin ve 200 ul pipet ile dikkatli karıştırmak için emin olun.
  2. Mark zaman İşaretle tuşuna basarak elle işaret ve yorum ekleyebilirsiniz.

6. Elektrik Yaralama

NOT: kullanılan hücre tipi için doğru ayarları bulmak elektrik yaraladığı anahtardır. Yaralama yaralama çok uzun ve / veya pürüzlü ise, bu (özellikle şeffaf diziler) elektrotlar zarar verebilir, oysa bu, hücrelerin yetersiz kaldırılmasına neden olabilir çok kısa ise. Bu nedenle, birçok kısa yaralama bakliyat tavsiye edilir. HUVEC kültürler için 60 kHz'de 5 V, iki 10-20 sn uzun yaralama darbeler her ECIS 1600R kullanılarak en uygun bulunmuştur. Genel olarak hücreler boyunca tek tip yüksek alanları korumak ve elektrotlara bir hasarı önlemek için> 20 kHz yüksek frekansları kullanılması önerilir.

  1. DUR yaralama gerçekleştirinEtkin bir ECIS ölçümü ing.
  2. Yara / electroporate Kur Enable, sonra yara tıklayın ve zaman (sn) doldurun, yara gerilim (1,600 R V) veya akım (Z ve Z-Teta için uA) ve frekans (Hz). Görüntülenen varsayılan değerler dizi ve ECIS cihazın türüne dayanır.
  3. "İyi Yapılandırma" bölümünde yara için kuyu seçin. Sadece kontrol kuyuları yaralı olacaktır.
  4. Kıyamet kadar Gecikmesi etkinleştirin ve gecikme yara fonksiyonunu etkinleştirmek için gecikme zaman doldurmak. Bu fonksiyon Durdur tuşuna basarak veya elle bir yara uygulayarak herhangi bir anda durdurulabilir. Sadece bir gecikme komut bir anda etkin olabilir.
  5. Basın etkinleştirin ve yaralama başlatmak için pop-up pencerede Tamam düğmesini tıklatın.
  6. Aksi yaralama tekrarlamak, direnç sinyal yaralama sonra ofset empedans düşer emin olun.

7. Veri Analizi

  • Veri gösterimi ve ihracat.
    1. > Aç - Dosya üzerinden ayarlanır Bitiş ölçüm veya yük verileri.
    2. "İyi Yapılandırma" penceresinden görüntülenmesini kuyu seçin. Ortalama sunmak grup bireysel kuyular.
    3. Üst araç çubuğundan (Z, R veya C) görüntülenecek parametreyi seçti.
    4. Üst araç çubuğundan (T = zaman, F = frekans, 3D = şelale leke) seçin grafik türü.
    5. Grafik penceresinin altındaki sürgü ile grafik ofset ve aralığını tanımlamak veya bitişik kontrollerde kesin değerleri girin.
    6. Verilerin ortalamasını veya normalleştirme çalışırken, standart sapma gerçekleştirmek için "Analiz" bölümünde temel "Zaman Serisi Seçenekleri" seçti.
    7. Nyuist arsa ve Fourier dönüşüm gibi daha ileri işlemler için Yardım menüsünde Uzman Araç etkinleştirin.
    8. Ra tanımlamak için "Analiz" bölümünde "Display Options" kullanınx-ve y-eksenleri ve ihracat grafiği hücumdan.
    9. Excel (Seçilmiş) için> ve gerektiği gibi derinlik analizi, istatistik ve temsil için seçtikleri bir üçüncü parti yazılım kullanmak -> İhracat Verileri - İhracat Dosya üzerinden bir Excel dosyası veri seçilir.
  • Rb ve Alpha modellenmesi.
    NOT: Modelleme için referans olarak da dolu bir hücre içermeyen, orta kullanılması önerilir.
    1. Bitiş MFT ölçümü veya yük MFT veri seti.
    2. Hücre içermeyen bir referans da mevcuttur basın varsa otomatik olarak referans değerini veya "Analiz" bölümünde "Frekans. Tarama Modelleme" elle hücre serbest zaman noktasını seçmek için seçmek için Bul ya.
    3. Hiçbir hücre içermeyen başvurusu varsa, başka bir veri setinden bir referans değeri içe. Referans veri seti (aynı dizi ve orta kullanılan emin olun) açın ve bulun veya referans değerini seçmek için ayarlayın kullanın.Sonra ölçülen veri ve basın olsun gidin.
    4. Available fabrika varsayılan set hiçbir hücre içermeyen referans veri varsa.
    5. Hesaplamaları başlatmak için basın Modeli. Modelleme veri kümesinin boyutuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.
  • Mikro-hesaplanması.
    NOT: Bu hesaplama ölçüm yazılım parçası değil, herhangi bir sinyal işlem yazılımı ile gerçekleştirilebilir.
    1. RTC ölçümünü bitirmek veya RTC veri kümesini yükler.
    2. Tüm dönem ortalama direnci tarafından belirlenen veri normalleştirmek.
    3. 256-veri noktaları uzunluğunda kesimleri içine veri seti kırmak ve bir Hanning penceresi her segmentini temizleyin.
    4. Rastgele gürültüyü en aza indirmek için bir tek taraflı 129-noktalı güç spektrum 256 noktalı Fourier dönüşümü ve ortalama elde edilen frekans spektrumunu çalıştırın ve biyolojik sinyal geliştirilmiş.
    5. Log-log grafiği ve uygulamak genlik karşı komplo frekansıen küçük kareler doğrusal formda.
    6. Doğrusal bir uyum eğimi genel sinyaldeki gürültü ve hücrelerin bu şekilde mikro-ölçüsüdür.
  • Representative Results

    Bir deney kurma oldukça basit ve ölçüm kendisi tam otomatik, ama sık sık olduğu gibi, doğru analizi ve verilerin yorumlanması çok önemlidir. Temsilcisi veri bölümünde bir rehber ECIS ile empedans spektroskopi tarafından sağlanan en önemli parametrelerin yorumlanması sağlanır. Bu ECIS ölçüm parametreleri kayıt edilmelidir yararlı ve hangi olabilir bilimsel bir sorunun hangi tür karar vermek yararlı olacaktır.

    Tipik bir deneme-okuma genellikle hücre aşılanmasından ve hücreler kaynaşmaya eriştikten bir plato-aşamasından sonra bir büyüme aşamasında ayrılabilir. Bu aşamaların her biri, farklı hücresel özellikleri hakkında bilgi verir. Temsili bir ölçüm, Şekil 2'de gösterilen ve A) hücre yapışmasını analiz etmek için dört subphases ayrılır, yayma ve çoğalması olan, bir olgunlaşma EC bariyer B) oluşumu, C) Hücre göçü, bir elektrik üretilmesinden sonra), vazoaktif ajanın trombin ile uyarılmaya hücresel tepki ve D; al sarılır. Faz-kontrast ve immunofloresan görüntüleri elektrot kapsama, hücre durumu ve kaydedilen empedans sinyal arasındaki bağlantıyı göstermek için farklı subphases sırasında ölçüm elektrot doğrudan satın alındı.

    Yapışma, yayılma ve çoğalma

    Her hücre tipi, hücre dışı matris proteinleri veya başka bir uyarıcı ile kaplama, tohum yoğunluğu değiştirilerek manipüle edilebilir karakteristik yapışma ve bir büyüme eğrisi vardır. Bu çalışma süreçleri için önemli güçlüklerden biri, yayma ve çoğalma, yapışma ayırt etmektir. Wegener ve diğ. 11 direnci ve bu parametreleri ve Şekil 3 'de bu direnç ve kondansatör birbirlerini tamamlayıcı ne kadar belirgin hale gelir ayırt etmek için kapasitans bir kombinasyonunun kullanımı için ayrıntılı bir açıklamasını vermiştir. Bu önemlidiryapışma çalışması ve burada elektrik alan hücrelerin etrafında sadece akış akımı söz konusu süspansiyon 8, hücrelerin hücre membran polarizasyonu neden olur, çünkü, ölçüm frekans etkisini anlamak için yayılma. Hücreler, elektrot (fraksiyonel bölge) açık alan yüzdesi ile doğrusal bir şekilde elektrot kapasitansı ve azalmalar yayılarak akımı sınırlamak için başlangıç ​​iliştirdiğinizde. Kapasitans azalma elektrot içerisinde doğrudan orantılı olan 40 kHz (Şekil 3B), daha yüksek bir frekansta kapasitans kaydederken Bu nedenle, yapışma, yayma ve proliferasyonu, iyi tayin edilebilir. Alternatif olarak, en hassas ölçüm frekansında direnç konfluent bariyer içine farklılaşma ve hücre olgunlaşması (Şekil 3A) için doğrudan bir ölçüsüdür. Fraksiyonel alanına ek olarak, Wegener ve ark. Iki tanıtılant 1/2, elektrotun% 50 hücreleri (Şekil 3B, ekleme) ile kaplanmıştır zamana kadar olan süredir (yarım maksimum kapasite), ve kapasitans eğrisi (s değil, eğimi: yapışma ve elektrot kapsama alanı ölçmek için parametreler hücre çoğalması ve yayılması oranı olarak) gösterilmektedir.

    Bariyer bir kalite ölçüsü olarak Resistance

    Direnç Bu membran, elektrot ve ortamdan kapasitif bileşenleri ihmal için, bariyer kalite ve en iyi işlevi açıklanmaktadır empedansının bir parçasıdır. Geçirgenlik tanım başına hücre-hücre kişiler sadece bağımlı olduğundan burada terim bariyer kalitesi değil, geçirgenliği, kullanılır. Direnç, ancak akım akışını engellemek için hücre ve hücre-hücre ve hücre-matris etkileşimlerinin yeteneği belirlenir. Bu duruma göre farklı hücre tipleri (klon ve geçitleri) kendi özel direnci değerleri (Şekil 4A) sahiptir. Direnci çok Clea vermesine rağmenHücre bariyer hakkında bir fikir rer, empedans sinyal her zaman dikkate alınmalıdır.

    Rb ve Alpha modellenmesi

    ECIS yazılımı, belirli bir özelliği barındıran, hücre-hücre ve hücre-matris adezyonlar (Şekiller 4B ve 4 ° C) arasında bir ayrım iki parametre, model yeteneği. Rb (cm x 2 ohm), akım akışının ve böylece klasik bir geçirgenliğe sahip bir ters ölçmek için hücre-hücre rehber özdirencini. Yüksek Rb akım akışının karşı düşük geçirgenliği ifade eder. Alpha (cm x 0.5 ohm), hücre-elektrot birleşme kaynaklanan empedans katkıları için bir ölçüdür. Hücre-hücre ve hücre-matriks kişileri ölçmek için bir model Giaever ve Keese tarafından 1991 yılında tanıtıldı ve hücreler dairesel olduğu varsayımına dayanır, bir yalıtım membranı vardır disk şeklindeki nesneler, elektrot üzerinde gezdirin ve elektrolit 2 iletken ile doldurulur .Hücre membran yalıtım özelliği akım için sadece üç yolları bırakır: a) hücre ve elektrot ventral yüzeyi arasında, b) hücre-hücre temas ve c) hücreleri ile arasında (yalnızca olası yüksek ölçüm frekans kullanıldığında .) Daha detaylı türetme ve açıklama Lo ve ark 3,12 arasında gazetelerde bulunabilir.

    Micromation

    Bu direnç sinyali (Şekil 4A) küçük dalgalanmaları ince, random hücre birleşik hücre tabakalarının hareketleri hem de hareket hücrelere ve seyrek kültürler 2'de elektrot kapalı bağlı olduğu gösterilmiştir. Lo ve Opp tarafından açıklanan ECIS zaman ders veri bu yönü vd. 13,14 sıklıkla gözden kaçan ve para-ve subsellüler akım yolları için hesap 1E diziler ve en hassas frekansta ölçerken iyi görülür. Bu hücrenin hesaplama gürültüsü (Mikrohareket) th parçası değil neden olduE standart ölçüm yazılımı, yeni sürümü Hızlı Fourier Dönüşümü (FFT) entegre olmasına rağmen. 4 kHz 1 saat için 1 Hz örnekleme frekansı ile RTC veri kayıt EC mikro-hesaplanması için yeterli çözünürlüğü sağlar. Bu hesaplama tek bir değer sağlar ve doğrudan istatistiksel analiz için kullanılabilir. Mikro-için frekans analizi kullanımı ile ilgili genişletilmiş bir tartışma başka bir yerde 15 bulunabilir. Alternatif FFT diğer analiz stratejileri artışlarla uymayacak gibi kullanılabilir. Varyans mikro-küçük değişimlere karşı daha duyarlı olan, ancak çünkü bu duyarlılık Tek tek deneylerin karşılaştırması zor olur. Güç spektrumunun yamaçlarında mikro-daha sağlam bir ölçüm (Şekil 4D) vardır. Burada eğrinin altında kalan alan ya da mikro-hücreler oluşturmak gürültü miktarı olarak görülebilir. Dolayısıyla, dik güç spektrumunun eğim eğrisinin altındaki alan daha küçükve Mikrohareket küçüktür.

    Elektrik yara iyileşmesi tahlil

    Hücrelerin göç çalışması için, genellikle mekanik yaralar pipet uçları, hücre kazıyıcı veya özel pulları ile kültür plakası kapalı hücreleri çizilmeye ve mikroskopik 16 onların geri dönüş izleyin tarafından uygulanır. Bu yöntem, sıfırdan boyutu değişir ve genellikle yara iyileşme süreci üzerinde hücre çoğalma etkisi ihmal için çok büyük olan belirgin bir dezavantajı vardır. ECIS ve yaralama işlevi, hücresiz bir elektrot elde etmek için bir yüksek gerilim, yüksek frekans sinyali kullanır ve daha sonra da ölüm hücreleri (Şekil 5A) değiştirmek için, komşu hücrelerin geri dönüş izler. Standart, emek yoğun sıfırdan deneyleri boyunca bu otomatik yöntemin bir avantajı, ECIS saf göç incelemek için bir kaç saat içinde kapanır 250 um kesin bir çapı olan bir yüksek oranda tekrarlanabilir yara, üretmesidir. Bundan başka, bir elektrik sinyali yapmakes protein kaplama ve salgılanan hücre dışı matriks kaldırmaz. Hücreler her taraftan elektrot üzerinde remigrate varsayımı altında, göç oranı kolayca yara kapama 17 için gerekli zaman yara yarıçapı bölerek hesaplanabilir. Elektrik yaralama bir alternatif olarak, yakın olarak adlandırılan elektrik çit yöntemi (gösterilmemiştir) ilave edildi. Burada yüksek akım darbeleri aşılamadan sonra elektrotlar üzerinde bağlanma ve hücre göçünü önler. Hücreler ölçüm elektrodun çevresinde büyümeye ve içeriye kısa sürede elektrik darbeleri kapalı olarak göç başlayacaktır. Elektrik yaralama üzerinde elektrikli çit avantajı elektrot yüzeyi hücre büyümesi veya hücre göçü farklı kaplamaların etkilerini ölçmek için önemlidir hücre çıkarma, tarafından değiştirilmiş değil olmasıdır.

    Hücre uyarma

    Hücre göçü çalışma ek olarak, mükemmel bir empedans spektroskopisi için uygunduruyuşturucu ve hücrelerin üzerine toksinlerin etkilerini ölçmek. Şekil 5B trombin direncinde geçici bir düşüş olarak tezahür hücrelerinin kasılma ve boşluk oluşumu ile birleşen AK bariyer hiper-geçirgenliği ikna etmek için kullanılan bir klasik stimülasyon / inhibisyon deneyi sunuyor . Rho kinaz inhibitörü Y-27632 ile ön-inkübasyon tarafından trombin tepkisinin en bazal hücre gerilimi 18 düşürülmesi ve stres lif oluşumu 19 engelleyerek azalır. Daha sonra Rho kinaz engelleyici AT bariyer derhal ve toplam kurtarma yol açan, trombin ilave edildikten sonra farklı zaman noktalarında kullanılmıştır. Burada akut hücresel yanıtları incelemek için sürekli bir empedans ölçüm sisteminin avantajı belirginleşmektedir. Düzenli uç tahlillerin (örn. immünoflüeresans boyama veya makromolekül geçit) olarak kullanılan engelleyici bu akut yanıtı belirlemek ve ölçmek için çok zor olmasa imkansız olurdu. Dikkat etmek önemlidir ile impedance ölçümleri iyonlarına karşı geçirgenlik makro moleküllerin karşı tarif edilen ve değildir. ECIS ölçümleri ve makromolekül geçiş deneyler arasında mükemmel bir karşılaştırma sağlanmıştır Aman et al. 20, bakınız.

    Şekil 2,
    Şekil 2. Örnek ölçme. MVEC 5000 hücre / cm 2 ve MFT kayıt 10 gün boyunca gerçekleştirildi düşük tohumlama yoğunluğuna sahip bir jelatin kaplı 8W1E diziler üzerinde büyütüldü. Ölçüm, bir ECIS deney farklı salt çıkışları göstermektedir: A) yapışma, yayma ve yayılması; B) oluşumu ve bir birleşik hücre bariyer olgunlaşması, C) yara iyileşmesi bir elektrik yaranın uygulandıktan sonra, vazoaktif ile D) uyarma ajan trombin. İki ok orta işaret 4 gün aralıklarla gerçekleştirildi ve mekanik uyarıcılara ve sıcaklık ve pH değişikliklere karşı ölçümlerin hassasiyeti hakkında bir fikir vermek edildi içecek. Üst paneldeki görüntüler ölçüm karşılık ve ölçüm elektrot doğrudan satın alındı. Soldaki faz-kontrast görüntü elektrot karşılamak için başlangıç, 24 saat aşılamadan sonra endotel hücrelerini göstermektedir. Merkezinde ve birleşik endotel tabakasının sağ mevcut F-aktin üzerinde imüno-boyaması resim önce ve trombin (1 U / ml) ile uyarıldıktan sonra. Trombin sözde stres lif ve başlangıca direncinde bir düşüş ile ECIS sinyal tanınan arası endotel boşluklar (oklar ve görüntü parçaları) arasında geçici açıklığının oluşumu ile endotel hücreleri kasılmasına neden olur. Burada ölçüm hassasiyeti belirgin hale gelir ve hücre tabakası değişiklikler empedans sinyali ile ilişkili nasıl.s/ftp_upload/51300/51300fig2highres.jpg "target =" _blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

    Şekil 3,
    Şekil 3,. Hücre bağlanma ve büyüme. MVEC aynı donörden jelatin kaplı 8W10E diziler ve hücre büyümesi 60 saat boyunca çok sayıda frekansta kaydedildi üç farklı yoğunluklara sahip ekilmiştir. A) 4 kHz arasında bir frekansta en elverişli koşulları için üç direnç değerlerini ölçmek bariyer oluşumu. Üç tohum yoğunluğu yaklaşık bir konfluent engel kurduk. Ölçüm sonunda 1.200 Ω,. Ancak çoğalma hızları (eğrilerin eğimleri) belirgin farklılıklar B) kapasitans ölçülmesi 64 kHz yapışma ve yayılma ile ilgili bilgiler sağlar. Yapışma olduğu(2-8 saat arasında) kapasitans eğrisinde itial plato fazı. , Elektrot kapsama doğrusal bir ilişki içinde olan, Yayılma eğrisinin eğimi tarafından temsil edilmektedir ve tohumlama yoğunluğuna bağlı olarak 10-30 saat sonra tamamlanır. Zaman noktası t 1/2 (yarım maksimal kapsama) istatistiksel analiz için kullanılabilir. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

    Şekil 4,
    Şekil 4. Birleşik bariyer karakterizasyonu. Farklı pasaj numaraları (geçit 3 ve 6) jelatin kaplı 8W1E dizileri üzerinde tohumlandı ve bir MFT ölçüm EC bariyer. A) Direnç karakterize etmek için 30 saat boyunca uygulandı olan iki MVEC vericiler ölçümler, küçük verici 1 ca daha yüksek bir dirence sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Ca göre 11.000 Ω. Yaşlı vericiden 2. BC) ECIS ve modelleme yetenekleri 7.500 Ω düşük direnci için nedenini bulmak için kullanılır olmuştur. Modelleme benzer bir hücre-hücre etkileşim Rb ortaya ve olası bir nedeni. D gibi zayıf bir hücre-matris etkileşim Alpha gösterilen) RTC eğri altında kalan alan mikro-orantılıdır Fourier transformasyonu ile birleşik hücre tabakası içinde mikro-ölçmek için gerçekleştirildi . Spektrumları analizleri eski vericinin 2 daha az MicroMotion gösterir ve böylece zaten direnç sinyali (daha az varyans) den kabul edilebilir ne destekliyoruz. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

    5 "fo: İçerik-width =" "fo: src =" 5in / files/ftp_upload/51300/51300fig5highres.jpg "src =" / files/ftp_upload/51300/51300fig5.jpg "/>
    Şekil 5,. Hücre göçü, elektrik yaralanmalar ve trombin stimülasyon sonrası etkileri. Empedans kayıtları maksimum zamansal çözünürlüğe sahip 4 kHz'de yapıldı. A) MVEC verici 1 geçişi 3 ve jelatin kaplı 8W1E diziler üzerinde geçit 6 verici 2 'de kullanılmış ve konflüansa büyütülmüştür. Sonra bir elektrik yara 20 sn her bir süre ile 60 kHz iki 5 V darbeleri uygulama tarafından oluşturuldu. Genç donör 1 HUVEC jelatin kaplı 8W10E diziler üzerinde yetiştirilmiştir) eski vericinin 2. B kıyasla daha hızlı bir yara kapatma (göç, eğriler yamaçlarında) dayalı yetenekleri iyileşme daha iyi yara ve yaralama sonra daha yüksek bir direnç gösterdi. Birbirine kaynaşma üzerine, hücreler bazal serum ortamı artı% 1 insan serum albümini (HSA) ile tam kültür ortamının değiştirilmesi ile 1.5 saat süre ile aç edilmiştir. Bizeserum bileşenleri trombin tepkisini blok beri HSA ile düz orta yaş, kritik bir adımdır. En kısa sürede sabit bir direnç plato olarak tespit edildi, trombin oyuklara direkt olarak ilave edildi ve 200 ul pipet ile dikkatli bir şekilde karıştırılır. Maksimal trombin etkisi başlangıca ve bir ca direnç geçici bir düşüş ile karakterize 30 dakika, sonra görünür. İyileştikten sonra% 30-50 daha düşük direnç. Hücreler ya 30 dakika ya da engelleyici için Rho kinaz engelleyici Y-27632 ile önceden kuluçkaya 20, 30, ya da hemen trombin etkisi azaldı trombin ilavesinden sonra 40 dakika ilave edildi. , bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız .

    Discussion

    ECIS hücre özellikleri ve davranış taranması için hem de bilinen ve bilinmeyen maddelerin etkilerinin ölçümü için mükemmel bir araçtır. Bu şekilde hücreler, standart kültür koşulları altında tutulur, empedans sürekli olarak yüksek zamansal çözünürlüğe sahip izlenmekte ve optik sinyalleri ile korele edilebilir. Bu şekilde hücre manipülasyonlar için optimal zaman noktası morfolojik ve fonksiyonel hücre durumu bazında seçilebilir. Ne yazık ki, bu yüksek ölçüm çözünürlüğü sıcaklık, pH veya hücrelerin mekanik stimülasyonu (orta değişim) küçük değişiklikler hemen empedans sinyalini etkileyecek bu fiyat ile birlikte geliyor.

    Hücrelere küçük ölçüm akımının uygulanması ECIS ölçüm, noninvaziv tahribatsız ve etiket-özgür kılan, ama sonuç olarak sadece pasif Biyoelektrical özellikler (yok aksiyon potansiyelleri) ölçülebilir. Önemli bir özellik, bir dizi parametre der olmasıdır geçirgenliği veya yara iyileşmesi tahliller gibi birkaç klasik deneyleri, gelen bilgileri birleştirerek, tek bir ölçümden ived. Burada özellikle ilginç yönü matematiksel olarak modellenmiş veri direnç ve kapasitans değişiklikleri keşfetmek ve farklı hücresel yapılar (örneğin cep-rehber ya da hücre zarı) bunları başvurmak için kullanılır olmasıdır. Dikkat edilmesi gereken önemli empedans Spektroskopisi her zaman tek hücreler üzerinde çalışmalar için izin vermek ve aynı zamanda matematiksel model birleşik hücre tabakalarının geçerlidir etmez algılama elektrot, ilgili tüm hücrelerden bir ortalama sinyali sağlamasıdır. Bu nedenle endotelyal hücreler önce olgun hücre yapışıklıklar ve hareketsiz hücreler sağlamak için modelleme için kullanılan en az bir gün için birleşik halde muhafaza edilmelidir. Aynı şekilde, elektrik yaralar sadece en iyi verim elde yaralama ve elektrotların zarar görmesini önlemek için, yüksek frekanslarda çok kısa yaralama darbeleri kullanılarak hücre tabakaları birbirine karışan uygulanmalıdır.

    jove_content ">, her deneyde, bu tür tek tek hücre tipi için bir dizi alt-tabaka, kaplama ve tohumlama yoğunluğunun kombinasyonu gibi çeşitli parametreler bir deney öncesi test edilmiş ve optimize edilmesi gerekir gibi, bir ECIS ölçümü bilgileri ve maksimum miktarını almak için.

    ECIS önemli bir sınırlama ölçüm moleküler seviyede doğrudan bilgi sağlamak olmamasıdır. Böylece ECIS ölçümleri hücresel yapıları veya özellikleri olan bir bilimsel sorunu ilişkilendirmek yardımcı ve test edilebilir bir hipotez üretimi için önemli bir girdi sağlamak için deneysel bir serinin başında genellikle çoğu bilgilendirici. Bu nedenle ECIS ve modüler tasarımı terzi diziler için imkanı ile geniş bir uygulama yelpazesi sunmaktadır. Son dizisi gelişmeler hücre çoğalması ve elektrik yaraladığı yüksek verim empedans gösterimleriyle ilgili gelecekteki odak ve in vivo simülasyonu için özel akış dizilerin ilerlemesini gösterir

    Daha fazla literatür
    Ayrıca uygulama notları, web seminerleri ve tüm ECIS kesimleri kapsayan yayınların ayrıntılı bir listesi için Uygulamalı Biyofizik web sayfası (www.biophysics.com) bakın.

    Disclosures

    Yapısı ve yazının içeriği yazarların tam sorumluluk kalmıştır oysa Uygulamalı BiyoFizik A.Ş., açık erişim ücretleri kaplı.

    Acknowledgements

    Yazarlar, onların tavsiye Dr Charles Keese, Dr Christian Renken, Hıristiyan DEHNERT (Uygulamalı BiyoFizik Inc) ve Dr Ulf Radler (Ibidi GmbH) teşekkür etmek istiyorum yardımcı ve bu yazının hazırlanması sırasında verimli tartışmalar olacaktır. Daha biz onun mükemmel teknik destek için Jan van Bezu teşekkür etmek istiyorum.

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    ECIS Zθ Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W1E Lexan Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    8W10E PCB Electrode Array Applied Biophysics Inc., Troy, NY, USA ibidi GmbH, Munich, Germany
    L-Cystein Merck Millipore 102838
    Gelatin Merck Millipore 104070
    Bovine Thrombin Merck Millipore 604980
    Albuman (Human Serum Albumin) Sanquin
    Y-27632 Tocris Biosciences 1254
    EGM-2 BulletKit  Lonza CC-3162
    Pen/Strep Lonza 17-602E

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Giaever, I., Keese, C. R. A morphological biosensor for mammalian cells. Nature. 366, (6455), 591-592 (1993).
    2. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, (17), 7896-7900 (1991).
    3. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Cell-substrate contact: another factor may influence transepithelial electrical resistance of cell layers cultured on permeable filters. Exp. Cell Res. 250, (2), 576-580 (1999).
    4. Wegener, J., Sieber, M., Galla, H. J. Impedance analysis of epithelial and endothelial cell monolayers cultured on gold surfaces. J. Biochem. Biophys. Methods. 32, (3), 151-170 (1996).
    5. Pänke, O., Balkenhohl, T., Kafka, J., Schäfer, D., Lisdat, F. Impedance spectroscopy and biosensing. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 109, (11/2007), 195-237 (2008).
    6. Wegener, J., Zink, S., Rösen, P., Galla, H. Use of electrochemical impedance measurements to monitor beta-adrenergic stimulation of bovine aortic endothelial cells. Pflugers Arch. 437, (6), 925-934 (1999).
    7. Eker, B., Meissner, R., Bertsch, A., Mehta, K., Renaud, P. Label-free recognition of drug resistance via impedimetric screening of breast cancer cells. PloS ONE. 8, (3), (2013).
    8. Nacke, T., Anhalt, M., Frense, D., Beckmann, D. Anwendungsmöglichkeiten der Impedanzspektroskopie in der Biotechnologie (Application of the Impedance Spectroscopy in the Biotechnology). Technisches Messen. 69, (1/2002), 12-18 (2002).
    9. DePaola,, et al. Electrical impedance of cultured endothelium under fluid flow. Ann. Biomed. Eng. 29, (8), 648-656 (2001).
    10. Pietrosimone, K. M., Yin, X., Knecht, D. A., Lynes, M. A. Measurement of Cellular Chemotaxis with ECIS/Taxis. J. Vis. Exp. (62), (2012).
    11. Wegener, J., Keese, C. R., Giaever, I. Electric cell-substrate impedance sensing (ECIS) as a noninvasive means to monitor the kinetics of cell spreading to artificial surfaces. Exp. Cell Res. 259, (1), 158-166 (2000).
    12. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Impedance analysis of MDCK cells measured by electric cell-substrate impedance sensing. Biophys. J. 69, (6), 2800-2807 (1995).
    13. Lo, C. M., Keese, C. R., Giaever, I. Monitoring motion of confluent cells in tissue culture. Exp. Cell Res. 204, (1), 102-109 (1993).
    14. Opp, D., Wafula, B., Lim, J., Huang, E., Lo, J. C., Lo, C. M. Use of electric cell-substrate impedance sensing to assess in vitro cytotoxicity. Biosens. Bioelectron. 24, (8), 2625-2629 (2009).
    15. Szulcek, R., Beckers, C. M. L., et al. Localized RhoA GTPase activity regulates dynamics of endothelial monolayer integrity. Cardiovasc. Res. 99, (3), 471-482 (2013).
    16. Liang, C. -C., Park, A. Y., Guan, J. -L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nat. Protoc. 2, (2), 329-333 (2007).
    17. Keese, C. R., Wegener, J., Walker, S. R., Giaever, I. Electrical wound-healing assay for cells in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, (6), 1554-1559 (2004).
    18. Krishnan, R., Klumpers, D. D., et al. Substrate stiffening promotes endothelial monolayer disruption through enhanced physical forces. Am. J. Physiol., Cell Physiol. 300, (1), 146-154 (2011).
    19. Van Nieuw Amerongen, P. G., van Delft, S., Ma Vermeer, M., Collard, J. G., van Hinsbergh, V. W. Activation of RhoA by thrombin in endothelial hyperpermeability: role of Rho kinase and protein tyrosine kinases. Circ. Res. 87, (4), 335-340 (2000).
    20. Aman, J., et al. Effective treatment of edema and endothelial barrier dysfunction with imatinib. Circulation. 126, (23), 2728-2738 (2012).

    Comments

    1 Comment

    1. The video is not working before procedure discription.

      Reply
      Posted by: Atiya S.
      August 31, 2015 - 2:16 PM

    Post a Question / Comment / Request

    You must be signed in to post a comment. Please or create an account.

    Video Stats