培養細胞における細胞内および細胞外アスコルビン酸の定量のための迅速かつ特異的マイクロプレートアッセイ

Biology

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Summary

アスコルビン酸は、近年では光になってきたそれらの多くは、細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。ここでは、媒体スループット、細胞培養の両方において細胞内および細胞外アスコルビン酸の測定のための特異的かつ安価なマイクロプレートアッセイを記載している。

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Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

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Abstract

ビタミンC(アスコルビン酸)は、唯一の近年の光になってきた、その多くは細胞代謝の多数の重要な役割を果たしている。脳のアスコルビン酸の恒常性のために重要であると思われる関係 - 例えば、脳内では、アスコルビン酸は、ニューロンとビシアストロサイト間のアスコルビン酸サイクルを伴う神経保護および神経調節的に作用する。さらに、新たな証拠は強くアスコルビン酸よりも古典的に認識され、細胞および全身の鉄代謝の調節において大幅に拡大役割を有することを示唆している。ノーマルと規制緩和、細胞および生物生理学のアスコルビン酸の重要な役割の増加の認識は非常に高価な専門機器を必要とせずに実行することができ、中スループットと高感度な分析手法の範囲を要求している。ここでは、BOの決定のための具体的かつ比較的安価なマイクロプレートアッセイ、中スループットの明示的な指示を提供細胞培養におけるTH細胞内および細胞外アスコルビン酸。

Introduction

1928年から1934年1に発表された論文中のアスコルビン酸(ビタミンC)、そして念願のアルバートシェント·ジェルジによる「抗壊血病因子」、および他のようなその同定の化学的性質の発見は、歴史の中で画期的なイベントでした生化学の。確かに、これらの発見は、シェント·ジェルジが1937年にノーベル生理学·医学賞を受賞しているに貢献した。動物や植物生理学におけるアスコルビン酸のための役割の拡大を続けるスイートだけでなく、人間の健康を、アクティブな科学の対象であり続ける調査と論争。

L-アスコルビン酸が豊富な生理学的還元剤であり、哺乳動物系で補因子、酵素、コラーゲンヒドロキシル化、カルニチンやノルエピネフリン生合成、チロシン代謝とペプチドホルモンのアミド化2を含む数々の明確に定義された酵素反応に貢献しています。興味深いことに、取り付けevideNCEは、アスコルビン酸などの水酸化に関与リルとアスパラヒドロキシラーゼなどの他の鉄依存ジオキシゲナーゼを、刺激し、低酸素誘導因子(HIFS)1αおよび2α3の標的化に関与していることを示唆している。最近の報告では、アスコルビン酸が核ヒドロキシラーゼ、十文字C(のJmjC)ドメインタンパク質を刺激する、その活性を介したクロマチン脱メチル化に影響を与えることによって、T細胞の成熟に関与していることを示唆している。後者は完全な活性4のためのアスコルビン酸を必要とするように表示されます。実際、アスコルビン酸によるこのような酵素の刺激は、HIFとコラーゲンヒドロキシラーゼのアスコルビン酸による刺激と同様のメカニズムで起こると思われる。他の古典的な効果の中で、アスコルビン酸は、水溶性連鎖頑丈ラジカルスカベンジャー5などの細胞抗酸化および原形質膜のリサイクルに大きく寄与するα-トコフェロールwを、6α-トコ基の還元による(ビタミンE)HICHは、膜脂質過酸化に対する保護7において重要である。ほとんどの哺乳類は、D-グルコースからのアスコルビン酸の新たな肝臓での合成が可能であるが、重要なのは、高等霊長類、モルモットといくつかのコウモリはビタミン8の栄養源に依存しています。これはグロ遺伝子の不活性化に起因して、影響を受けていない哺乳動物のオルソログのは9月13日オキシダーゼ酵素、γ-グロノ-ラクトンをコードする。この酵素は、グルコース13からのアスコルビン酸生合成の最終的な反応のために必要である。

ヒトでの腸管腔からのトランスポーターが介在する吸収後、アスコルビン酸は、循環系によって体全体に分布している。ビタミンは、一般的に(濃度は、通常、一般的な血漿中濃度と同様である、赤血球の注目すべき例外として)、およびマイクロモルの濃で、細胞内にミリモル濃度でその還元型で発見されているほとんどの細胞外液14,15におけるentrations( 例えば 50〜200μM)。

生理的条件下では、アスコルビン酸は通常、アスコルビン酸、フリーラジカルに可逆的一電子酸化を受ける(AFR;もmonodehydroascorbateまたはsemidehydroascorbateとして知られている)。 AFRは比較的安定なラジカル16ですが、戻ってアスコルビン酸への迅速な一電子酵素的還元が存在しない場合に、2 AFRSは1アスコルビン酸とデヒドロ1(DHA)9,13,17に不均化を促進することができます。セルの内部に、アスコルビン酸、DHAの二電子酸化生成物は、急速にグルタチオンとNAD(P)H依存性酵素及び非酵素的反応によって13に戻って、アスコルビン酸を低減することができる。

それは古典的に鉄代謝におけるアスコルビン酸の唯一の重要な役割は、非ヘム鉄18の栄養吸収を刺激することであることが認められているが、我々と他の証拠Sを提供してきたtronglyアスコルビン酸塩、この金属の代謝に大幅に拡張役割を果たすことを示唆している。まず、アスコルビン酸満ち細胞によって放出されたアスコルビン酸は、細胞19,20による非トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節するのに重要な役割を果たしていると思われる、と非常に最近の証拠は、アスコルビン酸はまた、トランスフェリン結合鉄の取り込みを調節することを示すセル21で、後半は主要な生理学的な鉄取り込み経路22に対応しています。

アスコルビン酸は哺乳類23,24の正常な中枢神経系の機能に必須である。一緒に副腎皮質、脳下垂体、胸腺、網膜と黄体と、脳は他の体組織23,25-27にアスコルビン酸の相対的な高濃度が含まれています。また、アストロサイト28,29および神経様細胞にグルタミン酸への30の両方の露出がascorbat外空間へとアスコルビン酸の放出を引き起こすことが知られているEはグルタミン酸誘発神経機能障害31に対してニューロンを保護すると考えられている。アストロサイトからのグルタミン酸誘発アスコルビン酸の放出の正確なメカニズムは不明であるが、我々は最近、アストロサイトのグルタミン酸とアスパラギン酸トランスポーター(GLASTによるグルタミン酸の取り込みによる膨潤細胞の関与を示す証拠を提供した。にも知られている興奮性アミノ酸トランスポーターアイソフォーム1 [EAAT1ヒトにおける)とアスコルビン酸塩32のような小さな有機アニオンに対して透過性容積感受性オスモライトおよび陰イオンチャネル(VSOACs)の結果としての活性化。 VSOAC形成に関与する形質膜導管の分子同一性は、33,34同定されていない。

多くのアッセイは、蛍光分光光度アッセイ及びクロマトグラフィー35,36を含む生物学的サンプル中のアスコルビン酸の測定のために開発されてきたが、特異性、感度、interferencに多くのばらつきがある化学汚染物質によるE、エンドポイントの分析物の効果的な直線範囲と安定性。さらに、アッセイの選択に影響を与える他の重要な要因は、迅速、使いやすさや、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)装置などの比較的特殊な装置へのアクセスである。

ここでは、培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定だけでなく、培養細胞からのアスコルビン酸の流出を測定するための別々のアッセイのためのシンプルかつ非常に特異的な比色マイクロプレートアッセイを提示する。後者のアッセイは、ナトリウム依存性アスコルビン酸トランスポーター(SVCTs)が発表しアスコルビン酸の迅速な再取り込みによる細胞からのアスコルビン酸の放出の過小評価の問題を回避することを目指しています。これらのメソッドの両方が私たちの前の出版物19,20,32,37,38の一部で登場してきたが、この原稿は、その効果的な実行のための命令とガイドラインの明示的なセットを提供します。

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Protocol

1。培養細胞における細胞内アスコルビン酸の決定

  1. 細胞培養および収穫
    1. 標準的な培養手順19-21,32,38を使用して懸濁液(例えば 、ヒト赤白血病、K562)または付着細胞( 例えば 、一次星状膠細胞)を成長させる。注意:細胞はアスコルビン酸が含まれていることを確認するために、どちらかアスコルビン酸またはDHA 33,39などのアスコルビン酸で培養された細胞をロードします。
  2. アスコルビン酸含有細胞抽出物を作成します。
    1. リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄懸濁液または氷のように冷たいセル透過処理バッファー[CPBの450μLと接着細胞の適切な数をインキュベートする; PBS中の0.1%(w / v)のサポニン; 4°C]。注:経験的にエンドユーザーが(下記参照)アッセイの直線範囲内で吸光度の値を得るために必要なセルの数を決定します。注:組織抽出物はまた、(さらなる詳細については、説明を参照)を使用することができる。
    2. 胸焼け10分間氷上でTE細胞は、徹底した細胞の溶解を確実にする。
    3. 冷蔵微量遠心(4℃)中で5分間16,000×gで粗溶解物の遠心分離により細胞破片を除去することによって、明確にアスコルビン酸含有細胞内抽出液を作成します。
    4. 慎重に各試料から4×100μLずつを除去し、PBS( "-AO」)のみ、または25μL/ウェルの45.5 U25μlの/ウェルのいずれかを含む96ウェル平底プレート中のウェルの水平シーケンスに追加/ mlのPBS(「+ AO」)中のL-アスコルビン酸オキシダーゼ(AO)の原液。注:これは(下記参照)の規格の準備と並行して行う必要があります。
  3. アスコルビン酸標準曲線の構築(各アッセイのために新たに構築しなければならない)
    1. 氷冷PBS中の10mMアスコルビン酸の原液を準備します。注:1分光光度法で石英キュベットを用いアスコルビン酸の濃度を確認265 nmの(吸光係数= 14.5mmで-1 cm -1)40時1cm経路長。
    2. 慎重に0〜20μmのアスコルビン酸標準のシリーズを用意しております。
    3. ステップ1.2.4と並行して、慎重に各標準から4×100μlアリコートを除去し、PBS( "-AO」)または25μL/ウェルが含まれ、96ウェル平底プレートのウェルの水平シーケンスに追加PBS中のAOの45.5 U / mlの原液(「+ AO」)。 (注)上記のアスコルビン酸標準100μlのアスコルビン酸0-2ナノモルが含まれます。注意してください、AOの目的は、減少をフェリシアにする非アスコルビン酸還元の寄与のために制御することです。
  4. 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ1:選択的にアスコルビン酸を除去し、定量的にフェリシアンとアスコルビン酸を酸化
    1. 公転ホイルでプレートを覆うことにより、暗所で5分間室温で550rpmで96ウェルプレートを混合する。注:T彼のステップは、DHAに「+ AO」のウェルですべてのアスコルビン酸を酸化する必要があります。 「-AO」ウェルは影響を受けないはずです。
    2. すべてのウェルにPBS中で(ここでは「フェリシアン」という。)3.5 mMのフェリシアン化カリウムの50μlを加える。最終的な[フェリシアン] = 1 mMの。注意:マルチピペッターを使用してください。
    3. 公転暗所でさらに5分間室温で550rpmでプレートを混合する。注:このステップは、酸化されたアスコルビン酸の1分子当たりに減少フェリシアンの2分子の化学量論比でアスコルビン酸によってフェロシアンするフェリシアンの減少をもたらすべきである。
    4. 直ちに50%(v / v)酢酸および30%(w / v)トリクロロ酢酸(TCA)を含有する新たに構成された溶液の25μlを加える。注意:マルチピペッターを使用してください。
  5. 細胞内のアスコルビン酸を決定-ステップ2:フェロシアン化物の量を定量37を形成し
    1. Eにフェロシアン決定液37を100μlを追加よくACH。注:作業溶液は、使用直前になされるべきである:3 M酢酸ナトリウムの2ミリリットル液(pH 6.0);氷酢酸(〜17.4 M酢酸)を0.5ml; 0.2 Mクエン酸を2ml; 0.1 M酢酸3.3ミリモルのFeCl 3の2ミリリットル; 30 mMのferene-Sの1ミリリットル。この作業溶液の最終容量は7.5ミリリットルにする必要があります。
    2. 公転室温で30分間、550rpmで、暗所でプレートを混合する。
    3. 593 nmでのウェルの吸光度値を読み取る( すなわち(II)(ferene-S)3錯体の吸収極大)。
    4. 最初に対応するから「+ AO」井戸のA 593 nmの値を減算して百万個の細胞あたりのナノモル、アスコルビン酸などの細胞内アスコルビン酸の量を計算する-各サンプルの「AO」井戸とし、アスコルビン酸の標準曲線から補間する(ステップ1.3を参照してください。 )。標準曲線を構築する場合、ascorb量に対する各標準のために、この「差分値」をプロットするウェルあたり食べた。

培養細胞からのアスコルビン酸流出の2。決定

  1. 細胞培養および収穫
    1. (ステップ1.1を参照)、上記のように、サスペンションや接着細胞を増殖させる。注:最良の結果を得るために、サスペンションや接着細胞で24ウェルプラットフォーム形式で、以下の分析を実施しています。
    2. 再懸 ​​濁浮遊細胞、または、またはカルシウムおよびマグネシウムなしで、予め温めたHEPES-緩衝生理食塩溶液400μlで、接着細胞をオーバーレイし、5mMのD-グルコース含有、ウェル中(HBS / D pH7.3の、37℃) 24ウェルプレート。検査される各24ウェルプレート上の指定された無細胞ウェルにHBS / Dの同じボリュームを追加します。注:後者は(以下を参照)は、ベースライン反応のための無細胞対照として役立つ。

3。リリースアスコルビン酸の量を決定します

  1. 以下の原液を予め用意する必要があります。120HBS / D中のU / mlのAO(新鮮な準備); 2.4 mMのFerene-S HBS / Dでは; HBS / Dでは120μMのFeCl 3及び600μMのクエン酸Na(より高濃度のストック溶液からすぐにご用意)。
  2. ferrireduction反応(ウェルあたり最終容量は600μLであるべき)を開始するには、すでにHBS / Dが400μLを含む個々のウェルに試薬を次のボリュームを追加します。
    1. 三連のウェルをペアリングするには、AO(120 U / ml)またはHBS / Dが50を添加する。最終AO濃度は10単位/ mlである必要があります。注:ラベルとして井戸を対になった」 - AO "と" + AO」。
    2. 37℃で5分間穏やか軌道に混合しながらプレートを混ぜる
    3. すべてのウェルに2.4 mMのferene-Sの50μlを加える。最終ferene-S濃度は200μMである必要があります。 37℃で5分間、上記のようにプレートを混合
    4. 新たに調製された120μMのクエン酸第二鉄の50μlを加える。最終的な鉄とクエン酸の濃度は、10μMの鉄および50μMクエン酸である必要があります。よく混ぜる。
    5. 3連のコントロールウェルでは、上にあるメディアを吸引し、0.1%サポニンを含む600μlのHBS / Dを追加します。注:これらは、(下記参照)並行して行われるべき乳酸脱水素酵素(LDH)放出アッセイのために「100%の細胞溶解」対照として役立つ。
    6. 37℃の暗所で60分間インキュベート
    7. アスコルビン酸流出アッセイの終了時に、急速に各ウェルから500μLを吸引し、適切に24ウェルプレートのウェルをラベルに追加します。注:懸濁細胞を、最初に4℃での遠心分離により細胞を除去
    8. 96ウェルプレートに上清の300μlのアリコートを追加してから、593で読み取っ。

    細胞外アスコルビン酸4。決定

    1. 593 nmでのウェルの吸光度値をお読みください。
    2. 細胞内のアスコルビン酸の測定のために記載したようmgタンパク質(または細胞百万個あたり)当たりのナノモルアスコルビン酸として細胞外アスコルビン酸の量を計算するステップ1.5.4中。注:アスコルビン酸放出は、細胞内アスコルビン酸によって制限されないように、エンドユーザが条件を最適化すべきである。

    LDH放出の5。決定

    1. 各サンプルからの細胞外液の残りの200μlの細胞溶解の程度を決定するために、LDH放出アッセイ32,41を実施しています。注:総放出可能なLDHの%として計算します。 0.1%サポニンで処理したサンプルから放出可能なLDHを決定します。

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Representative Results

浮遊培養細胞の細胞内アスコルビン酸の定量

第一のアッセイ( 図1)において、細胞内アスコルビン酸は、以前公開された手順37でフェロシアン化物の高感度な測定を使用して、フェロシアンするフェリシアン化( すなわち 、AOと小文字を区別)削減アスコルビン酸特有の後、決定されます。アスコルビン酸の検出は、フェロシアン化による第一鉄と第二鉄の還元してフェロシアン化物するフェリシアンのアスコルビン酸依存的な減少、によって生成された第一鉄の比色キレート化に基づいています。いくつかの二価の金属イオン( 例えば2 + CO 2 +とZn 2 +)の超生理学的濃度は、おそらくferene-Sによるキレート化のための第一鉄と競合することにより、干渉することができるように、適切な予防措置は、そのような条件の37の下で撮影する必要があります。

2は、アスコルビン酸標準0〜20μMのセットのための典型的な標準曲線を示し(または96ウェルプレートのウェルあたり0-2ナノモルアスコルビン酸を、「プロトコル」の手順6.5を参照してください。)。この図には示されていないが、直線性( すなわち、正味〜1.6の593 nm)を約80μMの試料アスコルビン酸濃度に対応する、ウェル当たり8ナノモルアスコルビンまで維持される。アッセイは、正常にウェル当たり0.25ナノモルアスコルビン酸(2.5μM試料アスコルビン酸濃度)未満アスコルビン酸レベルを検出するために使用することができる。

K562細胞は、急速に細胞外DHAからの細胞内アスコルビン酸を蓄積ではなく、アスコルビン酸( 図3を参照して、レーンとLawen 2008 19からの許可を得て複製)。この代表的な実験では、PBS洗浄し、K562細胞(4×10 6個/ ml)をアスコルビン酸(ASC)、DHA、DHA +50μMのサイトカラシンB(DHA + CB)。ASC + 5のどちらかの500μMのPBSで培養したmMのフェリシア(37℃で30分間SC / FIC)またはAsc関数+ 50 U / mlのAO(ASC / AO) 「プロトコル」で説明したように、細胞内のアスコルビン酸を測定した。

K562細胞によるDHAの取り込みが促進的グルコーストランスポーター(GLUT)媒介輸送をすることによって発生します( 図4を参照して、レーンとLawen 2009 42からの許可を得て複製)。この代表的実験でDHA取り込みの供給過剰の関与を評価するため、K562細胞を37℃で15分間、0.5%のエタノールの前を含むMBSに溶解サイトカラシンB(CB)又はジヒドロサイトB(H 2 CB)の増加する濃度とともにインキュベートした同じ培地中で37℃で30分間、400μMDHA( 図4A)とのインキュベーション。次いで、細胞を氷冷したMBS 100容量で3回洗浄し、「プロトコル」に記載されているように、それらの細胞内アスコルビン酸を測定した。 CBおよびH 2 CBの両方がマイクロモルで運動性のプロセスを阻害しつつ、注意することが重要である濃度(1〜100μM)、単二 ​​重結合が存在することによって、H 2、CBとは異なるだけCBは、低マイクロモル濃度(1〜10μM)43時GLUT依存性輸送を阻害する。 DHAの摂取は、IC 50 <2.5μMのと、CBによって阻害していたが、H 2、CBによって阻害ではなかったようにそのため、DHAの摂取は、おそらく、GLUT介在輸送38によって起こる。あるいは、 図4Bに、細胞はGLUT-搬型の濃度の増加に曝された洗浄したが、非代謝性のグルコース類縁3 - O-メチル-D-グルコース(3 - OMG)または非GLUT-搬型グルコースの立体異性体のL -ここでも結果だけGLUT輸送性グルコースアナログの存在下で起こる細胞内アスコルビン酸の蓄積の阻害としてのDHAの輸入におけるGLUTの関与を示す前に、パネルAのように、DHAとのインキュベーショングルコース。

Determina付着細胞からのアスコルビン酸流出のTiONから

第二のアッセイでは、培養細胞からのアスコルビン酸の流出の速度を決定することができる。細胞からのアスコルビン酸の放出は、細胞19,20による非トランスフェリン結合鉄のアスコルビン酸調節性細胞への取り込みのために重要であると思われるので、この特異的なアッセイは重要です。非トランスフェリン結合鉄の取り込みは、hemochromatoses 22などの鉄過剰症の病態生理にだけでなく、哺乳類の脳22内のアストロサイトニューロン鉄交換と恒常性に関連すると考えられている。確かに、我々は最近、主要な興奮性神経伝達物質は、L-グルタミン酸は、GLASTおよび推定VSOACs 32によるアスコルビン酸の放出を誘発その後の細胞膨潤させることによって、L-グルタミン酸の取り込みに応じた方法で、アストロサイトからのアスコルビン酸の放出を誘発することが示されている。同様に、アスコルビン酸rをアスコルビン装填アストロサイトからエリーズは興奮性アミノ酸、L-アスパラギン酸ではなく、非興奮性アミノ酸L-グルタミンにより刺激され得る。この効果は、アスコルビン酸の刺激(AA)アスパラギン酸(黒丸)による解除とグルタミンの初代培養から(白丸)の用量反応曲線を示す、(レーンとLawen 2012 32からの許可を得て複製) を図5に示されているアスコルビン酸仕掛けマウスアストロサイト。

これはアスコルビン酸流出アッセイは、細胞内アスコルビン酸の測定のために提供されている試験との違いを議論することが重要です。主な違いは、溶液中に残存するアスコルビン酸塩のレベルは、細胞内アスコルビン決定方法の場合のように、所与の時点の終了時に行われ、化学反応によって決定されていないという事実にある。代わりに、「還元署名」が蓄積される期中にアスコルビン酸を細胞から放出される。この還元署名は大きな細胞外および膜透過性として第一鉄の急速なキレート化に続く細胞外クエン酸第二鉄のアスコルビン酸依存的減少の形で取り込まれている[鉄(II)(ferene-S)3] 4 -キレート。 Ferene-Sは、アッセイの短い時間にわたって、同様に膜非透過性と考えることができる。この色素原複合体のレベルは、エンドポイント測定として決定することができる。このキレートの唯一のAOの影響を受けやすいのレベルが決定されるように、このアッセイは、細胞外のL-アスコルビン酸の測定のために特異性の高い学位を提供しています。

図1
図1。のためのプロトコルにおける重要なステップを示すフロー図細胞内アスコルビン酸の定量。

図2
図2アスコルビン酸標準0〜20μMのセットのための典型的な標準曲線(または96ウェルプレートのウェルあたり0-2ナノモルアスコルビン酸;。「プロトコル」のステップ6.5を参照)。エラーバーは、次のように表示されません彼らはシンボル占める範囲内にある。

図3
図3。K562細胞は急速に細胞外DHAからの細胞内アスコルビン酸を蓄積ではなく、アスコルビン酸の PBS洗浄K562細胞(4×10 6個/ ml)を500μMのoを含むPBS中でインキュベートしたFのどちらかアスコルビン酸(ASC)、DHA、DHA +、50μMのサイトカラシンB(DHA + CB)。ASC + 5 mMのフェリシア(ASC / FIC)またはAsc関数+ 50 U / mlのAO(ASC / AO)37℃で30分間C. 「プロトコル」で説明したように、細胞内のアスコルビン酸を測定した。示された結果は、3つの個別の実験(+ SD)の平均である。 *細胞内アスコルビン酸濃度は、K562細胞( すなわち 1.6〜μl/106細胞)19,20のための予め定められた細胞内の水空間を用いて推定した。この図は、レーンとLawen 2008 19の許可を得て再現されています。

図4
K562細胞による図4。DHAの取り込みが促進的グルコーストランスポーター(GLUT)で発生した輸送を媒介。+10%RPMI中6-8×10 6個/ ml(に成長したK562細胞はv / v)ウシ胎児血清、37℃で、5%CO 2、95%空気が最初にMBSで3回洗浄した。 137mMのNaCl、2.7mMのKCl、15mMのMOPS-Na +を、pH7.3の、モップ酸緩衝生理食塩水(MBS中に溶解またはジヒドロサイトB(H 2 CB)、洗浄した細胞を、次いで、サイトカラシンB(Sigma社CB)の増加する濃度に曝露した)前に37℃で30分間、400μMDHAとのインキュベーション、0.5%エタノールを含有する(A)。次いで、細胞を冷MBS 100容量で3回洗浄し、「プロトコル」に記載されているように、それらの細胞内アスコルビン酸を測定した。 DHAの取り込みがCBによって阻害ではなく、H 2、CBたので、DHAの摂取は、GLUT介在輸送によって発生します。あるいは、(B)に、洗浄した細胞を増加する濃度に曝露したGLUT-搬型が、非代謝性のグルコース類縁3 - O-メチル-D-グルコース(3 - OMG)または非GLUT-搬型グルコースの立体異性体">(A)のように、DHAとのインキュベーション中のL-グルコース。再び結果は、DHA摂取におけるGLUTの関与を示している。この図は、レーンとLawen 2008 42の許可を得て再現されています。

図5
アスコルビン装填アストロサイトから図5。アスコルビン酸放出は興奮性アミノ酸L-アスパラギン酸によって刺激ではなく、非興奮性アミノ酸L-グルタミンされこの図は、アスコルビン酸の刺激(AA)の放出によってための用量反応曲線を示すアスコルビン酸仕掛けマウスアストロサイトの初代培養からアスパラギン酸(黒丸)およびグルタミン(白丸)。示されたデータは、3実験の平均(±SD)である。、P <0.001 「基底」状態。この図は、レーンとLawen 2012 32の許可を得て再現されています。

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Discussion

本稿では、培養細胞における細胞内および細胞外コンパートメントから派生したアスコルビン酸の測定のための2、迅速な特定と比較的敏感比色マイクロプレートアッセイを提示する。アッセイは、標準的な実験機器や試薬へのアクセスを完了することができます。アッセイに必要な適度に高価な試薬は、それが、L-アスコルビン酸に向けた分析物特異性の高い学位を与えるように不可欠である、AO、です。アッセイは、いずれの浮遊細胞( 例えば K562)または付着細胞( 例えば HepG2細胞または初代げっ歯類のアストロサイト)に適していて、成功して、このような細胞の19,20,32,37,38を使用して、以前の出版物で使用されてきた。それらはL-アスコルビン酸のために十分に特異的ではないようAOの代わりに他のアスコルビン酸酸化剤( 例えば、テンポール)の使用は避けるべきである。さらに、例えば、化合物の使用アスコルビン酸放出アッセイでTEMPOLは、細胞膜を通過し、細胞内アスコルビン酸44を酸化するテンポールの能力によって混乱されます。 AOは、基本的に膜非透過性に使用される時間のコースを超えています。

我々は、上記の比色アスコルビン酸アッセイおよびVisliselや同僚36の蛍光アスコルビン酸測定で得られた結果の直接比較を行った。我々は、両方のアッセイが細胞内アスコルビン判定アッセイ(データは示していない)のために同一の結果を与えたことを見出した。興味深いことに、上記のアスコルビン酸放出アッセイは、蛍光エンドポイントアッセイと比べてアスコルビン酸流出の見かけの速度のために有意に高い値を示した。これは、本明細書に記載のアスコルビン酸塩流出アッセイとして容易にアスコルビン細胞による再取り込みの可能性によって混乱されていない明らかな「アスコルビン酸塩流出」の決定を可能にすることを示唆している。おそらくPLを含むプロセスASMA膜SVCTs。このような再取り込みは、エンドポイントアスコルビン酸測定が行われた場合は、一定期間中にリリースされたアスコルビン酸の実際のレベルの過小評価の原因となる傾向がある。これは、(組織試料( 例えば、筋肉、肺または脳)は、細胞内アスコルビン判定アッセイ用培養細胞の代わりに使用される場合、次に組織ホモジネートを氷冷CPB及び機械的破壊のいくつかのフォームを使用して構築されるべきであることに留意すべきである例えばダウンス均質化、プローブチップ音波処理、フレンチプレスなど )。細胞破片を遠心分離により除去されるべきであり、ユーザは、ステップ1.2.4に進む前に試料除タンパクおよび/またはプロテアーゼ阻害剤の添加のための可能な必要性を考慮すべきである。

また、サイトカラシンB(<10μM)の低マイクロモル濃度が32アッセイによって決定したアスコルビン酸流出の見かけの速度を阻害しなかったことが以前に報告され、クエン酸第二鉄を細胞外アスコルビン酸19によって主に低減しつつ、フェリシアンが(transplasma膜電子伝達の過程を経て)、アスコルビン酸の細胞内プールで主に減少すると、フェリシアンよりも優先されるべきである20,38。

これらのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。まず、本明細書に記載のアッセイは、選択的かつ迅速に対になったサンプル中のアスコルビン酸を除去するには、AOの能力に大きく依存。 AOの調製物の比活性は、公称と想定活性よりも著しく小さい場合は、それは可能であるAO-アスコルビン酸含有s内の全てamplesは削除されます。アスコルビン酸塩の存在量を計算するために「直接法」を用いた場合に、未知試料中のアスコルビン酸の量の過小評価につながる可能性がある。一つは推奨されている「標準曲線法」を使用する場合は、AOの低活性製剤は、アッセイ感度の損失につながる。我々は、良好な結果が一貫して次に超えないために-80℃で保存した100μlアリコートに分割されているPBSまたはMBS、どちら1mlにAOの1,000 Uを溶解することによって構築AOの調製物を使用することによって得られることを見出した1ヶ月。 AOは、タンパク質分解的に細胞溶解液によって分解され得るタンパク質であるように、また、プロテアーゼ阻害剤は、AO含有ウェルの溶解物を添加する前に細胞溶解物に添加することができる。これはプロテアーゼ活性に富んでいる細胞または組織の溶解物を使用するときに考慮する必要が便利修正かもしれません。

また、アッセイの感度についてBOVE大部分は発色性二座鉄(II) - キレート剤、Ferene-Sの使用に依存する。このキレート剤は、フェロジンとバソジスルホンなどの化学的に類似したキレート剤に置き換えられますが、その鉄(II)の吸光係数に対応する感度の低下と37をキレートすることができます。それはFerene-Sまたはフェロジン37,45よりもクエン酸鉄錯体の存在下で見かけ自己触媒ferrireductionの率が高いにつながると思われるので、バソジスルホンを使用する場合にさらに注意が必要です。これは(II)キレートは、アッセイの感度を低下させる鉄の非アスコルビン酸依存外観としてアスコルビン酸放出アッセイの場合には適切な関心事である。

細胞内アスコルビン酸測定アッセイは接着細胞に対応しているが、細胞溶解前にこのような細胞の剥離は機械的な掻き取りではなく、トリプシン/ EDTAが行ってください。トリプシンは、プロテアーゼであるようにそれはおそらく、AO、タンパク質であるそのうちの後者とアスコルビン酸枯渇ステップで否定的に干渉することになる。さらに、EDTAはおそらくferene-S 37との競争の中で鉄をキレート化することによってFOC決定ステップに干渉します。このような薬剤は避けるべきである。最後に、アスコルビン酸放出アッセイを容易に懸濁細胞に適合させることができる。代わりに、その上に鉄(II)(ferene-S)を吸引除去3含有アッセイの終了時にキレートを、細胞が急速に細胞内アスコルビン酸定量アッセイと同様の遠心分離によって沈降されるべきである。上清の593 nmの吸光度が決定されるべきである。

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Disclosures

著者らは、開示することは何もありません。

Acknowledgements

私たちは、星状細胞培養の寛大な供給のための博士スティーブン·ロビンソンとMSハニアCzerwinska(モナッシュ大学)に感謝しています。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

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