Uma rápida e específica de microplaca de ensaio para a determinação de ascorbato intra-e extracelular em células cultivadas

Biology

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Summary

Ascorbato desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Descrevemos aqui um meio-débito, ensaio de microplacas específico e de baixo custo para a determinação de ambos ascorbato intra e extracelular em culturas de células.

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Lane, D. J., Lawen, A. A Rapid and Specific Microplate Assay for the Determination of Intra- and Extracellular Ascorbate in Cultured Cells. J. Vis. Exp. (86), e51322, doi:10.3791/51322 (2014).

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Abstract

A vitamina C (ácido ascórbico) desempenha várias funções importantes no metabolismo celular, muitos dos quais só vieram à luz nos últimos anos. Por exemplo, dentro do cérebro, o ácido ascórbico atua de forma neuroprotetor e neuromodulador que envolve ciclismo ascorbato entre astrócitos e neurônios vicinais - um relacionamento que parece ser crucial para ascorbato cérebro homeostase. Além disso, novas evidências sugerem fortemente que o ácido ascórbico tem um papel muito expandida na regulação do metabolismo do ferro celular e sistêmica do que é classicamente reconhecida. O crescente reconhecimento do papel fundamental do ascorbato na fisiologia celular e do organismo normal e desregulamentado exige uma gama de médio rendimento e de alta sensibilidade técnicas analíticas que podem ser executados sem a necessidade de equipamentos especializados altamente caro. Aqui nós fornecemos instruções explícitas para um meio-rendimento, ensaio de microplacas específico e relativamente barato para a determinação de boascorbato intra e extracelular th em cultura de células.

Introduction

A descoberta da natureza química do ácido ascórbico (vitamina C), e sua identificação como o "fator anti-escorbuto" há muito procurado, por Albert Szent-Györgyi e outros artigos publicados em 1928-1934 1 foram acontecimentos marcantes na história de bioquímica. De fato, essas descobertas contribuíram para Szent-Györgyi sendo agraciado com o Prêmio Nobel de Fisiologia ou Medicina em 1937. A suíte cada vez maior de papéis para ascorbato em fisiologia animal e vegetal, bem como a saúde humana, continuam a ser os temas de científico ativo investigação e controvérsia.

L-ascorbato é um redutor fisiológico e abundante da enzima do cofactor em sistemas de mamíferos, e contribui para numerosas reacções enzimáticas bem definida envolvendo a hidroxilação do colagénio, carnitina e norepinefrina biossíntese, o metabolismo da tirosina e hormona peptídica amidação 2. Curiosamente, evide montagemdno sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na estimulação de outras dioxigenases dependentes de ferro, tais como os de prolilo e asparaginilo hidroxilases envolvidos na hidroxilação e direccionamento dos factores de hipoxia-inducible (HIFs) 1α e 2α 3. Um relatório recente sugere que o ácido ascórbico desempenha um papel na maturação de células T através da cromatina que afecta a sua actividade através de desmetilação para estimular as hidroxilases nucleares, proteínas de domínio (JmjC) Jumonji C; o último dos quais parecem exigir ascorbato para a atividade completa 4. Com efeito, a estimulação de tais enzimas por ascorbato parece ocorrer através de um mecanismo semelhante ao da estimulação por ascorbato de HIF e colagénio hidroxilases. Entre outros efeitos clássicos, ascorbato contribui significativamente para antioxidação celular como uma quebra de cadeia de captador de radicais solúveis em água e 5 para a reciclagem de membrana plasmática α-tocoferol (vitamina E), através da redução da α-tocopheroxyl radical 6, which é importante na proteção contra a peroxidação lipídica da membrana 7. É importante notar, embora a maioria dos mamíferos é capaz de síntese hepática de novo de ascorbato de D-glicose, primatas superiores, cobaias e alguns morcegos dependem de fontes dietéticas de vitamina 8. Isto é devido à inactivação do gene GULO, os ortólogos de que em mamíferos não afectadas codificam a enzima, γ-gulono-lactona oxidase 9-13. Esta enzima é necessária para a reacção final na biossíntese de ascorbato de glicose 13.

Após a absorção mediada por transportador a partir do lúmen intestinal em seres humanos, o ácido ascórbico é distribuída por todo o corpo, o sistema circulatório. A vitamina é normalmente encontrado em sua forma reduzida em milimolares concentrações intracelular (com a notável exceção dos eritrócitos em que as concentrações são normalmente semelhantes aos da concentração plasmática vigente), e em conc micromolarentrations (por exemplo, 50-200 uM), na maioria dos fluidos extracelulares 14,15.

Em condições fisiológicas, ascorbato normalmente sofre uma oxidação reversível de um elétron para o radical livre ascorbil (AFR, também conhecido como monodehydroascorbate ou semidehydroascorbate). Enquanto o AFR é relativamente estável radical 16, na ausência da sua rápida redução enzimática de um electrão de volta para o ácido ascórbico, dois AFRs pode promover dismutar para um ascorbato e um desidroascorbato (DHA) 9,13,17. Dentro do interior da célula, o produto de oxidação de dois electrões do ascorbato, DHA, pode ser rapidamente reduzida para trás pela glutationa-ascorbato e NAD (P) H-enzimática dependente e as reacções não-enzimáticas 13.

Enquanto ele é classicamente aceito que apenas papel significativo do ascorbato no metabolismo do ferro é estimular a absorção dietética de ferro não-heme 18, nós e outros forneceram evidências strongly sugerindo que o ácido ascórbico desempenha um papel muito expandida no metabolismo deste metal. Em primeiro lugar, o ácido ascórbico que é liberado por células-ascorbato repleto parece desempenhar um papel importante na modulação da absorção de ferro não ligado à transferrina por células 19,20, e evidência muito recente indica que o ácido ascórbico também modula a absorção de ferro ligado à transferrina por células 21, o último dos quais corresponde a um grande fisiológico rota ferro-uptake 22.

Ascorbato é essencial para a função normal do sistema nervoso central em mamíferos 23,24. Juntamente com o córtex supra-renal, glândula pituitária, do timo, da retina e do corpo lúteo, o cérebro contém altas concentrações de ascorbato em relação a outros tecidos do corpo 23,25-27. Além disso, a exposição de ambos os astrócitos 28,29 e células neuronais semelhante 30 ao glutamato é conhecido por provocar a libertação de ascorbato no espaço extracelular, onde a ascorbate é pensado para ajudar a proteger os neurônios contra a disfunção neuronal induzida pelo glutamato 31. Embora o mecanismo exato de glutamato induzida por liberação ascorbato de astrócitos é desconhecida, que recentemente forneceu evidências indicando o envolvimento de células inchaço causado pela captação de glutamato pela glutamato astrócitos e transportador de aspartato (GLAST, também conhecido transportador isoforma aminoácido excitatório 1 [EAAT1 ] em humanos) e conseqüente ativação de osmólito e ânions canais sensíveis ao volume (VSOACs) que são permeáveis ​​a pequenos ânions orgânicos, tais como ácido ascórbico 32. As identidades moleculares das condutas de membrana plasmática envolvidas na formação VSOAC continuam a ser identificadas 33,34.

Embora muitos ensaios foram desenvolvidos para a determinação de ácido ascórbico em amostras biológicas, que incluem espectrofotométricos, fluorométricos e ensaios cromatográficos 35,36, existe uma grande variabilidade em especificidade, sensibilidade, interference por contaminantes químicos, faixa linear eficaz e estabilidade do analito endpoint. Além disso, outros factores importantes que influenciam a escolha do ensaio são a rapidez, a facilidade de utilização e acesso a equipamento relativamente especializadas tais como a cromatografia líquida de alto desempenho aparelho (HPLC).

Aqui apresenta-se um ensaio de microplaca colorimétrico simples e altamente específico para a determinação de ácido ascórbico intracelular em células de cultura, assim como um ensaio separado para a determinação de ascorbato-efluxo a partir de células cultivadas. O último ensaio visa contornar o problema da subestimação da liberação ascorbato a partir de células devido ao rápido recaptação de ascorbato liberado pelos transportadores dependentes de ascorbato de sódio (SVCTs). Embora ambos os métodos têm aparecido em algumas de nossas publicações anteriores 19,20,32,37,38, este manuscrito fornece um conjunto explícito de instruções e orientações para a sua execução eficaz.

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Protocol

1. Determinar ascorbato intracelular em células cultivadas

  1. Cultura de células e colheita
    1. Grow suspensão (por exemplo, eritroleucemia humana, K562) ou células aderentes (por exemplo, astrócitos primários) usando procedimentos padrão de cultura 19-21,32,38. Nota: para garantir células contêm ascorbato, carregar células cultivadas com ascorbato quer como ascorbato ou DHA 33,39.
  2. Criar um extrato celular contendo ascorbato
    1. Incubar de um número adequado de solução salina tamponada com fosfato de suspensão (PBS), lavou-se as células aderentes ou com 450 ul de células gelada permeabilização buffer [CEC; 0,1% (w / v) de saponina em PBS; 4 ° C]. Nota: determinar o número de células necessárias para se obter um valor de absorção dentro do intervalo linear do ensaio (ver abaixo) empiricamente pelo utilizador final. Nota: extratos de tecidos também pode ser usada (veja a discussão para mais detalhes).
    2. Agitate células em gelo durante 10 minutos para garantir lise celular completa.
    3. Criar um extracto intracelular contendo ascorbato clarificados removendo os restos celulares por centrifugação do ligado em bruto a 16000 × g durante 5 minutos numa microcentrífuga refrigerado (4 ° C).
    4. Cuidadosamente remover 4 x alíquotas de 100 ul de cada amostra e adicionar a uma sequência horizontal de poços numa placa de 96 poços de fundo plano que contém ou 25 ul / poço de PBS ("-AO") ou apenas 25 ul / poço de 45,5 L / ml de solução de L-ascorbato-oxidase (AO) em PBS ("+ AO"). Nota: este deve ser feita em paralelo com a preparação dos padrões (ver abaixo).
  3. Ascorbato padrão da curva de construção (deve ser construído de novo para cada ensaio)
    1. Prepara-se uma solução estoque de ácido ascórbico a 10 mM em PBS gelado. Nota: Verifique se a concentração de ácido ascórbico por espectrofotometria usando uma cuvete de quartzo com um 1cm de percurso a 265 nm (coeficiente de extinção = 14,5 mM -1 cm -1) 40.
    2. Preparar-se cuidadosamente uma série de padrões de ascorbato entre 0 e 20 uM.
    3. Em paralelo com a etapa 1.2.4, remover cuidadosamente 4 × alíquotas de 100 ul de cada padrão e adicionar a uma sequência horizontal de poços numa placa de 96 poços de fundo plano, que contém 25 ul / poço de PBS ("-AO") ou um 45,5 solução estoque U / ml de AO em PBS ("+ AO"). Nota: 100 ul dos padrões de ascorbato irão conter 0-2 nmol de ascorbato. Por favor, note que o propósito do AO é para controlar a contribuição de redutores não-ascorbato de ferricianeto de redução.
  4. Determine ascorbato intracelular - Etapa 1: remover seletivamente ascorbato e quantitativamente oxidar ascorbato com ferricianeto
    1. Orbitalmente misturar a placa de 96 poços a 550 rpm à temperatura ambiente durante 5 min no escuro, cobrindo a placa em folha de alumínio. Nota: Tseu passo deve oxidar todos ascorbato no "+ AO" poços DHA. Os poços "-ão" não devem ser afetados.
    2. Adicionar 50 mL de ferricianeto de potássio 3,5 mM (aqui referidos como "ferricianeto") em PBS em todos os poços. O final [ferricianeto] = 1 mM. Nota: Utilize um multipipettor.
    3. Orbitalmente misturar a placa a 550 rpm à temperatura ambiente durante mais 5 min no escuro. Nota: Esta etapa deve resultar na redução de ferricianeto de ferrocianeto de ascorbato numa razão estequiométrica de 2 moléculas de ferricianeto reduzidas por uma molécula de ácido ascórbico oxidado.
    4. Imediatamente adicionar 25 ul de uma solução recentemente construído contendo 50% (v / v) de ácido acético e 30% (w / v) de ácido tricloroacético (TCA). Nota: Utilize um multipipettor.
  5. Determinar ascorbato intracelular - Passo 2: quantificar a quantidade de ferrocianeto formado 37
    1. Adicione 100 ml de solução de ferrocianeto de 37 a determinação each bem. Nota: A solução de trabalho deve ser feita imediatamente antes da utilização: 2 ml de 3 M de Na-acetato (pH 6,0); 0,5 ml de ácido acético glacial (~ 17,4 M de ácido acético); 2 ml de ácido cítrico 0,2 M; 2 ml de 3,3 mM de FeCl3 em ácido acético 0,1 M; 1 ml de 30 mM Ferene-S. O volume final da solução de trabalho deve ser de 7,5 ml.
    2. Orbitalmente misturar a placa no escuro a 550 rpm durante 30 min à temperatura ambiente.
    3. Ler os valores de absorvância dos poços a 593 nm (isto é, o máximo de absorção do Fe (II) (Ferene-S) 3 complexo).
    4. Calcule a quantidade de ácido ascórbico intracelular como nmoles ascorbato por milhão de células, inicialmente subtraindo os valores A 593 nm para poços a '+ AO' dos correspondentes - poços 'AO' para cada amostra e, em seguida, interpolação na curva padrão ascorbato (veja o passo 1.3 ). Ao construir a curva padrão, traçar essa "diferença de valor" para cada padrão contra a quantidade de ascorbcomeu por poço.

2. Determinação do ascorbato-efluxo de células cultivadas

  1. Cultura de células e colheita
    1. Crescer suspensão ou células aderentes como acima (veja o passo 1.1). Nota: realizar o ensaio a seguir em um formato de plataforma 24 poços com uma suspensão de células aderentes e para obter os melhores resultados.
    2. Ressuspender as células em suspensão, as células aderentes ou de sobreposição, com 400 ul de solução salina tamponada com HEPES pré-aquecido, com ou sem cálcio e magnésio, e que contém 5 mM de D-glicose (HBS / D, pH 7,3, 37 ° C) nos poços de uma placa de 24 poços. Adicionar o mesmo volume de HBS / D para poços sem células especificadas em cada placa de 24 poços, para ser examinado. Nota: este último irá servir como controlos isentos de células para a reacção de referência (ver abaixo).

3. Determinar a quantidade de ácido ascórbico Lançamentos

  1. As seguintes soluções de deve ser preparado com antecedência: 120U / ml AO em HBS / D (preparar fresco); 2,4 mM Ferene-S em HBS / D; 120 pM FeCl3 e 600 uM de Na-citrato em HBS / D (preparar imediatamente soluções de estoque mais concentrados).
  2. Para iniciar a reação ferrireduction (volume final por poço deve ser de 600 mL), adicionar os seguintes volumes de reagentes aos poços individuais já contendo 400 mL de HBS / D:
    1. Adicionar 50 ul de AO (120 U / ml) ou HBS / D para emparelhado poços em triplicado. A concentração final AO deve ser de 10 U / ml. Nota: Etiqueta emparelhado poços como "- AO" e "+ AO".
    2. Misturar as placas com mistura suave orbital durante 5 min a 37 ° C.
    3. Adicionar 50 ul de 2,4 mM Ferene-S para todos os poços. A concentração final Ferene-S deve ser de 200 uM. Misturar as placas como acima durante 5 min a 37 ° C.
    4. Adicionar 50 ul de 120 uM recentemente preparada de citrato férrico. A concentração de citrato de ferro final e deve ser de 10 uM de ferro e citrato a 50 uM. Misture bem.
    5. Em três poços de controlo triplicadas, aspirar o meio sobrejacente e adicionar 600 mL HBS / D contendo 0,1% de saponina. Nota: Estes irão servir como "100% de células-lise" controlos de lactato desidrogenase (LDH), ensaio de libertação para ser conduzido em paralelo (ver abaixo).
    6. Incubar durante 60 min no escuro a 37 ° C.
    7. No final do ensaio de ascorbato-efluxo, aspirar-se rapidamente 500 mL de cada poço e adiciona ao apropriadamente marcada poços de uma placa de 24 poços. Nota: para as células em suspensão, inicialmente remover as células por centrifugação a 4 ° C.
    8. Adicionar 300 mL alíquotas do sobrenadante para uma placa de 96 poços e, em seguida, ler a 593 nm.

    4. Determinação de ascorbato Extracelular

    1. Leia os valores de absorbância dos poços a 593 nm.
    2. Calcula-se a quantidade de ácido ascórbico extracelular como nmoles de ascorbato por mg de proteína (ou por milhão de células) tal como descrito para a determinação de ácido ascórbico intracelularno Passo 1.5.4. Nota: o utilizador final deve optimizar as condições de forma que a libertação de ascorbato não é limitada por ascorbato intracelular.

    5. Determinação da LDH Lançamento

    1. Com os restantes 200 mL de solução extracelular a partir de cada amostra de realizar um ensaio de libertação de LDH 32,41 para determinar a extensão da lise celular. Nota: calcular como% da LDH releasable total. Determinar LDH libertável a partir das amostras que foram tratadas com 0,1% de saponina.

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Representative Results

Determinação de ascorbato intracelular em células cultivadas de suspensão

No primeiro ensaio (Figura 1), o ácido ascórbico intracelular é determinada, na sequência específicas de ascorbato (isto é, AO-sensível) redução de ferricianeto de ferrocianeto, utilizando a determinação altamente sensível do ferrocianeto de um processo publicado previamente 37. A detecção de ascorbato é baseado na quelação colorimétrico de ferro ferroso que é gerado pela redução dependente de ascorbato de ferricianeto de ferrocianeto, seguido pela redução do ferro para o ferro ferroso por ferrocianeto. Como as concentrações suprafisiológicas de alguns íons metálicos bivalentes (por exemplo, Cu 2 +, Co 2 + e Zn 2 +) podem interferir, presumivelmente por competir com o ferro ferroso para quelação por Ferene-S, as precauções apropriadas devem ser tomadas sob tais condições 37.

Figura2 mostra uma curva padrão típica para um conjunto de padrões de ascorbato 0-20 uM (ou 0-2 ascorbato nmol por poço da placa de 96 poços; ver passo 6.5 do "Protocolo".). Embora não esteja representado nesta figura, a linearidade é mantida até 8 ascorbato nmol por cavidade (isto é, uma rede de 593 nm, uma de ~ 1,6), o que corresponde a uma concentração de amostra de ascorbato de ~ 80 uM. O ensaio pode ser utilizado com êxito para detectar níveis de ascorbato abaixo de 0,25 nmol de ascorbato por poço (2,5 fiM de concentração de ascorbato de amostra).

Células K562 acumular rapidamente ascorbato intracelular de DHA extracelular, mas não ascorbato (ver Figura 3; reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2008 19). Nesta experiência representativa, as células K562 PBS-lavados (4 x 10 6 células / ml) foram incubadas em PBS com 500 | iM de qualquer ascorbato (Asc), o DHA, DHA + 50 uM citocalasina B (DHA + CB), Asc + 5 mM de ferricianeto (Asc / FIC) ou Asc + 50 U / ml de AO (Asc / AO) durante 30 min a 37 ° C. Ascorbato intracelular foi determinado como descrito no "protocolo".

DHA absorção pelas células K562 ocorre por transportador facilitador glicose (GLUT) mediada transporte (ver Figura 4; reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2009 42). Para avaliar o envolvimento de GLUTs em DHA absorção nesta experiência representativa, as células K562 foram incubadas com concentrações crescentes de citocalasina B (CB) ou dihidrocitocalasina B (H 2 CB) dissolvido em MBS contendo etanol a 0,5% durante 15 min a 37 ° C antes de incubação com 400 uM de DHA durante 30 min a 37 ° C no mesmo meio (Fig. 4A). As células foram então lavadas três vezes em 100 volumes do MBS geladas e sua ascorbato intracelular determinada como descrito na secção "protocolo". É importante notar, enquanto ambos CB e H 2 CB inibir processos de motilidade em micromolarconcentrações (1-100 uM), apenas CB, que difere de H 2 OC-se pela presença de uma única ligação dupla, inibe o transporte dependente de GLUT em concentrações micromolares baixas (1-10 uM) 43. Portanto, como a captação de DHA foi inibido por CB com uma IC 50 <2,5 uM, mas não foi inibida por H 2 CB, DHA absorção provavelmente ocorre por transporte mediado por GLUT 38. Alternativamente, na Figura 4B, as células lavadas foram expostos a concentrações crescentes de GLUT-transportáveis, mas não metabolizável analógico glicose 3 - O-metil-D-glicose (3-OMG) ou o não-GLUT transportável estereoisómero glicose L - glicose, antes da incubação com o DHA como no painel A. Mais uma vez, os resultados indicam o envolvimento de GLUT na importação de DHA como a inibição da acumulação intracelular de ascorbato ocorre apenas na presença do análogo de glucose GLUT-transportáveis.

Determinação de ascorbato-efluxo de células aderentes

No segundo ensaio, a taxa de efluxo de ascorbato-a partir de células cultivadas pode ser determinada. Este ensaio específico é importante, pois a liberação de ácido ascórbico a partir de células parece ser crucial para a captação celular regulado-ascorbato de ferro não ligado à transferrina por células 19,20. A absorção de ferro não ligado à transferrina é considerado relevante para a fisiopatologia dos transtornos de ferro-sobrecarga, como as hemochromatoses 22, bem como a astrócitos-neurônios troca de ferro e homeostase no cérebro de mamíferos 22. De facto, demonstramos recentemente que o principal neurotransmissor excitatório, L-glutamato, desencadeia a libertação de ácido ascórbico a partir de astrócitos de uma maneira que depende da absorção de L-glutamato de GLAST e subsequente expansão celular, que desencadeia a libertação de ascorbato por VSOACs putativos 32. Em analogia, ascorbato release de astrócitos carregados-ascorbato pode ser estimulada pelo ácido excitatório amino, L-aspartato, mas não o aminoácido L-glutamina não-excitatória. Este efeito é ilustrado na Figura 5 (reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2012 32), que mostra as curvas de dose-resposta para a estimulação de ascorbato (AA) libertação por aspartato (círculos fechados) e glutamina (círculos abertos) a partir de culturas primárias de astrócitos de rato carregado-ascorbato.

É importante discutir como este ensaio de ascorbato-efluxo difere do ensaio previa a determinação de ácido ascórbico intracelular. A principal diferença reside no facto de que o nível de ácido ascórbico que permanece em solução não é determinada por uma reacção química realizada no final de um dado ponto de tempo, como é o caso para o método de determinação de ácido ascórbico intracelular. Em vez disso, uma "assinatura redutora" é acumuladadurante o período em que o ácido ascórbico é libertado a partir de células. Esta assinatura redutiva é capturado sob a forma da redução dependente de ascorbato de citrato férrico extracelular seguindo-se a rápida quelação do ferro ferroso como um grande extracelular e membrana impermeabilizante [Fe (II) (Ferene-S) 3] 4 - quelato . Ferene-S pode ser considerado de forma semelhante à membrana impermeabilizante ao longo do curso curto tempo do ensaio. Os níveis do complexo cromogénico pode, então, ser determinado como uma medida de ponto final. Como apenas os níveis AO-sensíveis desta quelato são determinados, o ensaio proporciona um alto grau de especificidade para a determinação de L-ascorbato extracelular.

Figura 1
Figura 1. Fluxograma mostrando as principais etapas do protocolo paraa determinação de ácido ascórbico intracelular.

Figura 2
Figura 2 Uma curva padrão típica para um conjunto de padrões de ascorbato de 0-20 uM..; Barras de erro (ou 0-2 ascorbato nmol por poço da placa de 96 poços. Ver passo 6.5 do "Protocolo") não são mostrados como que estão dentro da faixa ocupada pelos símbolos.

Figura 3
Figura 3. K562 células acumulam rapidamente ascorbato intracelular de DHA extracelular, mas as células K562 não ascorbato. PBS-lavados (4 x 10 6 células / ml) foram incubadas em PBS com 500 uM of ou ascorbato (Asc), DHA, DHA + 50 mM citocalasina B (DHA + CB), Asc + 5 ferricianeto mM (Asc / FIC) ou Asc + 50 U / ml AO (Asc / AO) por 30 min a 37 ° C. Ascorbato intracelular foi determinado como descrito no "protocolo". Os resultados apresentados são médias de três experiências individuais (+ DP). * A concentração intracelular de ascorbato foi estimada utilizando um espaço água intracelular pré-determinado para as células K562 (ou seja ~ 1,6 μl/106 células) 19,20. Esta figura foi reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2008 19.

Figura 4
Figura 4. DHA absorção pelas células K562 ocorre pelo transportador de glicose facilitadora (GLUT) transporte mediado. Células K562 que haviam sido cultivadas a 6-8 x 10 6 células / ml em meio RPMI + 10% (v / v) de soro fetal de bovino a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de ar foram inicialmente lavadas três vezes com MBS. As células lavadas foram então expostos a concentrações crescentes de citocalasina B (CB; Sigma) ou dihidrocitocalasina B (H 2 CB) dissolvido em soro fisiológico tamponado com Mops (MBS; NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, 15 mM de MOPS-Na +, pH 7,3 ) contendo 0,5% de etanol antes da incubação com 400 uM de DHA de 30 min a 37 ° C (A). As células foram então lavadas três vezes em 100 volumes do MBS frio e sua ascorbato intracelular determinada como descrito na secção "protocolo". Como DHA captação foi inibido pelo CB, mas não H 2 CB, DHA absorção ocorre por transporte mediado por GLUT. Em alternativa, em (B), as células lavadas foram expostos a concentrações crescentes de GLUT-transportáveis, mas não metabolizável analógico glicose 3 - O-metil-D-glicose (3-OMG) ou a glucose-estereoisómero não GLUT transportável (A). Mais uma vez os resultados indicam envolvimento GLUT em DHA captação. Esta figura foi reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2008 42.

Figura 5
Libertação Figura 5. Ascorbato de astrócitos carregados-ascorbato é estimulada por o aminoácido L-aspartato excitatório, mas não o aminoácido L-glutamina não-excitatória. Esta figura mostra curvas de dose-resposta para a estimulação da libertação de ascorbato (AA) por aspartato (círculos fechados) e glutamina (círculos abertos) a partir de culturas primárias de astrócitos de rato carregadas com ascorbato. Os dados mostrados são médias (± DP) de três experiências. P <0,001 vsa condição "basal". Esta figura foi reproduzido com permissão de Lane e Lawen 2012 32.

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Discussion

Neste artigo, apresentamos dois ensaios de microplacas colorimétricos rápidos, específicos e relativamente sensíveis para a determinação de ácido ascórbico derivado dos compartimentos intra e extracelulares em células em cultura. Os ensaios podem ser concluída com acesso a equipamento de laboratório e reagentes. O reagente apenas moderadamente dispendioso necessário para o ensaio é de AO, que é essencial, uma vez que confere um elevado grau de especificidade para o analito L-ascorbato. Os ensaios são bem adequados para tanto células em suspensão (por exemplo, K562) ou células aderentes (por exemplo, HepG2 ou astrócitos roedores primários), e tem sido empregada com sucesso em publicações anteriores utilizar essas células 19,20,32,37,38. O uso de outros agentes oxidantes (por exemplo, o ácido ascórbico tempol) no lugar de AO deve ser evitado, pois não são suficientemente específicos para L-ascorbato. Além disso, o uso de compostos tais comoTempol no ensaio de liberação de ascorbato será confundido pela capacidade de Tempol de atravessar membranas celulares e oxidar ascorbato intracelular 44. AO é, essencialmente, à membrana impermeant ao longo dos cursos de tempo utilizados.

Realizamos comparações directas dos resultados obtidos com o ensaio de ascorbato colorimétrico descrito acima e a determinação ascorbato fluorométrico de Vislisel e colegas 36. Observou-se que ambos os ensaios deram resultados idênticos para o ensaio de determinação ascorbato intracelular (dados não mostrados). Curiosamente, o ensaio de libertação descrito acima, deu o ácido ascórbico valores significativamente mais altos para a taxa aparente de ascorbato de efluxo com o ensaio de ponto final fluorométrico. Isto sugere que o ensaio de ascorbato-efluxo aqui descrito permite a determinação da aparente "ascorbato-efluxo" que não é tão facilmente confundidos pela probabilidade de ascorbato de re-absorção pelas células; um processo que envolve provavelmente plAsma SVCTs membrana. Tal recaptação tenderia a causar subestimação dos níveis reais de ascorbato que foram lançados durante um determinado período, se uma medida endpoint ascorbato foi tirada. Deve notar-se que, se as amostras de tecido (por exemplo, músculo, pulmão ou cerebral) é para ser usado em vez de células de cultura para o ensaio de determinação ascorbato intracelular, seguida de um homogeneizado de tecido devem ser construídos utilizando-se CEC gelada e algum tipo de ruptura mecânica ( por exemplo, a homogeneização dounce, sonda de ponta ultra-som, imprensa francesa, etc.). Restos celulares devem ser removidos por centrifugação e que o usuário deve considerar a eventual necessidade de desproteinização da amostra e / ou adição de inibidores de protease, antes de prosseguir com a Etapa 1.2.4.

Também relataram que as baixas concentrações anteriormente micromolares de citocalasina B (<10 uM) não inibiu a taxa aparente de ascorbato-efluxo que foram determinadas pelo ensaio de 32 19, 20,38.

Há vários passos críticos nestes protocolos. Em primeiro lugar, os ensaios aqui descritos dependem criticamente a capacidade de AO de forma seletiva e rapidamente remover o ácido ascórbico em amostras pareadas. Se a actividade específica da preparação de AO é marcadamente inferior à actividade nominal e assumida, é possível que nem todo o ácido ascórbico na AO contendo splos vai ser removido. Isso pode levar a uma subestimação da quantidade de ácido ascórbico nas amostras desconhecidas se usando o "método direto" para calcular a quantidade de ácido ascórbico presente. No entanto, se se usa o "método padrão da curva", o que é recomendado, preparações de AO de baixa atividade irá apenas levar a uma perda de ensaio-sensibilidade. Encontraram-se que os bons resultados obtidos são consistentes com a utilização de preparações de AO construídos por dissolução de 1,000 L de AO em 1 ml de PBS ou MBS, que é, então, dividido em alíquotas de 100 ul que são armazenadas a -80 ° C durante não mais do que um mês. Além disso, como AO é uma proteína que pode ser degradado proteoliticamente por lisados ​​de células, os inibidores da protease podem ser adicionados à lisados ​​de células antes da adição dos lisados ​​nas cavidades contendo AO. Esta pode ser uma modificação útil considerar quando se utiliza células ou tecidos lisados ​​que são ricos em atividade protease.

Além disso, a sensibilidade dos ensaios descritos above depende em grande medida da utilização do bidentado cromogénico Fe (II)-quelante, Ferene-S. Este agente quelante pode ser substituído por quelantes quimicamente semelhantes, tais como ferrozina e batofenantrolina dissulfonato, mas com uma diminuição na sensibilidade correspondente ao coeficiente de extinção da sua Fe (II) a quelação 37. Além disso, cuidados devem ser tomados ao usar batofenantrolina dissulfonato, como parece levar a taxas mais elevadas de ferrireduction autocatalítico aparente na presença de citrato de ferro complexos do que Ferene-S ou Ferrozine 37,45. Esta é uma preocupação relevante no caso do ensaio de libertação de ascorbato como a aparência não dependente de ascorbato de Fe (II)-quelato irá diminuir a sensibilidade do ensaio.

Enquanto o ensaio de ascorbato-determinação intracelular é compatível com as células aderentes, descolamento de tais células, antes de lise celular deve ser realizada por raspagem mecânica, em vez de tripsina / EDTA. Como tripsina é uma proteaseisto provavelmente interferir negativamente com a etapa ascorbato-depleção a OA, o último dos quais é uma proteína. Além disso, o EDTA provavelmente vai interferir com a FOC determinação passo por quelantes de ferro em concorrência com Ferene-S 37. Tais agentes devem ser evitados. Finalmente, o ensaio de libertação de ácido ascórbico podia ser facilmente adaptado para as células em suspensão. Em vez de aspirar para fora da sobreposição de Fe (II) (Ferene-S) 3-quelato contendo, no final do ensaio, as células devem ser rapidamente sedimentadas por centrifugação, tal como para o ensaio de ascorbato-determinação intracelular. A absorvância a 593 nm do sobrenadante deve então ser determinada.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgements

Somos gratos ao Dr. Stephen Robinson e Ms Hania Czerwinska (Universidade Monash) para a generosa oferta de culturas de astrócitos.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nunc 96-well flat-bottom plates Thermo 269620 Any flat-bottom 96-well plate can be used
Refrigerated benchtop microcentrifuge Eppendorf 5415D A non-refrigerated microcentrifuge that has been equilibrated to temperature in a cold room can also be used
Refrigerated bench-top centrifuge Eppendorf 5810R Swing-bucket
Bio-Rad Benchmark Plus Microplate Spectrophotometer Bio-Rad Any microplate spectrophotometer capable of reading at 593 nm can be used and is recommended. If a filter-based plate reader is used, choose the closest wavelength possible and use the standard-curve method.
Ependorf MixMate (microplate orbital mixer) Eppendorf This is a very versatile and reliable microplate mixer and works very well for these assays
General-purpose buffers
Phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4
MOPS-buffered saline (MBS); 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 15 mM MOPS-Na+, pH 7.3
MBS + 5 mM D-glucose (MBS/D)
HEPES-buffered saline + 5 mM D-glucose (HBS/D); 137 mM NaCl, 5.2 mM KCl, 1.8 mM CaCl2•2 H2O, 0.8 mM MgSO4•7 H2O, 5 mM D-glucose, 20 mM HEPES-Na+, pH 7.3)
Cell permeabilisation buffer (CPB; 0.1% saponin in PBS)
General chemicals
L-ascorbic acid or sodium L-ascorbate Sigma-Aldrich Highest purity preparations should be obtained
Dehydro-L-ascorbic acid (DHA) dimer Sigma-Aldrich 30790 Aqueous solutions theoretically yield 2 moles of DHA monomer per mole of DHA dimer
Cytochalasin B Sigma-Aldrich C6762 Stock solutions prepared in DMSO or ethanol
Ascorbate oxidase (AO) Sigma-Aldrich A0157 Stock solutions (120 U/ml) can be prepared in PBS or MBS and then frozen in aliquots
Potassium ferricyanide (FIC) Sigma-Aldrich 455989 Trihydrate
Ferene-S (3-(2-Pyridyl)-5,6-di(2-furyl)-1,2,4-triazine-5′,5′′-disulfonic acid disodium salt) Sigma-Aldrich 92940
Sodium L-glutamate Sigma-Aldrich
L-glutamine Sigma-Aldrich
Saponin Sigma-Aldrich 47036 Prepare a 0.1% stock solution
Stock solutions for intracellular ascorbate determination assay
3 M sodium acetate (pH 6.0)
Glacial acetic acid
0.2 M citric acid
3.3 mM FeCl3 in 0.1 M acetic acid
30 mM ferene-S
50% (v/v) acetic acid + 30% (w/v) trichloroacetic acid (TCA)
Stock solutions for ascorbate-efflux assay
AO (120 U/ml)
2.4 mM ferene-S
0.12 mM FeCl3 in 0.6 mM sodium-citrate

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